劉靜，鄧槿，顧季煒，馬欣玥，宋國齊，2b

(1.南通大學醫(yī)學院，江蘇南通226001；2.南通大學附屬醫(yī)院 a.檢驗科，b.血液科，江蘇南通226001)

彌漫大B細胞淋巴瘤(diffuse large B cell lymphoma，DLBCL)是成人非霍奇金淋巴瘤(NHL)最常見的亞型，每年約占新診斷NHL病例的25%～35%，是一種高度侵襲性疾病，其免疫表型、遺傳學、臨床表現(xiàn)及預(yù)后都極具異質(zhì)性[1-2]。目前，臨床使用的利妥昔單抗聯(lián)合環(huán)磷酰胺、蒽環(huán)類、長春新堿及潑尼松(R-CHOP)一線治療方案雖明顯改善了DLBCL患者的預(yù)后，但仍有部分包含雙打擊/三打擊(伴有MYC和BCL2/BCL6重排)的患者表現(xiàn)出對利妥昔單抗耐藥，預(yù)后差[3]。目前國內(nèi)外對于雙打擊/三打擊淋巴瘤(DHI/THL)尚無統(tǒng)一、有效的治療方案。因此，了解利妥昔單抗獲得性耐藥的機制對于提高利妥昔單抗療效以及改善預(yù)后具有至關(guān)重要的意義。Smarcal1是一種DNA重塑蛋白質(zhì)，它可以通過穩(wěn)定、修復(fù)和重啟停滯的復(fù)制叉以應(yīng)對MYC等癌基因誘導(dǎo)的DNA復(fù)制壓力。Puccetti等[4]發(fā)現(xiàn)，Smarcal1缺乏會減慢轉(zhuǎn)基因小鼠(Eμ-myc)淋巴瘤形成并提高生存率。B56-α及B55-α為PP2A調(diào)節(jié)亞基，研究發(fā)現(xiàn)，B56α-PP2A全酶在DT-061(SMAP)特異性結(jié)合下，可選擇性地對c-Myc去磷酸化，從而誘導(dǎo)細胞死亡和抑制腫瘤生長[5]。有學者還發(fā)現(xiàn)，Eya3可通過B55-α調(diào)控c-Myc中pT58去磷酸化過程促進腫瘤進展[6]。本研究擬參照Jazirehi等[7]的研究，采用“梯度加藥法”誘導(dǎo)DLBCL細胞系耐藥并進行驗證；檢測親本及耐藥細胞系中Smarcal1、PP2A-B55-α和PP2A-B56-α蛋白表達變化；進一步干擾耐藥細胞系中Smarcal1、PP2A-B55-α的表達以及過表達PP2A-B56-α，評估其對利妥昔單抗敏感性改變。

1 材料與方法

1.1主要試劑與儀器 健康人血漿(南通大學附屬醫(yī)院體檢健康者)，RPMI-1640培養(yǎng)基及胎牛血清FBS(美國Gibco公司)，SDS-PAGE凝膠配制試劑盒及CCK-8試劑盒(上海碧云天公司)，AnnexinV-FITC/PI雙染細胞凋亡試劑盒(江蘇凱基生物公司)，利妥昔單抗注射液(上海羅氏制藥公司)，鼠抗人PP2A-B55-α單克隆抗體及PP2A-B56-α單克隆抗體(美國Santa Cruz Biotechnology公司)，兔抗人 Smarcal1單克隆抗體以及GAPDH單克隆抗體(美國 cell signaling technology公司)，sh-Smarcal1、sh-PP2A-B55-α和oe-PP2A-B56-α 以及其陰性轉(zhuǎn)染對照(sh-NC、oe-vector)由廣州銳博生物科技公司設(shè)計及合成，LipofectamineTM2000 轉(zhuǎn)染試劑以及Trizol 試劑(美國Invitrogen公司)。酶聯(lián)儀(美國 Biotek公司)，流式細胞儀(美國BD公司)，蛋白免疫印跡電泳設(shè)備及化學發(fā)光成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)，ABI 7500熒光定量PCR儀(美國ABI公司)。

