孫俊艷，何成濤，劉海波，陳躍

(1.淮安市中心血站檢驗(yàn)科，江蘇淮安 223001；2.南京紅十字血液中心研究室，南京 210003)

乙肝表面抗原(HBsAg)是篩查乙型肝炎最重要的血清學(xué)指標(biāo)，標(biāo)本質(zhì)量保證是檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性的重要分析前因素[1]，國(guó)內(nèi)有學(xué)者對(duì)實(shí)驗(yàn)室分析中儀器產(chǎn)生影響因素、明顯溶血標(biāo)本或送檢時(shí)間進(jìn)行研究，指出標(biāo)本溶血和室溫保存4 h以上可影響檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性[2-3]。但往往標(biāo)本被非規(guī)范處理后，標(biāo)本溶血、抗凝不充分等現(xiàn)象表現(xiàn)不明顯，使工作人員無(wú)法直觀判斷出標(biāo)本是否合格，且無(wú)法對(duì)檢測(cè)結(jié)果正確賦值。本研究擬通過(guò)設(shè)計(jì)5種模式，驗(yàn)證從標(biāo)本采集到檢測(cè)前各種因素對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響情況，旨在指導(dǎo)標(biāo)本的處理流程，最大限度的保證標(biāo)本質(zhì)量，消除標(biāo)本對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響。

1 材料與方法

1.1儀器與試劑 STAR 8CH全自動(dòng)酶免前處理系統(tǒng)、FAME24/20全自動(dòng)酶免后處理系統(tǒng)(煙臺(tái)奧斯邦生物研發(fā)公司)，DL-5M低速冷凍離心機(jī)、KH20自動(dòng)開(kāi)蓋離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器公司)，EDTA-K2抗凝管(江蘇康健醫(yī)療用品公司)，分離膠促凝管(江蘇康健醫(yī)療用品公司)。HBV酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒(北京萬(wàn)泰股份公司)，酶聯(lián)四項(xiàng)質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)血清(北京康徹思坦生物技術(shù)公司)。

1.2方法

1.2.1研究對(duì)象 收集2019年4月至11月于淮安市中心血站自愿無(wú)償獻(xiàn)血的300例獻(xiàn)血者的血液標(biāo)本。女性78例，男性222例，年齡(40±2)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：獻(xiàn)血前征詢、初篩、體檢均符合《獻(xiàn)血者健康檢查要求》2011版要求，均由熟練工作人員進(jìn)行采集，獻(xiàn)血者知曉本研究，自愿參與。排除標(biāo)準(zhǔn)：獻(xiàn)血前征詢、初篩、體檢不符合《獻(xiàn)血者健康檢查要求》2011版要求，不能參加獻(xiàn)血者；標(biāo)本采集量不足或標(biāo)本遭到污染時(shí)；標(biāo)本不能按計(jì)劃時(shí)間進(jìn)行檢測(cè)的；獻(xiàn)血者依從性差，無(wú)法完成本研究者。

1.2.2常規(guī)標(biāo)本處理步驟 要求同一工作人員采用EDTA-K2抗凝管采集每位獻(xiàn)血者2管血液，每管樣本量為4～5 mL，標(biāo)本無(wú)脂肪、無(wú)溶血現(xiàn)象，采集后臨時(shí)儲(chǔ)存環(huán)境為2～8 ℃。離心溫度為室溫(18～27 ℃)條件下進(jìn)行分離，離心半徑21 cm，3 000 r/min離心10 min，2管同時(shí)分別進(jìn)行20次檢測(cè)。

1.2.3分組模式 分別采取不同離心溫度、采集到離心不同時(shí)間間隔、不同離心和儲(chǔ)存順序、不同標(biāo)本管類型、不同儲(chǔ)存溫度5種不同模式進(jìn)行處理，每種方法采樣60人。5種模式中保證標(biāo)本只有設(shè)計(jì)的影響因素不同，其他操作處理方法與常規(guī)操作步驟完全相同。

