張國玲,吳賀明,郭蓮怡

(1.錦州醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，遼寧錦州121000；2.中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第968醫(yī)院放射科，遼寧錦州121000；3.朝陽市中心醫(yī)院消化內(nèi)科，122000)

食管癌是多基因、多階段、多因素共同作用于機(jī)體而產(chǎn)生的結(jié)果，目前認(rèn)為是致癌基因與抑癌基因結(jié)構(gòu)及功能異常并不斷累積的過程。食管癌發(fā)病原因尚不明確，中國臨床腫瘤學(xué)會(huì)(CSCO)2020年食管癌診療指南為我國臨床食管癌的診療提供了規(guī)范和標(biāo)準(zhǔn)[1]，但臨床上對(duì)于食管癌的診斷與篩查仍難以實(shí)現(xiàn)早期發(fā)現(xiàn)與治療。

微小RNA(microRNA,miRNA)在調(diào)控蛋白質(zhì)編碼過程中具有重要作用[2]。通過mRNA可以調(diào)節(jié)人體各種組織中蛋白質(zhì)的表達(dá)水平，1個(gè)miRNA可以配對(duì)多個(gè)基因，不同miRNA也可以調(diào)控同一基因[3]。研究表明，人類30%～50%的基因受到miRNA調(diào)控，在人類生長發(fā)育和疾病的發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要調(diào)節(jié)作用[4]。Guo等[5]研究發(fā)現(xiàn)，miRNA表達(dá)譜在食管癌組織中存在顯著差異。另有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，miRNA-21-5p (miR-21-5p,has-mir-21-5p)主要存在于17q23.1，且與消化道腫瘤的進(jìn)展相關(guān)，其推測(cè)miR-21-5p或可作為食管癌檢測(cè)的潛在腫瘤標(biāo)志物[6]。本研究旨在檢測(cè)miR-21-5P在食管鱗癌患者血清及組織標(biāo)本中的表達(dá)水平，評(píng)估m(xù)iR-21-5P鑒別診斷食管鱗癌的臨床效能。

1 材料與方法

1.1研究對(duì)象 收集2019年12月至2020年3月于朝陽市中心醫(yī)院消化內(nèi)科就診的食管鱗癌患者50例作為疾病組，其中，男32例，女18例，年齡(51.0±3.7)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：均經(jīng)病理組織學(xué)證實(shí)為食管鱗癌，且按照2020中國臨床腫瘤學(xué)會(huì)(CSCO)食管癌診療指南[1]明確診斷。未經(jīng)任何治療或藥物干預(yù)。排除診斷:(1)懷孕或哺乳期婦女；(2)任何器官移植史以及現(xiàn)存的功能性移植物(角膜或毛發(fā)移植除外)；(3)嚴(yán)重疾病史或由其他證據(jù)表明為嚴(yán)重疾病或患有任何的疾病使患者不適合參加試驗(yàn)；(4)同時(shí)參加其他臨床研究試驗(yàn)的患者。另收集同期消化內(nèi)科就診的胃鏡、病理組織學(xué)共同診斷為食管炎(反流性食管炎、藥物等損傷所致食管炎等)患者20例作為相關(guān)疾病對(duì)照組，其中，男13例，女7例，年齡(50.2±4.0)歲。本研究經(jīng)朝陽市中心醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)(醫(yī)倫審〔2019〕17號(hào))，患者及家屬知情同意。

1.2儀器與試劑 Nanodrop 2000超微量分光光度計(jì)(美國賽默飛世爾科技公司)，AERIS-BGO96 PCR基因擴(kuò)增儀(新加坡藝恩高科技公司)，LightCycler480實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析儀(北京龍躍生物科技發(fā)展公司)。miRNA提取試劑盒、miRNA cDNA合成試劑盒、miRNA熒光定量PCR試劑盒(昆明康為世紀(jì)公司)。

1.3標(biāo)本采集 用無抗凝劑的真空管采集食管鱗癌患者及食管炎患者入院時(shí)的空腹靜脈血5 mL，室溫凝固，4 ℃、4 000 r/min離心10 min，取上層血清，置于-80 ℃保存；收集胃鏡檢查中及手術(shù)中食管鱗癌患者癌組織及癌旁組織(距離其超過5 cm處食管粘膜處組織,且經(jīng)病理組織學(xué)證實(shí)無癌細(xì)胞)；胃鏡檢查中采集食管炎患者組織，置于-80 ℃保存。

1.4RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 按照miRNA提取試劑盒說明書操作提取各組患者血清及組織中的miRNA，采用Nanodrop 2000超微量分光光度計(jì)測(cè)定其吸光度，取吸光度(A260/280 nm)值為1.9～2.1的樣本用于后續(xù)試驗(yàn)，樣本置于-80 ℃保存。純化提取的miRNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。樣本置于-20 ℃保存。