1.2細胞來源及培養(yǎng) 人彌漫大B細胞淋巴瘤細胞系OCI-LY10、OCI-LY18均購自中國科學院細胞庫上海保藏中心，取上述生長狀態(tài)良好的細胞系，培養(yǎng)于含10% FBS、1%青霉素-鏈霉素的RPMI-1640完全培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2、100%飽和濕度CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，每2～3 d換液1次，以1 000 r/min離心5 min,重懸于T75 cm培養(yǎng)瓶中，取對數(shù)生長期細胞用于后續(xù)實驗。

1.3耐藥細胞系模型的建立 采用“梯度加藥法”誘導(dǎo)DLBCL細胞的耐藥：分別將處于生長對數(shù)期的DLBCL細胞系OCI-LY10、OCI-LY18以5×105/mL的細胞密度接種于含10%新鮮健康人血漿的RPMI-1640培養(yǎng)基中，加入0.5 μg/mL濃度利妥昔單抗，12 h后換完全培養(yǎng)基培養(yǎng)至細胞狀態(tài)恢復(fù)正常(約為4～5 d)，在下1個周期將利妥昔單抗的濃度提高至前1個周期的2倍，按此方式重復(fù)9個周期后，獲得對128 μg/mL利妥昔單抗耐藥的淋巴瘤細胞系。

1.4CCK-8法檢測細胞存活率 將親本及耐藥細胞系分別重懸于RPMI-1640完全培養(yǎng)基以及含10%新鮮健康人血漿RPMI-1640培養(yǎng)基中，分別接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔含細胞為5×104個，分別加入濃度為0、2、10、50 和100 μg/mL利妥昔單抗，每個樣本設(shè)3個復(fù)孔，溫育48 h后，按照CCK-8試劑盒說明書操作，在酶聯(lián)儀上檢測450 nm波長處的吸光度(A)值，計算細胞存活率。細胞存活率(%)=[A(加藥組)-A(空白組)]/[A(對照組)-A(空白組)]×100。采用SPSS 13.0軟件分析藥物的半數(shù)生長抑制濃度(IC50)值，并計算耐藥指數(shù)。耐藥指數(shù)(resistance index，RI)=耐藥株IC50/親本株IC50。

1.5流式細胞術(shù)檢測調(diào)亡 將親本及耐藥細胞系分別重懸于RPMI-1640完全培養(yǎng)基以及含10%新鮮健康人血漿RPMI-1640培養(yǎng)基中，每種細胞系均分為2組：control組(0 μg/mL利妥昔單抗組)和50 μg/mL利妥昔單抗組，每組設(shè)3個復(fù)孔，置于37 ℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。48 h后收集細胞，1 000 r/min離心5 min，PBS沖洗2次，Binding buffer緩沖液重懸細胞，分別加入FITC-AnnexinV和PI染料各5 μL，避光溫育20 min， buffer緩沖液補足體積至500 μL。BD流式細胞儀檢測細胞凋亡率，采用BD分析軟件收集熒光信號，F(xiàn)lowJo軟件進行統(tǒng)計分析。細胞凋亡率=早期凋亡率(AnnexinV+/PI-)+晚期凋亡率(AnnexinV+/PI+)，實驗重復(fù)3次。

1.6總蛋白質(zhì)提取及western blot 收集LY10及LY18的親本及耐藥細胞系，預(yù)冷PBS洗滌2次后加入RIPA 蛋白質(zhì)裂解液，冰浴裂解提取總蛋白質(zhì)，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，吸取上清液采用BCA法測定蛋白質(zhì)濃度。按照制膠試劑盒說明書，取變性后蛋白質(zhì)15 μL(30 μg)加入至125 g/L PAGE凝膠中(上層膠恒壓 80 V,恒壓120 V)，電泳結(jié)束后在300 mA恒壓條件下2 h將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，50 g/L脫脂奶粉封閉1 h。加入鼠抗人PP2A-B55-α單克隆抗體(1∶500稀釋)、鼠抗人PP2A-B56-α單克隆抗體(1∶500稀釋)、兔抗人Smarcal1單克隆抗體(1∶800稀釋)以及兔抗人GAPDH單克隆抗體(1∶800稀釋) 4 ℃溫育過夜。TBST洗膜3次，每次10 min，結(jié)束后分別加入HRP標記的羊抗鼠IgG(1∶5 000稀釋)和HRP 標記的羊抗兔IgG(1∶5 000稀釋)后室溫下避光溫育2 h，TBST洗膜5次，每次10 min，ECL化學發(fā)光法顯影后經(jīng)化學發(fā)光成像系統(tǒng)曝光檢測目的條帶，Image J 4.1 軟件對條帶進行灰度掃描，GraphPad Prism 8.0軟件進行結(jié)果統(tǒng)計分析。目的蛋白相對表達量=目的蛋白灰度值/內(nèi)參蛋白灰度值，實驗重復(fù)3次。