1.2.3.1不同離心溫度(以CT表示) 2支標(biāo)本離心時(shí)分別采取室溫(18～27 ℃)和4 ℃離心，4 ℃離心使用低速冷凍離心機(jī)，離心半徑21.5 cm，3 000 r/min離心10 min，分別編為A、B組。

1.2.3.2采集到離心不同時(shí)間間隔 (以Ct表示) 從采集到標(biāo)本進(jìn)行離心處理的時(shí)間間隔為0 h和8 h的2支標(biāo)本管分別編為C、D組。

1.2.3.3不同離心和儲(chǔ)存順序 (以Tm表示) 將標(biāo)本管標(biāo)本離心后儲(chǔ)存和儲(chǔ)存后離心2種情況的2支標(biāo)本管分別編為E、F組，E組標(biāo)本采集后立即離心后儲(chǔ)存于2～8 ℃ 4 h，F(xiàn)組標(biāo)本采集后立即儲(chǔ)存于2～8 ℃，4 h后進(jìn)行離心。

1.2.3.4不同標(biāo)本管類型 (以At表示) 分別采用抗凝和促凝管采集的2支標(biāo)本管分別編為G、H組。

1.2.3.5不同儲(chǔ)存溫度 (以ST表示) 標(biāo)本采集后分別進(jìn)行室溫(18～27 ℃)和立即置于2～8 ℃儲(chǔ)存的2支標(biāo)本管分別編為I、J組，2種均在對(duì)應(yīng)溫度下儲(chǔ)存2 h以上，再進(jìn)行離心處理。

1.2.4計(jì)算公式 配對(duì)設(shè)計(jì)的標(biāo)準(zhǔn)偏差計(jì)算公式為：

注：n為樣本例數(shù),d為同一樣本兩組測(cè)量結(jié)果之差，dm為同一樣本兩組數(shù)據(jù)差值平均值。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，利用EXCEL 2007電子表格進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及復(fù)合標(biāo)準(zhǔn)差的計(jì)算。

2 結(jié)果

2.15種不同的因素對(duì)結(jié)果的影響 由表1可見(jiàn)，標(biāo)本采集后處理時(shí)離心溫度、標(biāo)本采集到離心時(shí)間間隔、儲(chǔ)存溫度3種模式中兩組處理方式之間的平均值之差分別為0.004 0、0.003 1、0.002 2，經(jīng)統(tǒng)計(jì)，對(duì)HBsAg檢測(cè)結(jié)果的影響差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。離心與儲(chǔ)存順序、標(biāo)本管類型2種模式中兩組處理方式之間的平均值之差分別為0.000 3、0.000 2、經(jīng)統(tǒng)計(jì)，對(duì)HBsAg檢測(cè)結(jié)果影響差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1 5種因素對(duì)HBsAg檢測(cè)結(jié)果影響

2.25種不同的因素的影響程度 據(jù)1.2.4中公式計(jì)算離心溫度、標(biāo)本采集到離心間隔、離心和儲(chǔ)存順序、標(biāo)本管類型、儲(chǔ)存溫度5種因素復(fù)合標(biāo)準(zhǔn)差，結(jié)果分別為0.005 5、0.004 5、0.002 6、0.002 0、0.004 9。影響程度由大到小依次為離心溫度、儲(chǔ)存溫度、標(biāo)本采集到離心間隔、離心和儲(chǔ)存順序、標(biāo)本管類型。

