林佳輝，閆露露，解敏，王飛，李海波，陳怡博

(1.寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院，浙江寧波 315000；2.寧波市杭州灣醫(yī)院兒科，浙江寧波 315000；3.寧波市婦女兒童醫(yī)院 a.出生缺陷綜合防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，b.檢驗(yàn)科，浙江寧波315000)

支氣管哮喘(bronchial asthma，簡(jiǎn)稱哮喘)是一種遺傳和環(huán)境因素相互作用導(dǎo)致的多基因遺傳病[1]，臨床癥狀為喘息、咳嗽、胸悶、呼吸困難。目前全球約有3.34億人患有哮喘，且哮喘患病率持續(xù)上升[2]。研究估計(jì)，哮喘遺傳度約為50%～90%，且兒童患病率高于成人[3]。從基因組角度考慮，疾病易感基因是指在適宜環(huán)境刺激下能夠編碼遺傳性疾病或獲得疾病易感性的基因[4]。通過易感基因相關(guān)基因頻率和影響效應(yīng)的情況，可將遺傳疾病分為復(fù)雜遺傳性疾病和孟德爾遺傳病。常見的復(fù)雜疾病如高血壓、糖尿病等均具有易感基因。本文就兒童哮喘相關(guān)易感基因發(fā)現(xiàn)的研究方法、近年來發(fā)現(xiàn)的主要易感基因、易感位點(diǎn)間交互作用及環(huán)境因素等作一綜述，以期為兒童哮喘易感性的基因篩查提供依據(jù)。

1 可發(fā)現(xiàn)哮喘相關(guān)易感基因的技術(shù)

1.1通過定位克隆發(fā)現(xiàn)哮喘易感基因 定位克隆法識(shí)別哮喘易感基因主要依靠對(duì)哮喘家系進(jìn)行分析研究，該方法是選擇在人類的基因組遺傳圖譜中大量遺傳標(biāo)記，對(duì)家系成員進(jìn)行全基因組掃描，同時(shí)通過連鎖分析方法將哮喘的有關(guān)基因位點(diǎn)定位到所選染色體區(qū)域內(nèi)再進(jìn)行精確定位，從而最終識(shí)別出哮喘相關(guān)易感基因。這些基因位點(diǎn)的基因型是在多個(gè)哮喘個(gè)體的家庭成員中鑒定的，各成員具有相似臨床表現(xiàn)且共同遺傳標(biāo)記位點(diǎn)緊密連鎖的區(qū)域，在理想狀態(tài)下可鑒別相關(guān)基因或突變基因型。但定位克隆的染色體區(qū)域通常較大，也會(huì)因目標(biāo)易感基因的重組等情況而造成定位失敗。既往通過這種研究方法確定了8個(gè)哮喘易感基因：解整合素金屬蛋白酶33(a disintegrin and metalloprotease 33，ADAM33)、二肽基肽酶10(dipeptidyl peptidase 10，DPP10)、PHD 鋅指蛋白 11(PHD finger protein 11，PHF11)、哮喘相關(guān)G蛋白耦聯(lián)受體(protein related receptor for asthma,GPRAG)、人白細(xì)胞抗原-G(human leucocyte antigen-G，HLA-G)、細(xì)胞質(zhì)脆性X智力低下蛋白結(jié)合蛋白2(cytoplasmic FMR1-interacting protein 2，CYFIP2)、精氨酸/絲氨酸富集剪接因子8(splicing factor, arginine/serine-rich 8, SFRS8)和視蛋白基因 3(opsin 3，OPN3)[5-12]。其中ADAM33是第1個(gè)被發(fā)現(xiàn)的定位克隆的哮喘相關(guān)基因[13]，并證實(shí)其序列變異與哮喘發(fā)生有關(guān)，同時(shí)與支氣管高反應(yīng)性、早期肺功能、整個(gè)生命周期的肺功能下降以及慢性阻塞性肺疾病等相關(guān)。