1.5引物設(shè)計(jì)及熒光定量PCR 根據(jù)NCBI中GenBank數(shù)據(jù)庫查詢的miRNA-21(NR_029493.1)和U6(NR_004394.1)的基因序列號(hào)，采用Primer Express 5.0引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)，并送昆明拓源經(jīng)貿(mào)公司合成。miRNA-21-5P上游引物序列：5′-TAGCTTATCAGACTGATGTTGA-3′，下游引物序列：5′-AGTGCGTGTCGTGG-3′[7]，退火溫度60 ℃，產(chǎn)物片段大小73 bp。U6上游引物序列：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物序列：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′，退火溫度60 ℃，產(chǎn)物片段大小106 bp。按照miRNA qPCR Assay Kit說明書操作進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR總反應(yīng)體系為20 μL，包括：2×miRNA qPCR Mixture(ROX) 10 μL，10 μmol/L上、下游引物各0.4 μL，cDNA 1.0 μL，ddH2O補(bǔ)足至20 μL。在LightCycler480熒光定量PCR分析儀上完成操作。PCR循環(huán)參數(shù)：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火/延伸1 min，共40個(gè)循環(huán)。采用LIMS/BarCode軟件于60 ℃時(shí)收集熒光信號(hào)并進(jìn)行熔解曲線分析，結(jié)果以2-△△Ct法計(jì)算，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.12組患者組織及血清miRNA-21-5P的表達(dá)水平比較 食管鱗癌組癌組織中miRNA-21-5P的相對(duì)表達(dá)量為4.36±0.29，顯著高于食管炎患者(0.96±0.07)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=27.570，P<0.05)。而癌旁組織中miRNA-21-5P的相對(duì)表達(dá)量為1.31±0.16，與癌組織比較，差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=20.100，P<0.05)。此外，食管鱗癌組血清中miRNA-21-5P的相對(duì)表達(dá)量為3.60±0.09，顯著高于食管炎患者(1.01±0.05)，2組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=24.43，P<0.05)。

2.2血清miRNA-21-5P表達(dá)與食管鱗癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系 根據(jù)組織學(xué)類型分組對(duì)比，在低分化組中miRNA-21-5P的相對(duì)表達(dá)量較中、高分化組均顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；根據(jù)腫瘤浸潤的深度分組對(duì)比，T3～T4組miRNA-21-5P相對(duì)表達(dá)量較T1～T2組顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；根據(jù)腫瘤組織大小分組對(duì)比，淋巴結(jié)有轉(zhuǎn)移組的miRNA-21-5P相對(duì)表達(dá)量較淋巴結(jié)無轉(zhuǎn)移組顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；根據(jù)TNM分期分組對(duì)比，miRNA-21-5P相對(duì)表達(dá)量在TNM分期Ⅲ～Ⅳ期組顯著高于Ⅰ～Ⅱ期組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 miRNA-21-5p的表達(dá)與食管鱗癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系

2.3ROC曲線評(píng)估組織及血清中miRNA-21-5P的表達(dá)對(duì)食管鱗癌鑒別診斷的價(jià)值 以食管鱗癌患者作為疾病組，食管炎患者作為對(duì)照組，ROC曲線分析結(jié)果顯示，組織中miRNA-21-5P鑒別診斷食管鱗癌的ROC曲線下面積(AUCROC)為0.767(95%CI:0.650,0.859)，當(dāng)cut-off值為0.39時(shí)，其敏感性為88%，特異性為75%。血清miRNA-21-5P鑒別診斷食管鱗癌的AUCROC為0.671(95%CI:0.549,0.779)，當(dāng)cut-off值為0.63時(shí)，其敏感性為80%，特異性為66%。見圖1。

圖1 血清及組織中miRNA-21-5P鑒別診斷食管鱗癌的ROC曲線

3 討論

MicroRNA(miRNA)在調(diào)控蛋白質(zhì)編碼過程中具有重要的應(yīng)用價(jià)值，在人類某些腫瘤及炎癥[8-9](如血管生成、侵入性、轉(zhuǎn)移和分化)等過程中發(fā)揮重要作用。本研究通過檢測(cè)食管鱗癌患者血清及組織中miRNA-21-5P的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其在食管鱗癌患者血清及組織中的表達(dá)水平均顯著高于食管炎患者，由此推斷食管癌患者血清及組織中miRNA-21-5P表達(dá)水平的上調(diào)與食管鱗癌的發(fā)生密切相關(guān)。ROC曲線分析結(jié)果顯示，組織中miRNA-21-5P鑒別診斷食管鱗癌的ROC曲線下面積(AUCROC)為0.767(95%CI:0.650,0.859)，當(dāng)cut-off值為0.39時(shí)，其敏感性為88%,特異性為75%。而血清miRNA-21-5P鑒別診斷食管鱗癌的AUCROC為0.671(95%CI:0.549,0.779)，當(dāng)cut-off值為0.63時(shí)，其敏感性為80%,特異性為66%。雖然組織中miRNA-21-5P診斷的敏感性及特異性更佳，但由于血清標(biāo)本更容易采集，更廣泛的應(yīng)用于臨床，有望成為食管癌鑒別診斷的生物學(xué)標(biāo)志物。

食管鱗癌中miRNA-21-5P作用的分子機(jī)制目前尚不明確，仍需進(jìn)一步研究。王燕忠等[10]研究發(fā)現(xiàn)，食管鱗癌患者血清中的STAT3是miRNA-21-5p調(diào)控的靶基因，并且與食管癌細(xì)胞的增殖和凋亡密切相關(guān)。本研究中發(fā)現(xiàn)，miRNA-21-5p的表達(dá)水平與食管癌分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤程度關(guān)系密切，分析原因可能與食管鱗癌發(fā)病機(jī)制相關(guān)。然而，由于本研究納入的樣本數(shù)量存在局限性，可能影響臨床鑒別診斷的特異性及敏感性。此外，本研究因組織標(biāo)本采集不便，未納入健康人對(duì)照組，下一步我們將增加健康人對(duì)照組，并將地域分布等因素納入研究中，以期闡明其在食管癌中的發(fā)病機(jī)制及臨床診斷中的作用。