張婷，張陽東，饒慶敏，林裕龍

(1.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬腦科醫(yī)院檢驗科，廣州510370；2.火箭軍特色醫(yī)學(xué)中心中心實驗室，北京100088)

細胞色素P450藥物代謝酶(CYP)2C19和CYP2D6作為細胞色素P450第二家族中重要的代謝酶，參與了人體內(nèi)眾多的藥物代謝途徑。該2個酶的編碼基因均存在多態(tài)性，不同的基因型可不同程度影響酶的活性。其中CYP2C19常見的等位基因有3種：*1、*2和*3，CYP2C19*1/*1為快代謝型，CYP2C19*1/*2 和CYP2C19*1/*3為中間代謝型，CYP2C19*2/*2、CYP2C19*2/*3和CYP2C19*3/*3為慢代謝型。在亞洲人群中較為常見CYP2D6等位基因有*1、*2、*4、*10和*41，其中CYP2D6*1、*2為快代謝型等位基因，*4、*10和*41基因均可使編碼的CYP2D6酶活性減弱，攜帶*4、*10和*41中1種等位基因的雜合體為中間代謝型，攜帶*4、*10和*41中1種等位基因的純合體或同時攜帶功能降低等位基因的雜合體為中低代謝型[1]。

氯氮平(Clozapine，CZ)是一種新型的抗精神分裂癥藥物，其錐體外系反應(yīng)等不良反應(yīng)較少[2]。CZ在臨床上治療精神分裂癥的有效率為30%～60%[3-4]，效果較為顯著，因此，目前已成為抗非典型精神分裂癥重要的備選藥物。CZ在體內(nèi)的主要代謝產(chǎn)物為去甲氯氮平(Norclozapine，NCZ)。研究顯示，維持劑量持續(xù)服用CZ 2周后，血藥濃度可達到穩(wěn)態(tài)，即機體對CZ的吸收速度與消除速度達到平衡[2]。此時，個體NCZ/CZ比值基本恒定，受藥物濃度的影響較小，可以作為衡量CZ代謝效率的指標(biāo)[5]。有學(xué)者認為CYP2C19酶和CYP2D6酶是代謝CZ的主要關(guān)鍵酶[5-6]。導(dǎo)致CZ個體間藥物代謝差異的主要遺傳因素是CYP2D6*10等位基因和CYP2C19缺陷等位基因(*2，*3)，這些等位基因在中國漢族人群中普遍存在。CYP2C19或CYP2D6慢代謝者服用CZ后血藥濃度更高，將有可能增加嚴重不良反應(yīng)的發(fā)生率。目前，CYP2C19和CYP2D6對CZ代謝的影響仍存在許多爭議[7]，這可能和種族、人群、地域和飲食的差異有關(guān)。本研究旨在探討CYP2C19、CYP2D6基因多態(tài)性與CZ代謝的相關(guān)性，為進一步完善CZ個體化用藥提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1研究對象 收集2018年1月至2019年6月廣州醫(yī)科大學(xué)附屬腦科醫(yī)院精神科住院的224例精神分裂癥患者，男163例，女61例，年齡(44.0±15.7)歲。納入標(biāo)準：(1)符合《精神障礙診斷和統(tǒng)計手冊-Ⅳ》(DSM-Ⅳ)精神分裂癥的診斷標(biāo)準[2]；(2)單一服用CZ：初始劑量均為50 mg/d，根據(jù)患者實際情況調(diào)整劑量至維持劑量，最大維持劑量400 mg/d。服藥率為100%，服藥依從性良好。排除標(biāo)準[2]：(1)腦器質(zhì)性疾病或其他類型精神??；(2)糖尿病、血液病、心血管病、消化道疾病或呼吸道疾病史的患者；(3)有物質(zhì)濫用史；(4)有吸煙行為的患者；(5)對CZ有嚴重不良反應(yīng)，無法耐受400 mg/d CZ維持劑量治療的患者；(6)近1周內(nèi)未服用抗精神病藥, 6周內(nèi)未服用長效抗精神病藥。本研究經(jīng)廣州醫(yī)科大學(xué)附屬腦科醫(yī)院倫理委員會審核批準(No.AF/SC-02/02.1)，各研究對象均知情同意。