1.2通過候選基因關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)哮喘易感基因 候選基因法是將有一定研究基礎(chǔ)且感興趣的基因作為候選基因，擇其中的多態(tài)性標(biāo)記，在哮喘病例組和對(duì)照組中比較多態(tài)性標(biāo)記的基因型相關(guān)頻率分布的差異，從而確定與疾病表型有關(guān)的基因。但這種研究方法只是在小的、低效能的隊(duì)列中進(jìn)行，因而也容易出現(xiàn)假陽性，許多結(jié)果不能在其他人群中重復(fù)。通過候選基因關(guān)聯(lián)分析，盡管能發(fā)現(xiàn)是否存在遺傳學(xué)的相關(guān)性，但也可能遺漏了能夠代表疾病病理生物學(xué)的真正原因。目前涉及哮喘病因?qū)W的候選基因研究有100多個(gè)[14]，其中只有不到10%的基因在超過10項(xiàng)研究中得到了重復(fù)。比較有研究前景的哮喘候選基因包括白細(xì)胞介素4(interleukin-4，IL-4)、白細(xì)胞介素13(interleukin-13，IL-13)、白介素4受體α鏈(interleukin 4 receptor alpha chain，IL-4RA)、β2腎上腺素能受體(beta2-adrenoreceptor，ADRB2)、高親和力IgE受體β亞基(beta subunit of the high affinity IgE receptor，F(xiàn)CER1B)、腫瘤壞死因子A(tumor necrosis factor A，TNFA)、表面抗原基因白細(xì)胞分化抗原14(cluster of differentiation 14，CD14)以及組織相容性基因HLA-DRB1和HLA-DQB1。

1.3通過定位克隆與候選基因關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)的價(jià)值性哮喘易感基因 Ober等[14]對(duì)上述兩種方法所發(fā)現(xiàn)的哮喘或變應(yīng)性疾病的易感基因進(jìn)行檢測(cè)，共分析118個(gè)有關(guān)基因，其認(rèn)為重復(fù)在6個(gè)及以上獨(dú)立樣本的25個(gè)基因是具有價(jià)值的易感基因[14]，包括：(1)重復(fù)>10個(gè)樣本的基因：IL-13、IL-4RA、IL4、ADRB2、ADAM33、CD14、HLA-DQB1、FCER1B、TNF、HLA-DRB1；(2)重復(fù)6～10個(gè)樣本的基因：CC16、TBXA2R、CCL5、TGFB1、NOS1、NOD1、GSTP1、STAT6、CTLA4、LTC4S、GSTM1、LTA、IL10、GRPA、SPINK5。

其研究還發(fā)現(xiàn)獨(dú)立樣本重復(fù)率最高的哮喘基因，主要包括IL-13、IL-4RA、IL4、ADRB2和FCER1等。其中IL-13、IL-4、ADRB2和FCER1B基因表達(dá)量的改變與IgE相關(guān)水平升高有關(guān)，而IgE介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)是過敏性哮喘的重要環(huán)節(jié)。關(guān)于IL-13基因報(bào)道最多的氫核氨酸多態(tài)性(SNP)為2044A>G，其降低了IL-13和受體結(jié)合間親和力，促使局部IL-13濃度增加，從而增強(qiáng)與受體結(jié)合后的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，引起嚴(yán)重哮喘。IL-4RA基因中E375A和Q551R 2個(gè)SNP位點(diǎn)與IgE水平升高、肥大細(xì)胞增多有關(guān)，造成嚴(yán)重的哮喘惡化及肺功能降低[15]。IL-13與IL-4RA對(duì)血漿總IgE水平具有明顯的協(xié)同影響，二者通過相同的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，促使B細(xì)胞向合成IgE的途徑轉(zhuǎn)換，從而增加哮喘易感性[16]。ADRB2位于B細(xì)胞上，可在變應(yīng)原進(jìn)入體內(nèi)后被刺激， 從而促使B細(xì)胞分泌IgE[17]。而FCER1中的組合部分β亞單位(FCER1B)在FCER1表達(dá)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中起到放大作用，促進(jìn)肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞活化，從而上調(diào)IgE介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。