1.7細胞轉(zhuǎn)染 將2株耐藥細胞重懸于含10%新鮮健康人血漿的RPMI-1640培養(yǎng)基中，接種于12孔細胞培養(yǎng)板，每孔含細胞為5×104個，按照LipofectamineTM2000說明書操作進行轉(zhuǎn)染，將2株耐藥細胞均分為sh-NC組(NC shRNA轉(zhuǎn)染組)、oe-vector組(vector oeRNA 轉(zhuǎn)染組)、sh-Smarcal1組(Smarcal1 shRNA轉(zhuǎn)染組)、sh-PP2A-B55-α組(PP2A-B55-α shRNA轉(zhuǎn)染組)及oe-PP2A-B56-α組(PP2A-B56-α oeRNA轉(zhuǎn)染組)，每組設(shè)置3個復(fù)孔，其中取1個復(fù)孔轉(zhuǎn)染24 h 后用于CCK-8法檢測(方法同1.4，向耐藥細胞及轉(zhuǎn)染后的耐藥細胞中分別加入0、2、10、50、100 μg/mL利妥昔單抗)，其余2個復(fù)孔細胞轉(zhuǎn)染48 h后用于驗證蛋白質(zhì)表達。實驗重復(fù)3次。

1.8RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)及實時熒光定量PCR(RT-qPCR) 收集實驗1.7中轉(zhuǎn)染48 h后的細胞系(約5×106個)于1.5 mL無酶EP管中，各加入1 mL Trizol試劑提取總RNA，NanoDrop 2000超微量分光光度計測定總RNA濃度和比值(A260/280 nm為1.8～2.0)。取1 μg RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。樣本置于-20 ℃保存。采用RT-qPCR檢測各組sh-Smarcal1、sh-PP2A-B55-α及oe-PP2A-B56-α轉(zhuǎn)染耐藥細胞系前后的表達水平，根據(jù)NCBI參考序列Smarcal1、PP2A-B55-α、PP2A-B56-α(分別為NC_000002.12、NC_000008.11、NC_000001.11)，由廣州銳博生物科技公司使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計及合成。Smarcal1上游引物序列：5′-AGGCCACAGTCCACGTAGT-3′,下游引物序列：5′-GCTGTTGTTTAGGGACCTCTGG-3′；PP2A-B55-α上游引物序列：5′-CCACCTTTATCTCCTGTTGC-3′，下游引物序列：5′-TTTCTCAGGTGAAAGGAGCAG-3′；PP2A-B56-α上游引物序列：5′-CGGGATCCATGTCGTCGCCGTCGCCGC-3′，下游序列：5′-CCGCTCGAGTTATTTGGCACTGGTACTGCTGCG-3′；GAPDH上游序列：5′-GGTCACCAGGGCTGCTTTTA-3′，下游序列：5′-GGATCTCGCTCCTGGAAGATG-3′。PCR反應(yīng)體系為20 μL，包括：10 μmol/L上、下引物各0.5 μL，2×SYBR Green Mix 10 μL，cDNA 2 μL，DEPC水7 μL。PCR循環(huán)參數(shù)：95 ℃預(yù)變性10 min;95 ℃ 2 s，60 ℃ 20 s，70 ℃ 10 s，共40個循環(huán)。利用StepOneTM軟件于62 ℃時進行熔解曲線分析。以GAPDH為內(nèi)參照，采用2-ΔΔCt法計算相對表達量，ΔΔCt =(實驗組Ct目的基因-實驗組Ct內(nèi)參基因)-(對照組Ct目的基因-對照組Ct內(nèi)參基因)，每個樣本設(shè)置3個復(fù)孔并取平均值。

