譚建新，王艷，林穎，馮浩洋，周冉，許爭峰

(南京醫(yī)科大學(xué)附屬婦產(chǎn)醫(yī)院&南京市婦幼保健院產(chǎn)前診斷中心，南京210004)

Dandy-Walker綜合征(Dandy-Walker syndrome, DWS, OMIM 220200)是一種罕見的胚胎時期的神經(jīng)系統(tǒng)先天性發(fā)育畸形，影像學(xué)檢查表現(xiàn)為顱后窩的異常，包括小腦蚓部發(fā)育不良、第四腦室囊性擴大及小腦延髓池擴張等，其發(fā)病率約為1/35 000～1/25 000[1-2]。X染色體長臂2區(qū)8帶(Xq28)重復(fù)綜合征(OMIM 300005)是一種罕見的X連鎖隱性遺傳病，主要臨床表現(xiàn)為智力發(fā)育遲緩、肌張力低下、語言發(fā)育落后、反復(fù)呼吸道感染、癲癇、孤獨癥樣表現(xiàn)等。由于Xq28區(qū)域包含了導(dǎo)致Rett綜合征的致病基因甲基化CpG結(jié)合蛋白2基因(Methyl-CpG binding protein 2,MECP2)，因此又被稱為MECP2重復(fù)綜合征[3]。然而，DWS合并Xq28重復(fù)綜合征的病例國內(nèi)尚未見文獻報道。本研究對1例超聲檢查提示為DWS和先天性心臟病的胎兒及父母進行分子遺傳學(xué)分析，以期明確6p25.3p25.1微缺失和Xq28重復(fù)為胎兒畸形的遺傳學(xué)病因，并且證實該6p25.3p25.1微缺失和Xq28重復(fù)為新發(fā)變異，從而為懷孕夫婦提供明確的遺傳學(xué)診斷和遺傳咨詢。

1 研究對象與方法

1.1研究對象 孕婦， 28歲，孕23+周超聲提示：“小腦下蚓部見0.70 cm的裂隙，右心室游離壁增厚，室間隔見0.17 cm的回聲失落，升主動脈內(nèi)徑0.25 cm，主動脈峽部內(nèi)徑0.16 cm，主肺動脈內(nèi)徑0.48 cm，Dandy-Walker綜合征和先天性心臟病可能”來我科進行遺傳咨詢。否認染色體相關(guān)遺傳病家族史，否認孕期有毒或有害物質(zhì)接觸史。經(jīng)遺傳咨詢和充分知情同意后，家屬選擇放棄胎兒，行引產(chǎn)術(shù)。為進一步明確胎兒先天發(fā)育異常的遺傳學(xué)病因，取胎兒皮膚組織進行染色體微陣列分析，采集父母外周血進行熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization, FISH)分析。

1.2方法

1.2.1基因組DNA提取 采用全自動核酸提取儀(廈門芮寶生醫(yī)股份公司)提取胎兒皮膚基因組DNA并用NanoDrop 2000超微量分光光度計(美國賽默飛世爾科技公司)測定DNA濃度及純度。

1.2.2單核苷酸多態(tài)性微陣列分析(single nucleotide polymorphism array, SNP array) 采用CytoScan 750K芯片(美國Affymetrix公司)進行，該芯片包含55萬拷貝數(shù)變異(copy nu Mber variations, CNVs)探針和20萬單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms, SNP)探針，平均探針距離約為4 100 bp。按照標(biāo)準實驗流程進行操作，取500 ng DNA進行限制性內(nèi)切酶消化、連接后進行PCR擴增，對擴增產(chǎn)物純化、定量分析、片段化后，進行標(biāo)記并與芯片進行雜交反應(yīng)和染色，使用GeneChip Scanner 3000 7G掃描儀掃描芯片，采用Chromosome Analysis Suite (ChAS)軟件分析拷貝數(shù)變化。