1.2儀器與試劑 DNA提取試劑盒(上海百傲科技股份公司)，CYP2C19基因與CYP2D6基因多態(tài)性實時熒光定量PCR試劑盒(廣州海思醫(yī)療科技公司)，CZ標(biāo)準品(批號：5-EOD-183-1，深圳凱美科技公司)，NCZ標(biāo)準品(批號：#066M4095，深圳振強生物技術(shù)公司)，CZ和NCZ內(nèi)標(biāo)物(地西泮)(批號：161102，山東信宜制藥公司)，CZ和NCZ對照品(批號：S1325376，中國藥品生物制品研究所)。ABI 7300型實時熒光PCR擴增儀(美國ABI公司)，Thermo Evolution 201紫外可見分光光度計(美國賽默飛公司)，Agilent 1260高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)。

1.3方法

1.3.1標(biāo)本采集 各研究對象按維持劑量服藥2周后，于服藥前晨起采集空腹靜脈血4 mL，1 000×g離心10 min分離1 mL血清至1.5 mL EP管，用于監(jiān)測CZ和NCZ血藥濃度。另取EDTA-K2抗凝血2 mL，用于CYP2C19和CYP2D6基因多態(tài)性檢測。無法及時檢測的標(biāo)本置于-80 ℃保存。

1.3.2CZ和NCZ血藥濃度檢測 取上述1 mL血清加至10 mL離心管中，加入10 μg/mL內(nèi)標(biāo)液50 μL，快速振蕩。加入提取劑乙酸乙酯與二氯乙烷(80∶20)4 mL，密塞后旋轉(zhuǎn)震蕩2 min，2 000×g離心10 min。吸取上清液至5 mL離心管中，置于50 ℃真空箱中干燥。采用Agilent 1260高效液相色譜儀檢測CZ和NCZ的血藥濃度。進樣前加入100 μL流動相溶解藥物，快速振蕩，吸取15 μL進樣。線性范圍為50～1 200 ng/mL。

1.3.3DNA提取 取EDTA-K2抗凝血，按DNA提取試劑盒說明書操作提取基因組DNA。使用Thermo Evolution 201紫外可見分光光度計測定DNA的濃度和純度，取DNA吸光度(A260/280 nm)值在1.8～2.0之間，濃度為5～15 ng/μL的樣本用于后續(xù)試驗。DNA置于-80 ℃保存。

1.3.4實時熒光定量PCRCYP2C19基因多態(tài)性PCR總反應(yīng)體系為25 μL，包括反應(yīng)液23 μL和模板DNA 2 μL。PCR循環(huán)參數(shù)：37 ℃ 10 min，95 ℃ 5 min；95 ℃ 15 s，62 ℃ 60 s，共40個循環(huán)：并在此階段結(jié)束時使用ABI實時熒光PCR擴增儀自帶軟件采集熒光信號。結(jié)果判讀：若該位點為純合野生型：FAM通道Ct值≤36，VIC通道Ct值>36或無Ct值；若該位點為雜合突變：FAM通道Ct值≤36，VIC通道Ct值≤36；若該位點為純合突變：FAM通道Ct值>36或無Ct值，VIC通道Ct值≤36。

CYP2D6基因多態(tài)性PCR總反應(yīng)體系為20 μL，包括反應(yīng)液18 μL和模板DNA 2 μL。PCR循環(huán)參數(shù)：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，65 ℃ 60 s，共45個循環(huán)，并在此階段結(jié)束時采集熒光信號。結(jié)果判讀：當(dāng)內(nèi)部控制訊號Ct值<35時，若ΔCt<6，曲線為陽性，若ΔCt>6，曲線為陰性；當(dāng)內(nèi)部控制信號Ct值>35時，重新檢測樣本質(zhì)量或稀釋后復(fù)檢。若ΔCt介于6～7之間，需重復(fù)測試，若重復(fù)測試后ΔCt仍介于6～7之間，則需測序確認結(jié)果。