2 結(jié)果

2.1利妥昔單抗耐藥DLBCL細胞系鑒定結(jié)果 應(yīng)用CCK-8法檢測耐藥細胞系的存活率結(jié)果表明，在0、2、10、50 和100 μg/mL的利妥昔單抗作用下，LY10及LY10RR細胞的IC50分別為(0.91±0.07) μg/mL和(287.40±26.30) μg/mL，耐藥指數(shù)為315.58；LY18及LY18RR細胞的IC50分別為(4.73±0.24) μg/mL和(532.10±37.95) μg/mL，耐藥指數(shù)為112.41，二者差異有統(tǒng)計學意義(t值分別為10.51和15.18，P均<0.001)。各細胞系細胞存活率結(jié)果見圖1。

注：A，LY10及LY10RR細胞存活率；B，LY18及LY18RR細胞存活率。

2.2利妥昔單抗處理親本與耐藥細胞系的凋亡差異 50 μg/mL利妥昔單抗處理48 h后，LY10RR和LY18RR細胞的凋亡率分別為(7.28±1.25)%、 (6.41±1.46)%，與對照組LY10RR和LY18RR細胞的凋亡率分別為(4.94±0.79)%、(4.07±1.35)%相比，差異均無統(tǒng)計學意義(t值分別為2.86和2.90，P值分別為0.06和0.05)，而利妥昔單抗處理48 h后，LY10和LY18細胞的凋亡率分別為(30.42±5.52)%、(26.46±2.34)%，與對照組LY10和LY18細胞的凋亡率分別為(4.09±0.73)%、(3.21±0.32)%相比，差異有統(tǒng)計學意義(t值分別為10.50和9.86，P均<0.001)。見圖2。

注：A、B，LY10RR以及利妥昔單抗處理LY10RR 48 h后的凋亡比率；C、D，LY10以及利妥昔單抗處理LY10 48 h后的凋亡比率；E、F，LY18RR以及利妥昔單抗處理LY18RR 48 h后的凋亡比率；G、H，LY18以及利妥昔單抗處理LY18 48 h后的凋亡比率。

2.3western blot檢測 Smarcal1、PP2A-B55-α及PP2A-B56-α蛋白在親本與耐藥 DLBCL 細胞系中的表達情況 結(jié)果顯示，與親本細胞相比，在發(fā)生利妥昔單抗耐藥細胞系中，Smarcal1和PP2A-B55-α表達量均增加，PP2A-B56-α表達水平下降，且差異均具有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)。見表1、圖3。

表1 western blot檢測Smarcal1、 PP2A-B55-α及PP2A-B56-α在親本和耐藥細胞系中的表達

圖3 western blot檢測Smarcal1、PP2A-B55-α及PP2A-B56-α在親本及耐藥 DLBCL 細胞系中的表達

2.4RT-qPCR檢測耐藥細胞系sh-Smarcal1、sh-PP2A-B55-α及oe-PP2A-B56-α的轉(zhuǎn)染效率 結(jié)果表明，相對于sh-NC組(均為1.00±1.00)，sh-Smarcal1組LY10RR和LY18RR耐藥細胞系中Smarcal1的表達水平均明顯下調(diào)(分別為0.45±0.05、 0.41±0.07)，差異均有統(tǒng)計學意義(t值分別為10.50、8.56，P均<0.01)；sh-PP2A-B55-α組中PP2A-B55-α的表達水平均明顯下調(diào)(分別為 0.51±0.05、0.45±0.06)，差異均有統(tǒng)計學意義(t值分別為10.05、9.39，P均<0.01)；相對于oe-vector組(均為 1.00±1.00)，oe-PP2A-B56-α組中PP2A-B56-α的表達水平明顯上調(diào)(分別為2.33±0.13、3.067±0.23)，差異有統(tǒng)計學意義(t值分別為10.05、8.86，P均<0.01)。

2.5轉(zhuǎn)染后耐藥細胞對利妥昔單抗耐藥性的影響 轉(zhuǎn)染后的LY10RR和LY18RR在2、10、50 和100 μg/mL的利妥昔單抗刺激48 h后，經(jīng)CCK-8法檢測結(jié)果顯示，sh-Smarcal1組的細胞活力明顯低于sh-NC組(F值分別為226.9和67.1，P<0.01)，sh-PP2A-B55-α組的細胞活力明顯低于sh-NC組(F值分別為592.7和377.2，P<0.01)，oe-PP2A-B56-α組的細胞活力明顯低于oe-vector組(F值分別為734.5和219.9，P<0.01)。見表2、圖4。

