劉楊，張志平，彭道榮，邢瑞青，李靜，趙媛，劉家云

(空軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院西京醫(yī)院檢驗(yàn)科，西安 710032)

人補(bǔ)體因子H相關(guān)蛋白(human complement factor H-related protein，hCFHrp)是由尿路上皮腫瘤細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的，其可打斷補(bǔ)體級(jí)聯(lián)反應(yīng)，使人體免疫系統(tǒng)不能很好地識(shí)別惡性腫瘤細(xì)胞，逃避宿主免疫系統(tǒng)，從而參與腫瘤細(xì)胞的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移過程[1-2]。當(dāng)膀胱發(fā)生腫瘤時(shí)，膀胱腫瘤細(xì)胞分泌的hCFHrp可與基底膜表面相關(guān)受體結(jié)合，釋放蛋白水解酶水解基底膜，含hCFHrp的基底膜碎片釋放至膀胱內(nèi)聚合成相對(duì)分子質(zhì)量Mr(×103)為16～165的高分子復(fù)合物,即膀胱腫瘤相關(guān)抗原(bladder tumor associated antigen，BTA)[3]。hCFHrp是BTA的具體成分，尿液BTA檢測(cè)的抗原為補(bǔ)體因子H相關(guān)蛋白，故而傳統(tǒng)將補(bǔ)體因子H相關(guān)蛋白簡(jiǎn)稱為BTA。目前，尿液hCFHrp檢測(cè)作為一種無創(chuàng)、便捷且經(jīng)濟(jì)的膀胱癌檢測(cè)方法，越來越受到臨床的重視。本文旨在研究尿液hCFHrp在診斷膀胱癌中的應(yīng)用價(jià)值并分析其與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1一般資料 回顧性分析2020年4月至12月西京醫(yī)院泌尿外科收治住院的膀胱癌患者的臨床資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)患者首次經(jīng)膀胱鏡電切除術(shù)或手術(shù)后送病理活檢確診為膀胱癌。(2)病理結(jié)果均由2名病理醫(yī)師雙盲閱片確診。(3)患者在行膀胱鏡電切除術(shù)或手術(shù)等泌尿系統(tǒng)有創(chuàng)檢查前進(jìn)行尿液hCFHrp檢測(cè)，且未接受過任何泌尿系統(tǒng)疾病的治療。(4)臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并有泌尿系統(tǒng)其他惡性腫瘤的患者。(2)合并有泌尿系統(tǒng)結(jié)石及腎功能下降的患者。(3)合并有其他部位腫瘤并接受過手術(shù)或放、化療的患者。(4)血尿。依據(jù)以上標(biāo)準(zhǔn)，共納入膀胱癌患者69例，其中男性45例，女性24例，年齡32～81歲，中位年齡62歲。TNM分期依據(jù)美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)(American Joint Committee on Cancer，AJCC)標(biāo)準(zhǔn)：Ta～T1期35例，T2～T4期34例。病理組織學(xué)分級(jí)依據(jù)世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)標(biāo)準(zhǔn)：低分級(jí)34例和高分級(jí)35例。腫瘤大小依據(jù)病理報(bào)告，其中腫瘤直徑<1 cm 23例，1～2 cm 26例，>2 cm 20例?；仡櫺苑治鐾诒驹菏罩蔚拿谀蛳到y(tǒng)良性疾病患者的臨床資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)臨床確診為膀胱炎、膀胱結(jié)石、前列腺增生，前列腺炎及泌尿系感染。(2)尿液hCFHrp檢測(cè)前未接受過泌尿系統(tǒng)有創(chuàng)檢查。(3)臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并有泌尿系統(tǒng)及其他部位腫瘤患者。(2)腎功能下降患者。(3)血尿。共納入泌尿系統(tǒng)良性疾病患者30例，其中男性19例，女性11例，年齡28～78歲，中位年齡58歲，其中膀胱結(jié)石7例，前列腺增生12例，泌尿系統(tǒng)炎癥10例及腺性膀胱炎1例。另選取同期排除有泌尿系統(tǒng)疾病的體檢健康者30例作為健康人對(duì)照組，其中男性20例，女性10例，年齡30～77歲，中位年齡59歲。

1.2主要儀器與試劑 Lumo化學(xué)發(fā)光分析儀(鄭州安圖生物公司)，hCFHrp定量測(cè)定試劑盒(微孔板化學(xué)發(fā)光法，北京普恩光德生物科技公司)。

1.3標(biāo)本采集 所有研究對(duì)象用一次性尿杯留取晨起新鮮中段尿約10 mL，疾病組患者均在泌尿系統(tǒng)有創(chuàng)操作前及臨床治療前留取，尿液以3 000 r/min離心10 min，取上清至塑料試管中，置于-80 ℃凍存?zhèn)錂z。