按基因型的代謝類型分組及結(jié)果判讀。基因型為CYP2C19*1/*1分為CYP2C19快代謝型，基因型為CYP2C19*1/*2和CYP2C19*1/*3分為CYP2C19中間代謝型，基因型為CYP2C19*2/*2和CYP2C19*2/*3分為慢代謝型?；蛐蜑镃YP2D6*1/*1、CYP2D6*1/*2和CYP2D6*2/*2分為CYP2D6快代謝型；CYP2D6*1/*41、CYP2D6*1/*4、CYP2D6*1/*10、CYP2D6*2/*4、CYP2D6*2/*10和CYP2D6*2/*41分為CYP2D6中間代謝型?；蛐蜑镃YP2D6*4/*10、CYP2D6*10/*10和CYP2D6*4/*41分為CYP2D6中低代謝型。

1.4統(tǒng)計學(xué)分析 采用IBM SPSS Statistics 20.0軟件進行。各組間的年齡、CZ、NCZ、CZ+NCZ及NCZ/CZ比值的比較采用方差分析，各組間性別比較采用χ2分析。采用多因素線性Logistic回歸方程分析性別、年齡、CYP2C19代謝型和CYP2D6代謝型與CZ代謝的關(guān)聯(lián)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1各精神分裂癥患者CYP2C19和CYP2D6的基因頻率CYP2C19與CYP2D6不同代謝類型的224例精神分裂癥患者性別和年齡等具體數(shù)據(jù)見表1。CYP2C19等位基因*1、*2和*3的基因頻率分別為62.3%、33.9%和3.8%。CYP2D6等位基因*1、*2、*4、*10和*41的基因頻率分別為22.3%、11.8%、0.7%、61.2%和4.0%。

表1 不同CYP2C19和CYP2D6基因頻率在各代謝組的性別和年齡比較

2.2CZ、NCZ血藥濃度及NCZ/CZ比值在劑量調(diào)整過程中的變化規(guī)律 224例受檢對象中，有98例在初始劑量至維持劑量的藥物劑量增加過程中檢測了3次CZ和NCZ的藥物濃度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，首次劑量、2次劑量和3次劑量這3組間的CZ、NCZ和CZ+NCZ差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，而3組間NCZ/CZ的比值差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見表2。

表2 98例患者CZ劑量增量過程中的血藥濃度及NCZ/CZ比值

2.3CYP2C19、CYP2D6代謝類型與CZ代謝的相關(guān)性

2.3.1CYP2C19、CYP2D6代謝類型與CZ代謝的關(guān)聯(lián) 將患者分別按照CYP2C19代謝類型和CYP2D6代謝類型分組，各組CZ、NCZ、CZ+NCZ總濃度及NCZ/CZ比值見表3。結(jié)果表明，患者按CYP2C19代謝類型分組后，快代謝型、中間代謝型和慢代謝型的NCZ/CZ比值差異有統(tǒng)計學(xué)意義，且快代謝型和中間代謝型均顯著高于慢代謝型(P<0.01)。

表3 各代謝組CZ、NCZ、CZ+NCZ及NCZ/CZ比值

2.3.2CYP2C19與CYP2D6基因組合協(xié)同分析NCZ/CZ比值 在同一CYP2C19代謝類型中各組CYP2D6代謝型間的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表4。

表4 CYP2C19與CYP2D6基因組合協(xié)同分析NCZ/CZ比值*

2.4多因素線性回歸分析結(jié)果 分別以CZ、NCZ、NCZ+CZ、NCZ/CZ比值為因變量，性別、年齡、CYP2C19代謝型和CYP2D6代謝型為自變量，進行多因素線性回歸分析。CZ線性回歸方程為CZ=649.36-147.77性別-4.60年齡(F=50.54，P<0.01)；NCZ線性回歸方程為NCZ=234.28-68.7性別-1.30年齡-39.64CYP2C19慢代謝型(F=46.83，P<0.01)； NCZ+CZ線性回歸方程為NCZ+CZ=883.64-216.44性別-5.90年齡-92.12CYP2C19慢代謝型(F=54.72，P<0.01)；NCZ/CZ線性回歸方程為NCZ/CZ=0.33-0.01性別-0.01年齡-0.01CYP2C19慢代謝型(F=7.11，P<0. 01)；各多因素線性回歸方程模型均有統(tǒng)計學(xué)意義。見表5。