1.4全基因組關(guān)聯(lián)研究(genome wide association study，GWAS)發(fā)現(xiàn)哮喘易感基因 伴隨人類基因組技術(shù)的發(fā)展，高通量基因分型平臺(tái)使研究成本持續(xù)降低，GWAS等關(guān)鍵分析方法的發(fā)展使得基因組掃描更加密集。其可對(duì)整個(gè)基因組中成千上萬的SNP進(jìn)行同步分析，并且這些SNP通常是由獨(dú)立的病例和對(duì)照樣本確定的。這種方法的突出優(yōu)點(diǎn)是在未知疾病的情況下可以檢測(cè)出致病基因的影響，發(fā)現(xiàn)與疾病相關(guān)的新的易感基因及通路[18]。GWAS研究方法是將研究對(duì)象的DNA在lllumina系列芯片上進(jìn)行基因分型，所發(fā)現(xiàn)的SNPs采用Plink系列軟件如(v1.07)進(jìn)行薈萃(meta)分析，然后采用EIGENSTRAT軟件對(duì)潛在群體分層進(jìn)行調(diào)查，并對(duì)頂級(jí)特征向量進(jìn)行Logistic回歸，得出OR值(odds ratio)和用于meta分析的標(biāo)準(zhǔn)誤差。但是此方法通常需要較大的樣本量及盡可能多的變量的覆蓋率，從而有充足的統(tǒng)計(jì)能力以檢測(cè)基因與疾病相關(guān)性是否顯著。隨著全球GWAS的廣泛開展，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)約1 000個(gè)哮喘候選基因[19]。一項(xiàng)2007年的GWAS研究[20]發(fā)現(xiàn)，在不同的種族中，重復(fù)頻率最高的哮喘基因簇位于染色體17q12-21上。一項(xiàng)大規(guī)模的研究進(jìn)一步表明，該基因組區(qū)域是特定于兒童哮喘發(fā)病的原因，其變異能夠調(diào)節(jié)多個(gè)基因的表達(dá)水平，包括血清類黏蛋白3(orosomucoid 3，ORMDL3)、抗原B(gasdermin B，GSDMB)和抗原A(gasdermin A，GSDMA)[21]。此外，在哮喘發(fā)展過程中，17q21位點(diǎn)的基因型與早期呼吸道感染有關(guān)[21]，且17q21基因變異和早期生活環(huán)境中煙草煙霧暴露會(huì)增強(qiáng)早期呼吸道感染與早發(fā)哮喘和兒童哮喘之間的聯(lián)系。另有研究發(fā)現(xiàn)[22-23]，透明帶結(jié)合蛋白2(ZPBP2)基因是兒童和成年哮喘的共同基因座，這一發(fā)現(xiàn)在多個(gè)位于ZPBP2和GSDMB基因內(nèi)SNP及致病變異的研究中得到了證實(shí)[22-23]。另有學(xué)者通過對(duì)來自歐洲人群13 556名兒童和成人進(jìn)行薈萃分析，發(fā)現(xiàn)位于ZPBP2啟動(dòng)子區(qū)域的1個(gè)SNP(rs11557467)與哮喘顯著相關(guān)(T的等位基因OR為1.32,P=3.29×10-15)[22]。近年來通過GWAS方法新發(fā)現(xiàn)的一些主要與兒童哮喘候選基因及位點(diǎn)見表1。

表1 全基因組關(guān)聯(lián)分析中發(fā)現(xiàn)的主要易感基因及位點(diǎn)[22-25]

