尚慶毅,梁偉

(1.贛榆區(qū)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科,江蘇連云港 222100；2.連云港市第二人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科,江蘇連云港 222023)

食管鱗狀細(xì)胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)是一種來(lái)源于食管鱗狀上皮黏膜細(xì)胞的惡性腫瘤，具有高侵襲性[1]。ESCC的轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)是導(dǎo)致患者病死率升高的最主要原因[2]，深入研究ESCC的發(fā)病機(jī)制及分子作用機(jī)制，對(duì)ESCC的早期診斷及預(yù)后判斷具有重要的臨床意義。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，LncRNA)是一類(lèi)長(zhǎng)度超過(guò)200個(gè)核苷酸、無(wú)編碼能力的RNA分子，在調(diào)控機(jī)體表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄后加工等過(guò)程中發(fā)揮重要作用，近年來(lái)，LncRNA在腫瘤進(jìn)展過(guò)程中的作用備受關(guān)注[3]。目前研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA linc00342在多種惡性腫瘤中表達(dá)上調(diào)，并可通過(guò)激活信號(hào)通路或分子機(jī)制參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[4-5]。然而LncRNA linc00342在ESCC中的表達(dá)情況目前尚不清楚。因此，本研究通過(guò)檢測(cè)ESCC患者組織中LncRNA linc00342的表達(dá)水平，分析其與患者臨床病理參數(shù)及預(yù)后的關(guān)系，初步討論其臨床意義。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2015年6月至2016年9月于贛榆區(qū)人民醫(yī)院接受ESCC根治術(shù)的89例ESCC患者癌組織及對(duì)應(yīng)的癌旁食管鱗狀上皮黏膜組織(距離癌組織>5 cm，且經(jīng)病理組織學(xué)證實(shí)無(wú)癌細(xì)胞)標(biāo)本為研究對(duì)象，術(shù)中獲取標(biāo)本立即置入液氮中保存。所有患者均經(jīng)消化內(nèi)鏡活檢或病理組織檢查確診，術(shù)前未接受任何放療、化療或抗腫瘤藥物等治療。排除合并其他惡性腫瘤或伴發(fā)器質(zhì)性損傷疾病或系統(tǒng)性疾病，如高血壓、糖尿病、慢性腎病等。89例ESCC患者中男51例，女38例，年齡46～82歲，中位年齡64歲，其中年齡<64歲43例，≥64歲46例；腫瘤位置：胸上段34例，胸中段29例，胸下段26例；分化程度：中分化或高分化49例，低分化或未分化40例；TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期36例，Ⅲ～Ⅳ期53例；發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移47例，淋巴結(jié)無(wú)轉(zhuǎn)移42例。同時(shí)收集患者隨訪資料，隨訪截止日期為2020年9月30日，隨訪時(shí)間8～59個(gè)月，中位隨訪時(shí)間28個(gè)月，分析ESCC患者總生存時(shí)間。本研究獲得贛榆區(qū)人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)文號(hào)：No.150024)，患者及家屬均知情同意。

1.2主要儀器及試劑 Trizol裂解液、SYBR Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒(日本TaKaRa公司)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國(guó)Applied Biosystem公司)。7500 Real-Time PCR系統(tǒng) (美國(guó)ABI公司)，UV 240紫外可見(jiàn)分分光度計(jì)(日本島津公司),Bio-Rad PCR擴(kuò)增儀(美國(guó)伯樂(lè)公司)。

1.3方法

1.3.1RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 取手術(shù)切除的組織樣本，加入2 mL Trizol裂解液后在冰面上研磨，充分研磨成勻漿，提取組織中的總RNA，利用UV 240紫外可見(jiàn)分光度計(jì)檢測(cè)總RNA純度和濃度，以吸光度(A260/280 nm)值在1.8～2.2之間為純度較好。提取的DNA置于-80 ℃保存。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以上操作均按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.3.2引物設(shè)計(jì)及qRT-PCR LncRNA linc00342及GAPDH引物序列參照文獻(xiàn)[6]設(shè)計(jì)，linc00342上游引物序列：5′-CGTTCCAATGTGTTGGGT-3′，下游引物序列：5′-TGGGAGGAGGTTGAGATG-3′；GAPDH上游引物序列：5′-CACCCACTCCTCCACCTTTG-3′，下游引物序列：5′-CCACCACCCTGTTGCTGTAG-3′。采用SYBR Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒及ABI 7500 Real-Time PCR系統(tǒng)進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)。qRT-PCR總反應(yīng)體系共20 μL，包括SYBR Green qPCR Mix 10 μL，cDNA 2 μL，10 μmol/L上、下游引物各1 μL，ddH2O 6 μL。PCR循環(huán)參數(shù)：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃ 45 s，60 ℃ 34 s，共40個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。采用2-△△Ct法計(jì)算LncRNA linc00342相對(duì)表達(dá)水平。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的錄入與分析。計(jì)數(shù)資料以n或%表示，生存分析采用Kaplan-Meier法，組間生存差異采用對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)(Log-Rank test)；利用ROC曲線評(píng)估LncRNA linc00342的表達(dá)水平對(duì)ESCC患者的預(yù)測(cè)價(jià)值。多因素Cox回歸分析影響ESCC患者預(yù)后不良的危險(xiǎn)因素分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1LncRNA linc00342在ESCC患者組織中的表達(dá)量 ESCC患者癌組織和癌旁組織中LncRNA linc00342的相對(duì)表達(dá)量分別為3.16±1.27、1.64±0.51，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=10.478，P<0.001)。