表5 多因素線性回歸方程模型

3 討論

本研究檢測了224例服用CZ的精神分裂癥患者的CYP2C19基因型、CYP2D6基因型以及維持治療后的CZ和NCZ的血藥濃度，并分析CYP2C19基因、CYP2D6基因與CZ代謝的相關(guān)性。本次研究患者的維持劑量一致、單一服用CZ、年齡性別均衡、均無吸煙行為，可以排除藥物劑量、藥物相互作用、年齡性別、吸煙行為對藥物濃度的影響?；颊呓?周內(nèi)未服用抗精神病藥，6周內(nèi)未服用長效抗精神病藥，可以排除既往用藥對CZ和NCZ血藥濃度的影響。患者CYP2C19和CYP2D6等位基因分布與人群等位基因分布基本一致[8-10]，故而,也排除基因型分布對結(jié)果造成的影響。98例患者在藥物劑量調(diào)整過程中的血藥濃度的動態(tài)監(jiān)測結(jié)果顯示，雖然不同藥物劑量調(diào)整階段藥物濃度有明顯的差異，但NCZ/CZ比值沒有顯著差異。因此，NCZ/CZ比值作為衡量CZ代謝速率的主要分析指標(biāo)，可以忽略不同患者用同一維持劑量治療可能導(dǎo)致的藥物濃度差異的影響。

224例患者中CYP2C19慢代謝型的NCZ濃度、CZ+NCZ總濃度及NCZ/CZ比值均低于CYP2C19快代謝型和CYP2C19中間代謝型(P<0.05)，可以推測CYP2C19參與CZ的代謝，CYP2C19慢代謝型基因引起酶活性下降，導(dǎo)致CZ代謝能力顯著降低，使NCZ的生成減慢，致使NCZ/CZ比值降低[3,6]。以CYP2D6代謝類型分組，CYP2D6快代謝型、中間代謝型和中低代謝型的CZ濃度、NCZ濃度、CZ+NCZ總濃度及NCZ/CZ比值差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。為了進一步證實CYP2D6對CZ代謝的影響，筆者比較了同一CYP2C19代謝型中不同CYP2D6代謝類型的NCZ/CZ比值。結(jié)果顯示，在同一CYP2C19代謝型基因中，不同代謝類型CYP2D6的NCZ/CZ比值差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，提示CYP2D6酶對CZ代謝影響不顯著[7,11]。多因素回歸分析顯示，女性、高齡和CYP2C19慢代謝型與NCZ/CZ比值呈負相關(guān)，提示女性、高齡患者的CZ代謝率下降，與文獻[12]結(jié)果一致；CYP2C19代謝酶對CZ代謝影響顯著，而CYP2D6代謝酶可能不參與CZ代謝，與上述分析結(jié)果一致。也有文獻發(fā)現(xiàn)了不一樣的研究結(jié)論，其認為CYP2C19酶不參與CZ的代謝[11]，或者認為CYP2D6酶是影響CZ代謝中的關(guān)鍵酶之一[5,13]。這可能是由于CYP2C19基因和CYP2D6基因在種族和人群的分布差異或飲食習(xí)慣等不同所致。

臨床上由CZ血藥濃度過高引起的嚴重不良反應(yīng)包括：心肌炎、粒細胞缺乏和麻痹性腸梗阻等[6]。為了避免這些嚴重不良反應(yīng)，需為患者制定個體化的用藥方案。雖然CZ在治療精神分裂癥時可依據(jù)藥物濃度、療效和不良反應(yīng)來確定個體的維持劑量，但這些指標(biāo)的使用存在滯后性。因此，在CZ的臨床用藥中，CYP2C19基因型是需要密切關(guān)注的基因型之一。臨床醫(yī)生可以根據(jù)CYP2C19代謝類型適當(dāng)調(diào)整用藥劑量，為患者選擇合適的維持劑量的同時，使患者在治療中獲得較好的療效。