1.5轉(zhuǎn)錄組學(xué)發(fā)現(xiàn)哮喘易感基因 除了基因組學(xué)，其他組學(xué)技術(shù)也是目前了解哮喘病理生理的重要手段。組學(xué)研究主要集中于各種生物來源數(shù)據(jù)，包括基因組修飾(表觀基因組學(xué))、基因組轉(zhuǎn)錄(轉(zhuǎn)錄組學(xué))、蛋白質(zhì)水平和化學(xué)修飾(蛋白質(zhì)組學(xué))、內(nèi)源性和外源性代謝產(chǎn)物(代謝組學(xué))和微生物組(宏基因組學(xué))。與其他疾病相比，轉(zhuǎn)錄組學(xué)在哮喘中的應(yīng)用尚處于起步階段。轉(zhuǎn)錄組是所選活細(xì)胞中可能轉(zhuǎn)錄出的所有RNA的總和，用于研究細(xì)胞的表型和功能。轉(zhuǎn)錄組學(xué)提供定量和定性的表征或RNA轉(zhuǎn)錄本，可以提供或證實(shí)GWAS識(shí)別的哮喘基因位點(diǎn)的機(jī)制解釋[18]。這些主要是側(cè)重于比較特定控制條件下細(xì)胞或組織中的基因表達(dá)水平，以識(shí)別可能對(duì)研究中的疾病有(單獨(dú)或聯(lián)合)功能影響的差異表達(dá)基因。有學(xué)者運(yùn)用轉(zhuǎn)錄組技術(shù)在2年內(nèi)研究133名兒童哮喘患者和11個(gè)亞洲血統(tǒng)的健康人對(duì)照組外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)基因表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PBMC基因表達(dá)譜有助于鑒別治療控制不良的TH1/TH17介導(dǎo)的哮喘，且PBMC和CD8+T細(xì)胞可能是研究和鑒定重癥哮喘的重要靶點(diǎn)[26]，并認(rèn)為外周血是兒童研究中最適合的樣本[18,26]。結(jié)合完整的臨床和組學(xué)數(shù)據(jù)有助于更好地解釋哮喘病理生理學(xué)生物過程，并幫助定義哮喘亞型，改善對(duì)病情嚴(yán)重程度評(píng)判和治療反應(yīng)，顯示出更高的預(yù)測(cè)能力。

2 基因位點(diǎn)的交互作用

哮喘是多基因病，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，隨著研究深入，逐漸證實(shí)不同基因位點(diǎn)間存在交互作用，影響哮喘的發(fā)病幾率。有學(xué)者通過追蹤1 000例出生隊(duì)列的研究，發(fā)現(xiàn)多個(gè)哮喘基因位點(diǎn)組合可預(yù)測(cè)哮喘的臨床發(fā)病及臨床表現(xiàn)等[27]。國(guó)內(nèi)有學(xué)者在漢族兒童中選取報(bào)道重復(fù)率高的哮喘易感基因中的多個(gè)SNP進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SNP越多，發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)度增高，單個(gè)位點(diǎn)者風(fēng)險(xiǎn)度是無變異者的2倍，而含2個(gè)位點(diǎn)者危險(xiǎn)度可增至約6倍，9個(gè)位點(diǎn)者患病風(fēng)險(xiǎn)甚至達(dá)16倍。其進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，由IL-13(-1112C>T、+1923C>T、R110Q)、IL4(-590C>T)、ADRB2(R16G)、FCER1B(-109C>T、E237G)、IL-4RA(I75V、Q551R)組成的模型哮喘預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率達(dá)80%以上。優(yōu)化所得IL-13(R110Q)、IL4(-590C>T)、ADRB2(R16G)和FCER1B(E237G)構(gòu)成的4位點(diǎn)哮喘預(yù)測(cè)模型的準(zhǔn)確度為80.00%[28]。國(guó)外有學(xué)者構(gòu)建了由EOT2(+1272A>G、+304C>A)、EOT3(+77C>T、+716A>G、+1579G>A)組成的5位點(diǎn)預(yù)測(cè)模型，并證實(shí)其對(duì)韓國(guó)群眾的哮喘易感預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性達(dá)64.3%[29]。盡管這些模型局限于所針對(duì)的目標(biāo)人群，但它們?cè)谝欢l件下提示多位點(diǎn)對(duì)哮喘發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)具有一定的預(yù)測(cè)價(jià)值。