1.2.3熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization, FISH) 采用XYpter/XYqter和6pter/6qter探針(美國Vysis公司)對胎兒父母的外周血樣本進行FISH分析，按照本課題組前期試驗步驟操作[4]，其中XYpter和6pter探針為綠色信號，XYqter和6qter探針為紅色信號。取2 mL外周血樣本進行體外培養(yǎng)，制片后將玻片置于68 ℃烤片20 min，將玻片置于檸檬酸鈉緩沖液中浸泡5 min，再依次置于70%、85%、無水乙醇中脫水，待玻片完全自然晾干后，置于預(yù)熱好的70%甲酰胺中變性2 min，隨后依次置于-20 ℃中的70%、80%、無水乙醇中脫水，加入探針，加蓋玻片，用封片膠封片，置于37 ℃恒溫箱溫育過夜。次日，移除蓋玻片，立即將玻片浸入75 ℃、含0.3%NP-40的檸檬酸鈉緩沖液中，漂洗2 min，再置于含0.1% NP-40的檸檬酸鈉緩沖液中，漂洗30 s，取出避光晾干，加入4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride, DAPI)復(fù)染劑至目標(biāo)區(qū)域，立即蓋上蓋玻片。暗處靜置10～20 min后鏡檢。

1.2.4多重連接依賴探針擴增技術(shù)(multiplex ligation-dependent probe amplification, MLPA) 按照MPLA P095和P070試劑盒(荷蘭MRC公司)說明書進行檢測，其中P070試劑盒主要用于23對染色體亞端粒區(qū)域微缺失微重復(fù)的檢測，P095試劑盒主要用于21、18、13、X、Y染色體非整倍體的檢測。按照荷蘭MRC公司提供的標(biāo)準實驗流程進行操作，包括變性、雜交、連接及擴增，擴增產(chǎn)物采用ABI 3500基因分析儀(美國賽默飛世爾科技公司)檢測，數(shù)據(jù)分析采用Coffalyser V8.0軟件進行。

2 結(jié)果

2.1SNP array檢測結(jié)果 本研究檢測結(jié)果顯示，胎兒6號染色體p25.3p25.1區(qū)段存在約5.4 Mb大小的拷貝數(shù)缺失：arr[hg19] 6p25.3p25.1(380,807-5,803,721)×1，該區(qū)段缺失可引起“6p末端缺失綜合征”，含關(guān)鍵致病基因FOXC1(OMIM 601090)、TUBB2A(615101)和TUBB2B(612850)；X染色體q28區(qū)段存在約4.2 Mb大小的拷貝數(shù)重復(fù)：arr[hg19] Xq28(151,042,968-155,233,098)×2，該區(qū)段重復(fù)可引起“Xq28重復(fù)綜合征”，均為致病性的CNVs(圖1)。

2.2胎兒MLPA檢測結(jié)果 采用MLPA試劑盒檢測胎兒樣本結(jié)果顯示，位于Xq28區(qū)域的L1細胞粘附分子(L1 cell adhesion molecule,L1CAM)基因的探針信號強度升高了約50%(圖2A)，而位于6p25.3區(qū)域的干擾素調(diào)節(jié)因子4(interferon regulatory factor 4,IRF4)基因的探針信號強度下降了約50%(圖2B)，進一步驗證了SNP array的結(jié)果。

注:A,6p25.3p25.1區(qū)域檢出約5.4 Mb缺失； B,Xq28區(qū)域檢出約4.2 Mb重復(fù)。

注:A,Xq28區(qū)域L1CAM基因探針信號強度升高；B，6p25.3區(qū)域IRF4基因探針信號強度下降。

2.3FISH檢測結(jié)果 胎兒父母外周血的FISH分析顯示未發(fā)現(xiàn)相關(guān)片段的缺失、重復(fù)或易位等異常，提示胎兒致病性的CNVs為新發(fā)變異(圖3)。

注：胎兒的父(A)母(B)外周血樣本目標(biāo)區(qū)域內(nèi)均未檢測到缺失、重復(fù)及易位。

3 討論

在本研究中，筆者通過對超聲檢查提示為DWS和先天性心臟病的引產(chǎn)胎兒進行SNP array分析，并對其父母進行驗證分析，明確了胎兒同時攜帶6p25.3p25.1缺失和Xq28重復(fù)，均為致病性變異。其父母均不攜帶上述變異，提示胎兒致病性的變異為新發(fā)變異。6p25.3p25.1缺失合并Xq28重復(fù)國內(nèi)目前尚未見文獻報道。