1.4hCFHrp檢測(cè)

1.4.1實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備 將試劑盒從2 ℃～8 ℃冰箱取出，室溫靜置30 min以上平衡至室溫(18 ℃～25 ℃)，20倍濃縮稀釋液用純化水或蒸餾水稀釋20倍后使用。

1.4.2實(shí)驗(yàn)方法

1.4.2.1加樣溫育 取足夠數(shù)量的包被板，固定于框架上，分別設(shè)置校準(zhǔn)品孔、質(zhì)控品孔、待測(cè)樣本孔，記錄各孔位置，按順序在校準(zhǔn)品孔中加入校準(zhǔn)品50 μL，在質(zhì)控品孔加入質(zhì)控品50 μL，在待測(cè)樣本孔中加入45 μL hCFHrp樣品稀釋液，按順序在樣本孔中分別加入5 μL的待測(cè)樣品，等同于樣本進(jìn)行了10倍稀釋，20 min內(nèi)完成此步操作。每孔加入hCFHrp酶工作液50 μL，震蕩混勻，加蓋封板膜，37 ℃溫育60 min。

1.4.2.2洗板 除去孔內(nèi)液體，在干凈的吸水紙上拍干，每孔加入35 μL洗液，靜置5～10 s后棄盡，重復(fù)沖洗5次，最后在干凈的吸水紙上拍干。

1.4.2.3測(cè)定 每孔加入50 μL化學(xué)發(fā)光液A和50 μL化學(xué)發(fā)光液B，充分混勻后置入Lumo化學(xué)發(fā)光分析儀檢測(cè)并讀數(shù)。

1.4.2.4計(jì)算 根據(jù)校準(zhǔn)品的濃度及對(duì)應(yīng)的光子數(shù)，均以校準(zhǔn)品S0孔調(diào)零，使用雙對(duì)數(shù)線擬合方式[log(X)-log(Y)]計(jì)算結(jié)果。將質(zhì)控品對(duì)應(yīng)的光子數(shù)帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算出的結(jié)果即為質(zhì)控品濃度；將樣本對(duì)應(yīng)的光子數(shù)帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算出的結(jié)果按公式：C檢測(cè)=C計(jì)算×10，轉(zhuǎn)換成樣本的檢測(cè)濃度。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用IBM SPSS Statistics 23統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析；計(jì)數(shù)資料用頻數(shù)和率表示，組間比較用χ2檢驗(yàn)；計(jì)量資料呈偏態(tài)分布，數(shù)據(jù)采用中位數(shù)(四分位數(shù))[M(P25,P75)]表示，多組間比較采用Cruskal-WallisH檢驗(yàn)，兩組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)；采用ROC曲線分析尿液hCFHrp對(duì)膀胱癌診斷的特異性、敏感性和cut-off值。

2 結(jié)果

2.1不同人群尿液hCFHrp濃度及陽性率的比較 膀胱癌組、良性疾病組及健康人對(duì)照組尿液hCFHrp濃度逐漸下降[182.37(90.14～584.22) U/mL，53.70(32.48～84.08) U/mL，20.7(9.10～34.30) U/mL]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(H=73.17，P<0.001)。進(jìn)一步進(jìn)行組間兩兩比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)膀胱癌組hCFHrp水平高于良性病變組(U=322.0，P<0.01)及健康人對(duì)照組(U=152.0，P<0.01)，而良性病變組hCFHrp水平高于健康人對(duì)照組(U=215.0，P<0.01)；此外，比較各組hCFHrp陽性率(取臨界值89.03 U/mL)，3組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=60.14，P<0.001)，進(jìn)一步進(jìn)行組間兩兩比較，發(fā)現(xiàn)膀胱癌組陽性率為76.81%，顯著高于良性病變組20.00%(χ2=28.06，P<0.001)及健康人對(duì)照組0.00%(χ2=49.59，P<0.001)，而良性病變組陽性率顯著高于健康人對(duì)照組(χ2=6.67，P=0.024)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2尿液hCFHrp與膀胱癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系 高級(jí)別組膀胱癌患者尿液hCFHrp水平及陽性率(取臨界值89.03 U/mL)較低級(jí)別組顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；T2～T4期的膀胱癌患者尿液hCFHrp水平及陽性率較T0～T1期患者顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；膀胱癌患者尿液hCFHrp水平及陽性率隨著腫瘤體積的增大呈上升趨勢(shì)，差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表2。