表2 CCK8法檢測不同濃度利妥昔單抗處理不同細胞系的細胞存活率

注：A，CCK-8法檢測不同濃度利妥昔單抗對轉(zhuǎn)染sh-Smarcal1、sh-PP2A-B55-α及oe-PP2A-B56-α后LY10RR細胞活力的影響；B，CCK-8法檢測不同濃度利妥昔單抗對轉(zhuǎn)染 sh-Smarcal1、sh-PP2A-B55-α及oe-PP2A-B56-α后LY18RR細胞活力的影響。

3 討論

Puccetti等[4]通過持續(xù)調(diào)控MYC失調(diào)，產(chǎn)生慢性復(fù)制應(yīng)激，從而誘導(dǎo)B細胞淋巴瘤形成，證實了Smarcal1的雙等位基因失活可抑制腫瘤的進展，提示惡性腫瘤可能依賴于Smarcal1以穩(wěn)定復(fù)制叉并完成復(fù)制。在本研究中，成功構(gòu)建了穩(wěn)定的利妥昔單抗耐藥的“雙重打擊”淋巴瘤衍生細胞系LY10RR和LY18RR，并發(fā)現(xiàn)在耐藥株中Smarcal1表達量明顯增加；而進一步干擾Smarcal1表達后，發(fā)現(xiàn)利妥昔單抗對耐藥細胞系的細胞毒作用均增強。這與Puccetti等[4]的研究結(jié)果較為一致，均證實抑制Smarcal1可延緩淋巴瘤形成。但本實驗還進一步證實了Smarcal1與DLBCL治療中利妥昔單抗耐藥相關(guān)。

MYC基因和蛋白磷酸酶2A(protein phosphatase2A，PP2A)的失活是癌癥中常見的2種類型，該2種蛋白質(zhì)均為細胞增殖、凋亡和分化的重要調(diào)節(jié)因子，它們直接或間接調(diào)節(jié)彼此的生物活性。研究表明，針對MYC/PP2A通路是臨床上可行的治療策略[8]。PP2A的特定功能通常由其包含的特定調(diào)節(jié)亞基——B亞基控制。Leonard等[5]研究發(fā)現(xiàn)，DT-061(SMAP)可以特異性穩(wěn)定B56α-PP2A全酶，使后者可選擇性的對底物c-Myc等去磷酸化，從而誘導(dǎo)細胞死亡和抑制腫瘤生長。Zhang等[6]研究發(fā)現(xiàn)，Eya3可通過PP2A的B55-α亞基控制c-Myc基因的pT58位點發(fā)生去磷酸化，從而促進腫瘤的進展。在本研究中發(fā)現(xiàn)耐藥株中PP2A-B55-α表達量增加以及PP2A-B56-α表達量下降；進一步在2株耐藥細胞中分別干擾PP2A-B55-α和過表達PP2A-B56-α，發(fā)現(xiàn)利妥昔單抗對LY10RR和LY18RR的細胞毒作用均增強。本研究結(jié)果與Leonard等[5]和Zhang等[6]的研究結(jié)果類似，均證實了在彌漫大B細胞淋巴瘤中抑制PP2A-B55-α蛋白的表達或增強PP2A-B56-α蛋白表達會增強其對利妥昔單抗的敏感性。因此，筆者認為Smarcal1、PP2A-B55-α和PP2A-B56-α均可導(dǎo)致MYC基因失調(diào)，促進細胞的增殖，從而在利妥昔單抗耐藥形成過程中發(fā)揮重要作用。然而，本研究僅檢測上述3種蛋白質(zhì)在利妥昔單抗耐藥前后DLBCL細胞中的表達水平變化，對其下游的相互作用靶點尚未確定。今后還需要進一步深入的研究來闡明其在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中的分子機制，以確認Smarcal1、PP2A-B55-α和PP2A-B56-α作為利妥昔單抗耐藥DLBCL治療和診斷靶點的潛能。