DWS的病因目前尚不完全清楚，并存在一定的爭議。普遍的觀點認為是由遺傳因素和環(huán)境因素共同作用導(dǎo)致的。這些環(huán)境因素包括母體糖尿病、酒精、華法林的長期服用、弓形蟲感染、病毒(風(fēng)疹病毒、巨細胞病毒)感染等。遺傳因素包括染色體異常，或某些單基因遺傳綜合征的表型之一，如Joubert綜合征、Golden綜合征、Meckel-Gruber綜合征等[1,5]。研究表明，約有40%的DWS與染色體異常有關(guān)，主要包括3號、9號、13號和18號染色體等[6]。本研究中，筆者采用SNP array技術(shù)對超聲提示DWS綜合征和先天性心臟病的胎兒樣本進行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該樣本同時存在6p25.3p25.1區(qū)段5.4 Mb的拷貝數(shù)缺失和Xq28區(qū)段4.2 Mb的拷貝數(shù)重復(fù)。其中，6p25.3p25.1區(qū)段為6p末端缺失。目前已有學(xué)者報道了6p末端缺失導(dǎo)致的綜合征，主要臨床表型包括小腦蚓部發(fā)育不全、眼距寬、小頭畸形、進行性感音神經(jīng)性耳聾、先天性心臟缺陷、精神發(fā)育遲緩等[7]。因此，筆者推測本研究發(fā)現(xiàn)的胎兒樣本6p25.3p25.1缺失可能與其先天性心臟病表型有關(guān)。最近，羅玉琴等[8]報道了1例6p25.3p25.1區(qū)段4 266 kb缺失的DWS胎兒，該區(qū)段包括了FOXC1(OMIM 601090)、TUBB2A(615101)和TUBB2B(612850)等22個OMIM基因。筆者通過檢索DECIPHER數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)，本例胎兒的6p25.3p25.1(380,807-5,803,721)區(qū)段也包含F(xiàn)OXC1(OMIM 601090)、TUBB2A(615101)和TUBB2B(612850)等26個OMIM基因。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXC1基因缺失與小腦、后顱窩畸形相關(guān)，包括小腦蚓部發(fā)育不全，小腦延髓池擴大和Dandy-Walker畸形等[7]。Aldinger等[9]的研究表明，F(xiàn)OXC1基因敲除小鼠小腦蚓部發(fā)育不全并伴有內(nèi)側(cè)融合和葉狀缺損。因此，本例胎兒樣本的染色體缺失片段包括FOXC1基因，可推測其與Dandy-Walker畸形的發(fā)生有關(guān)。

Xq28重復(fù)綜合征又稱為Lubs綜合征，于1999年由Peters等[3]首次報道，由X染色體長臂2區(qū)8帶重復(fù)引起，主要臨床表型包括中重度智力低下、嬰兒期肌張力低下、語言發(fā)育落后、反復(fù)呼吸道感染等。該綜合征男性發(fā)病率高于女性，可能與X染色體的隨機失活有關(guān)。本例胎兒的重復(fù)區(qū)域arr[hg19] Xq28(151,042,968-155,233,098)包含87個OMIM基因，其中MECP2(OMIM 300005)基因是Xq28重復(fù)綜合征的主要致病基因。該基因廣泛表達于人體的多個組織，在腦組織中的表達尤為豐富[10]。研究表明，在小鼠中過表達MECP2基因?qū)е逻\動協(xié)調(diào)障礙、焦慮加劇、學(xué)習(xí)和記憶障礙，并伴有長期增強和短期突觸可塑性障礙[11]。而MECP2基因的突變和缺失會導(dǎo)致Rett綜合征[12]。

綜上，本研究對1例超聲提示DWS和先天性心臟病的引產(chǎn)胎兒進行SNP array分析，證實該胎兒同時攜帶6p25.3p25.1缺失和Xq28重復(fù)，均為致病性變異。對于超聲異常的胎兒，采用SNP array進行診斷，可發(fā)現(xiàn)臨床相關(guān)的CNVs，為更準確的遺傳咨詢提供依據(jù)。