3 基因與環(huán)境交互作用

盡管基因?qū)ο捌湎嚓P(guān)性狀有重要作用，但多種環(huán)境暴露也同樣影響哮喘的發(fā)生。在哮喘預(yù)測(cè)時(shí)，早期生活的暴露具有很高的關(guān)聯(lián)，包括呼吸道感染、腸道和呼吸道微生物影響和煙草煙霧吸入等。人們已通過多種方式識(shí)別基因-環(huán)境存在相互作用。一項(xiàng)最新的GWAS研究分析了遺傳變異與交通相關(guān)空氣污染的相互作用，證實(shí)交通工具排放的二氧化氮會(huì)導(dǎo)致哮喘癥狀的惡化，并可能降低肺功能[30]。另一項(xiàng)歐洲兒童的GWAS研究發(fā)現(xiàn)，ADCY2、B4GALT5和DLG2基因與環(huán)境相互作用對(duì)哮喘的發(fā)生發(fā)展具有重要意義[31]，嬰兒出生時(shí)NO2暴露會(huì)顯著影響這3個(gè)基因的表達(dá)，同時(shí)也增加NO2相關(guān)的外周血細(xì)胞表達(dá)水平，從而增加哮喘發(fā)作。

4 易感基因?qū)λ幬锏闹委煼磻?yīng)相關(guān)影響

目前國(guó)內(nèi)治療哮喘最常用的藥物主要是β2受體激動(dòng)劑、吸入皮質(zhì)類固醇(ICS)及白三烯調(diào)節(jié)劑。盡管大多數(shù)患者在使用藥物治療后哮喘癥狀緩解，但對(duì)于不同人群，哮喘的治療效果有很大差異。研究顯示易感基因也同時(shí)影響哮喘的治療效果。因此，哮喘治療藥物反應(yīng)性與相關(guān)基因位點(diǎn)關(guān)系的研究，可能更有助于在未來確定特定的藥物遺傳學(xué)特征，將為臨床治療患者帶來更精準(zhǔn)的治療方案。有學(xué)者通過對(duì)患有哮喘的非洲裔美國(guó)兒童進(jìn)行了支氣管舒張反應(yīng)的GWAS研究，發(fā)現(xiàn)染色體9q21上存在1個(gè)顯著相關(guān)的SNP位點(diǎn)(rs73650726,P=7.69×10-9)，且在非裔美國(guó)人和拉丁美洲人的跨種族研究中發(fā)現(xiàn)了另外3個(gè)SNP與支氣管舒張反應(yīng)顯著相關(guān)的PRKG1基因的內(nèi)含子(rs7903366、rs7070958、rs7081864,P=5×10-8)，證實(shí)了支氣管舒張反應(yīng)的遺傳基礎(chǔ)可能在種族或民族之間存在差異[32]。也有研究者通過對(duì)接受吸入型糖皮質(zhì)激素(inhaledcorticosteroids,ICS)治療的哮喘患者的基因型分析，以確定ICS應(yīng)答的遺傳標(biāo)記，但其并未得到明確結(jié)論[33]。目前藥物遺傳學(xué)仍然不能直接應(yīng)用于預(yù)測(cè)哮喘患者治療的臨床結(jié)果。

5 結(jié)語與展望

目前越來越多的哮喘易感基因逐漸被發(fā)現(xiàn)、驗(yàn)證，基因組研究的工具日漸進(jìn)步，顯著提升我們對(duì)復(fù)雜疾病的認(rèn)識(shí)。哮喘及其易感基因的發(fā)現(xiàn)、定位和遺傳機(jī)制具有重要的科學(xué)及臨床價(jià)值。哮喘受遺傳及環(huán)境因素共同影響，在深入遺傳因素本質(zhì)的同時(shí)，澄清哮喘的相關(guān)環(huán)境影響也同樣重要，從而能直接地識(shí)別和重現(xiàn)環(huán)境可塑的遺傳效應(yīng)。盡管目前我們對(duì)哮喘的相關(guān)遺傳因素了解有限，藥物遺傳度還不能直接應(yīng)用于遺傳預(yù)測(cè)，但隨著基因組醫(yī)學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步，對(duì)探究哮喘更深的遺傳機(jī)理、通過基因?qū)用骖A(yù)測(cè)哮喘進(jìn)展和治療反應(yīng)帶來了更大期待。總之，發(fā)現(xiàn)更多的哮喘易感基因及了解其交互作用，將為哮喘的臨床預(yù)測(cè)及治療帶來更多可能。