表2 尿液hCFHrp與膀胱癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系

2.3尿液hCFHrp診斷膀胱癌的ROC曲線分析 以膀胱癌患者為疾病組，泌尿系良性疾病患者及健康人為對(duì)照組，繪制ROC曲線。結(jié)果顯示，尿液hCFHrp診斷膀胱癌的ROC曲線下面積(AUCROC)為0.922，當(dāng)cut-off值為89.03 U/mL時(shí)，其敏感性為76.80%，特異性為95.00%，約登指數(shù)為0.718。見圖1。

圖1 尿液hCFHrp診斷膀胱癌的ROC曲線

3 討論

膀胱癌是我國(guó)泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，其具有惡性程度高，復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率高，預(yù)后差等特點(diǎn)[4]。傳統(tǒng)的針對(duì)膀胱癌的診斷檢查有腹部膀胱彩超、靜脈尿路造影、 尿脫落細(xì)胞學(xué)檢查及膀胱鏡檢查，但這些方法在靈敏度和可行性上均存在一定的弊端[5-6]。因此，近些年來針對(duì)膀胱癌的分子生物學(xué)診斷技術(shù)越來越受到關(guān)注。

目前，美國(guó)食品與藥物委員會(huì)(FDA)己批準(zhǔn)將hCFHrp等多項(xiàng)生物學(xué)標(biāo)志物用于膀胱腫瘤的檢查[7]，本研究通過微孔板化學(xué)發(fā)光法對(duì)不同人群的尿液hCFHrp含量進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示尿液hCFHrp含量在膀胱癌患者中顯著升高，hCFHrp診斷膀胱癌的特異性較高，敏感性適中。朱有森等[8]和熊雄等[9]報(bào)道的尿液hCFHrp診斷膀胱癌的敏感性和特異性分別為72.3%和 89.6%以及85.96%和82.29%，與本研究結(jié)果比較存在較大差異，分析原因可能與本研究在選擇膀胱癌患者入組時(shí)，嚴(yán)格排除了具有對(duì)尿液hCFHrp水平存在潛在影響因素的患者有關(guān)，如嚴(yán)重血尿，尿路感染，尿路結(jié)石等[10]，還可能與各項(xiàng)研究所收集的病例數(shù)量、腫瘤類型以及患者的尿液性狀不同有關(guān)。hCFHrp是尿路上皮惡變時(shí)水解基底膜產(chǎn)生的基底膜碎片，但許多泌尿系統(tǒng)良性疾病也常會(huì)發(fā)生尿路移行上皮細(xì)胞破壞而致的基底膜破壞，從而導(dǎo)致尿液hCFHrp假陽性結(jié)果。因此，臨床對(duì)hCFHrp檢測(cè)結(jié)果的判定應(yīng)綜合hCFHrp潛在影響因素、患者的臨床特征以及其他檢測(cè)指標(biāo)共同進(jìn)行，尿液hCFHrp檢測(cè)在膀胱癌的診斷上仍不能取代膀胱鏡檢及病理組織活檢。本研究進(jìn)一步分析了尿液hCFHrp與膀胱癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系，結(jié)果顯示膀胱癌患者尿液hCFHrp濃度隨著腫瘤向高級(jí)、高期進(jìn)展而呈上升趨勢(shì)，且與腫瘤大小有一定的相關(guān)性，這與文獻(xiàn)報(bào)道一致[6，11-12]，表明尿液hCFHrp檢測(cè)對(duì)臨床判斷腫瘤的惡性程度及疾病進(jìn)程具有一定的價(jià)值，但本研究對(duì)缺少尿液hCFHrp對(duì)膀胱癌的預(yù)后評(píng)估。研究顯示，不同尿液hCFHrp表達(dá)水平的膀胱癌患者，其 3年生存情況不同，hCFHrp 陽性患者3年生存率顯著低于陰性患者，提示尿液hCFHrp 水平可作為膀胱尿路上皮癌患者預(yù)后評(píng)估的參考依據(jù)[8]。

本研究將血尿等因素作為患者納入的排除標(biāo)準(zhǔn)，避免了因血尿等潛在干擾因素造成的假陽性結(jié)果，但臨床上膀胱癌患者及泌尿系統(tǒng)良性疾病患者時(shí)常合并血尿，因此，尿液hCFHrp檢測(cè)在臨床應(yīng)用中具有一定的局限性。本研究將進(jìn)一步選擇更接近臨床實(shí)際工作中的樣本，驗(yàn)證尿液中的血紅蛋白、膽紅素、清蛋白及尿酸等對(duì)尿液hCFHrp檢測(cè)的影響程度，并通過選擇不同的腫瘤標(biāo)志物與尿液hCFHrp聯(lián)合檢測(cè)，以提高對(duì)膀胱癌診斷的準(zhǔn)確性。