2.2LncRNA linc00342表達(dá)與ESCC患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系 LncRNA linc00342的表達(dá)水平與ESCC患者年齡、性別、腫瘤位置、分化程度無(wú)關(guān)(P>0.05)，而與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 LncRNA linc00342表達(dá)與ESCC患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系

2.3LncRNA linc00342預(yù)測(cè)ESCC的ROC曲線分析 以LncRNA linc00342的表達(dá)水平預(yù)測(cè)ESCC的ROC曲線下面積(AUCROC)為0.903(95%CI：0.874～0.938，P<0.001)，當(dāng)cut-off值為2.33時(shí)，其敏感性為80.90%，特異性為89.13%，約登指數(shù)為0.730。見(jiàn)圖1。

圖1 LncRNA linc00342預(yù)測(cè)ESCC的ROC曲線

2.4LncRNA linc00342表達(dá)與ESCC患者生存時(shí)間的關(guān)系 根據(jù)ESCC組織中LncRNA linc00342表達(dá)水平的中位數(shù)(3.03)將ESCC患者分為高表達(dá)組(46例)和低表達(dá)組(43例)，生存分析結(jié)果顯示，LncRNA linc00342高表達(dá)患者累積生存率為21.74%，平均生存時(shí)間25.5個(gè)月(95%CI：20.247～30.753)；LncRNA linc00342低表達(dá)患者累積生存率為55.81%，平均生存時(shí)間44.86個(gè)月(95%CI：39.83～49.89)，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Log-rankχ2=20.896，P=0.000)。見(jiàn)圖2。

圖2 LncRNA linc00342表達(dá)水平與ESCC患者生存時(shí)間的關(guān)系

2.5影響ESCC患者預(yù)后不良的單因素分析 單因素分析結(jié)果顯示，TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及LncRNA linc00342表達(dá)水平是影響ESCC患者預(yù)后不良的危險(xiǎn)因素(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 影響ESCC患者預(yù)后不良的單因素分析[n(%)]

2.6影響ESCC患者預(yù)后不良的多因素Cox回歸分析 多因素Cox回歸分析結(jié)果顯示，臨床分期為Ⅲ～Ⅳ期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、LncRNA linc00342高表達(dá)是影響ESCC患者預(yù)后不良的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 影響ESCC患者預(yù)后不良的多因素Cox回歸分析

3 討論

近年來(lái)，LncRNA在ESCC中的作用越來(lái)越受到重視。研究表明，多種LncRNAs在ESCC組織中呈異常表達(dá)，可參與癌癥的轉(zhuǎn)移侵襲，并可能成為潛在的治療靶標(biāo)[7]。楊毅等[8]利用基因芯片技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，LncRNA linc00152在ESCC組織中的表達(dá)顯著上調(diào)，其表達(dá)量與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，并對(duì)ESCC轉(zhuǎn)移具有較高診斷價(jià)值，提示LncRNA linc00152可能是ESCC轉(zhuǎn)移及預(yù)后判斷的新的生物學(xué)指標(biāo)。

本研究結(jié)果顯示，LncRNA linc00342在ESCC患者癌組織中的表達(dá)水平顯著高于癌旁組織，表明LncRNA linc00342在ESCC組織中呈高表達(dá)，可能發(fā)揮癌基因作用。另有研究發(fā)現(xiàn)[9]，在非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)患者組織和血清中LncRNA linc00342表達(dá)上調(diào)，其高表達(dá)與較差的總生存期相關(guān)，并進(jìn)一步證實(shí)其可通過(guò)PTEN和p53通路富集，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，發(fā)揮癌基因作用。近年來(lái)，LncRNA linc00342在消化道腫瘤中的作用逐漸受到人們關(guān)注。曾偉等[10]利用基因芯片重注釋發(fā)現(xiàn)LncRNA linc00342與肝細(xì)胞癌術(shù)后復(fù)發(fā)顯著相關(guān)，并利用基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)與功能富集分析發(fā)現(xiàn)LncRNA linc00342主要富集到“細(xì)胞周期”相關(guān)生物學(xué)功能與通路，提示LncRNA linc00342可能參與消化道腫瘤細(xì)胞周期紊亂而導(dǎo)致的惡性增殖。結(jié)合ESCC患者臨床病理資料推測(cè)，LncRNA linc00342可能由于ESCC細(xì)胞周期紊亂而發(fā)生異常表達(dá)，并與TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。

本研究利用ESCC組織中LncRNA linc00342的表達(dá)水平預(yù)測(cè)ESCC的ROC曲線下面積為0.903，提示LncRNA linc00342對(duì)ESCC具有較高的預(yù)測(cè)價(jià)值，由于本研究納入的病例數(shù)較少，仍需更大樣本量進(jìn)行驗(yàn)證。此外，生存分析結(jié)果顯示，LncRNA linc00342高表達(dá)患者的5年累積生存率明顯低于低表達(dá)患者。進(jìn)一步行單因素分析和Cox回歸分析顯示，TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及LncRNA linc00342高表達(dá)是影響ESCC患者預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，提示LncRNA linc00342可能作為預(yù)測(cè)ESCC患者預(yù)后的潛在生物學(xué)指標(biāo)。

綜上所述，ESCC組織中LncRNA linc00342呈高表達(dá)，其表達(dá)水平與腫瘤TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，LncRNA linc00342表達(dá)水平升高提示ESCC患者預(yù)后不良風(fēng)險(xiǎn)增加，可能作為預(yù)測(cè)ESCC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及預(yù)后不良的潛在生物學(xué)指標(biāo)，但其中具體的作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。