3 討論

影響實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性因素主要有人員、儀器、試劑、實(shí)驗(yàn)方法、標(biāo)本質(zhì)量等方面。自動(dòng)化測(cè)量?jī)x器的推廣和性能方面的持續(xù)改進(jìn)、儀器的定期校驗(yàn)及對(duì)室內(nèi)質(zhì)控的重視度增強(qiáng)均可有效控制分析中的各種影響因素。由于分析前的環(huán)節(jié)涉及較多，很多學(xué)者[4-5]認(rèn)為可以通過(guò)強(qiáng)化分析前的規(guī)范化加以控制，但工作人員責(zé)任心及操作的熟練度差異，使標(biāo)本的處理流程難以達(dá)到預(yù)期要求，這給分析前標(biāo)本質(zhì)量控制帶來(lái)很大難度，而實(shí)驗(yàn)室標(biāo)本接收普遍通過(guò)肉眼觀察判斷標(biāo)本合格性，這為檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性帶來(lái)一定的負(fù)面影響。

本研究顯示，標(biāo)本采集后處理時(shí)離心溫度、標(biāo)本采集到離心時(shí)間間隔、儲(chǔ)存溫度3種模式對(duì)HBsAg檢測(cè)結(jié)果具有很大影響。筆者分析原因認(rèn)為，常溫離心時(shí)隨著離心時(shí)間加長(zhǎng)，轉(zhuǎn)速增高，在離心機(jī)沒(méi)有溫度控制功能時(shí)，離心溫度會(huì)逐漸增高，細(xì)胞會(huì)發(fā)生破壞。如果全血標(biāo)本常溫儲(chǔ)存較長(zhǎng)時(shí)間，特別是環(huán)境溫度較高時(shí)，細(xì)胞同樣發(fā)生破壞，產(chǎn)生肉眼不可見(jiàn)的隱形溶血，釋放多種內(nèi)源性干擾物質(zhì)，干擾檢測(cè)結(jié)果。這與楊瑞鋒等[6]研究觀點(diǎn)相一致。另一方面全血標(biāo)本在不分離狀態(tài)下儲(chǔ)存8 h時(shí)，隨著細(xì)胞的死亡，釋放一些生物活性物質(zhì)或殘留細(xì)胞成分的干擾，均導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果假陽(yáng)性產(chǎn)生，這與趙鴻翔等[7]和譙興強(qiáng)等[8]的觀點(diǎn)相一致。

離心與儲(chǔ)存順序和標(biāo)本管類型模式對(duì)HBsAg檢測(cè)結(jié)果的影響無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，考慮到血漿與血清的主要區(qū)別是血清不含纖維蛋白原，血漿標(biāo)本留取時(shí)抗凝充分，纖維蛋白原沒(méi)有析出，未對(duì)檢測(cè)結(jié)果造成明顯影響。因此，在日常工作中可以替代使用。而離心與儲(chǔ)存順序設(shè)計(jì)時(shí)儲(chǔ)存溫度在2～8 ℃環(huán)境中4 h，低溫環(huán)境中標(biāo)本比較穩(wěn)定，在小于4 h的情況下溶血現(xiàn)象不明顯，未對(duì)檢測(cè)結(jié)果造成明顯影響。

綜上所述，確保HBsAg檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，不僅實(shí)驗(yàn)室需要對(duì)分析中的各種因素加以控制，還要規(guī)范分析前全血標(biāo)本的處理流程。雖然一些規(guī)范對(duì)標(biāo)本采集后處理有一定要求，但由于環(huán)節(jié)較多、經(jīng)手人員復(fù)雜等原因，對(duì)于規(guī)范的執(zhí)行落實(shí)情況不到位，從而對(duì)標(biāo)本質(zhì)量產(chǎn)生不可預(yù)估的影響。本研究用數(shù)據(jù)驗(yàn)證了標(biāo)本處理環(huán)節(jié)中關(guān)鍵控制點(diǎn)，結(jié)果提示：為保證檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性，全血標(biāo)本采集后應(yīng)立即使用低溫離心機(jī)進(jìn)行分離，否則應(yīng)立即放入2～8 ℃環(huán)境中保存，4 h內(nèi)持續(xù)保持該溫度并使用低溫離心機(jī)分離，如果標(biāo)本發(fā)生明顯溶血，應(yīng)重新留取標(biāo)本。