劉迎生，焦洪超，林 海，王曉鵑*

(1.山東農業(yè)大學動物科技學院，泰安 271018;2.山東海鼎農牧有限公司，濟南 250113)

生長環(huán)境是決定家禽生長的一個關鍵因素，尤其是家禽早期生長環(huán)境的變化，不僅影響到家禽早期的生長發(fā)育，還會程序化地影響到其后期的生長發(fā)育。雞胚發(fā)育后期(出孵前1周)和雛雞生長發(fā)育的早期(出孵后1周)是肉雞基礎代謝、體溫調節(jié)和對環(huán)境適應能力完善的關鍵階段，這時給雞胚或雛雞冷、熱刺激，有可能影響到該雞體溫調節(jié)系統(tǒng)的調定點，從而影響該個體的一生[1]。Yahav和Plavnik[2]研究發(fā)現(xiàn)，5日齡肉雞在36 ℃環(huán)境中應激24 h后，7～42日齡階段，早期熱應激組日增重顯著高于其他各組，并伴有采食量的增加。De Basilio等[3]同樣將5日齡肉雞置于38 ℃環(huán)境中24 h，熱應激組肉仔雞當天的體重增重減緩，但到了19日齡時熱應激和對照組間肉仔雞體重無顯著差異。

家禽骨骼肌發(fā)育受到眾多分子信號的影響，胰島素樣生長因子(IGF-1)作為一種細胞生長調控因子，主要通過促進骨骼肌細胞的增殖、抑制骨骼肌細胞凋亡和刺激蛋白質的合成來促進骨骼肌的生長。IGF-1通常與受體(IGF-1R)結合成復合物的形式存在，家禽肌肉的生長發(fā)育與IGFs軸基因的時空特異性表達密切相關[4]。生長激素(GH)具有促進動物生長發(fā)育的作用，其通過內分泌系統(tǒng)與生長激素受體(GHR)結合形成GH-GHR-IGF1信號通路，能夠調控雞成肌細胞增殖和分化[5]。胰島素能夠促進血糖的吸收，特別是骨骼肌組織。當機體受到刺激時，胰島素與其特定的受體(INSR)結合，通過一系列的信號傳導通路，調節(jié)骨骼肌內的糖脂代謝[6]。早期熱應激影響到家禽后期的生長發(fā)育，這些分子信號是否參與此過程，目前尚不清楚。本研究從早期熱應激方面入手，探究其對肉仔雞后期生長發(fā)育和骨骼肌發(fā)育相關基因mRNA豐度的影響，以預判早期熱應激影響后期肉仔雞生長發(fā)育有關的信號通路。

1 材料與方法

1.1 試驗動物與試驗設計

0日齡AA肉仔雞192只，隨機分成試驗處理組和對照組(每組4個重復，每個重復24只雞，公母各半)。試驗期為0～42日齡。試驗在3日齡時，處理組肉仔雞于36 ℃環(huán)境下處理24 h(相對濕度為(83.2+1.2)%)，然后正常飼喂；對照組正常溫度飼喂(溫度為33 ℃，相對濕度為(75.2+2.2)%)。試驗期間采用地面平養(yǎng)的飼養(yǎng)方式，自由采食、飲水，常規(guī)免疫。飼喂的商品日糧購自新希望六和飼料有限公司泰安分公司。每周記錄肉仔雞的體重、采食量和死淘率，并計算平均日采食量、平均日增重、料重比(總采食量/體增重)。42日齡時每組選取8只雞(每個重復2只)進行靜脈采血后屠宰，測定胴體和屠宰性能，分離胸肌樣品于液氮速凍后，-80 ℃冰箱保存。

1.2 血漿生化指標的測定

血漿中血糖(序號：998-18301)、尿酸(序號：994-17301)和甘油三酯(序號：F001)含量采用VITALAB MICRO(95版)半自動生化儀測定，試劑盒購自南京建成生物工程研究所。酮體(Ketone body)采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定，試劑盒購自美國R&D公司。銅離子(Cu2+)能與各種氨基酸絡合產生藍綠色的絡合物，在一定波長下顏色的深淺與總氨基酸的含量成正比，故可以用可見光分光光度計測定其吸光度，通過換算得到總氨基酸含量。血漿胰島素含量(序號：0704，購自山東濰坊三維生物工程集團有限公司)采用競爭性放射免疫分析法測定。

1.3 骨骼肌RNA提取與基因表達分析

用異硫氰二胍鹽法提取肌肉組織總RNA，RNA的質量和濃度分別利用瓊脂糖凝膠電泳和生物分光光度計進行檢測。根據TaKaRa RNA PCR反轉錄試劑盒操作說明書要求進行反轉錄，按照TaKaRa Real Time PCR試劑盒說明進行熒光定量檢測。定量PCR引物在表1中列出。PCR反應所得CT值參照2-ΔΔCt法進行定量目標基因mRNA的相對表達水平計算[7]，以GAPDH為內參基因進行校正。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence of each gene

1.4 數(shù)據統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據采用SAS 8.0統(tǒng)計軟件ANOVA法進行單因素分析，如果差異顯著，采用Duncan氏法進行多重比較，數(shù)據采用“平均值±標準誤”表示，P<0.05為差異顯著。

2 結 果

2.1 早期熱應激對肉仔雞生產性能的影響

與對照組相比，熱應激當天肉仔雞的增重顯著降低(P<0.05，表2)；與對照組相比，早期熱應激顯著增加了整個飼養(yǎng)期肉仔雞的平均日增重(P<0.05)；與對照組相比，早期熱應激有提高整個飼養(yǎng)期肉仔雞平均日采食量的趨勢(0

表2 早期熱應激對肉仔雞生產性能的影響Table 2 Effects of early heat stress on production performance of broilers

2.2 早期熱應激對肉仔雞屠宰性能的影響

與對照組相比，早期熱應激對肉仔雞的屠宰率、半凈膛率、全凈膛率、肝比重、心比重、胸肌率、腿肌率、腹脂率都無顯著影響(P>0.05，表3)。

表3 早期熱應激對肉仔雞42日齡屠宰或胴體性能的影響Table 3 Effects of early heat stress on slaughter or carcass performance of broilers at 42 days of age %

2.3 早期熱應激對肉仔雞血漿生化指標的影響

與對照組相比，早期熱應激對42日齡肉仔雞血漿中尿酸、葡萄糖、甘油三酯、胰島素和總氨基酸含量無顯著影響(P>0.05，表4)；與對照組相比，早期熱應激顯著升高了42日齡肉仔雞血漿酮體含量(P<0.05)。

表4 早期熱應激對肉仔雞血漿生化指標的影響Table 4 Effects of early heat stress on plasma biochemical indicators of broilers

2.4 早期熱應激對胸肌中骨骼肌發(fā)育相關基因表達的影響

在胸肌中，早期熱應激顯著提高了IGF-1和IGF-1R基因表達(P<0.05，表5)，而對GH、GHR和INSR基因表達無顯著影響(P>0.05)。

表5 早期熱應激對肉仔雞骨骼肌發(fā)育相關基因表達的影響Table 5 Effects of early heat stress on gene expression related to skeletal muscle development of broilers

3 討 論

3.1 早期熱應激對肉仔雞生長發(fā)育的影響

先前研究發(fā)現(xiàn)，肉仔雞生長初期熱應激處理后，采食量顯著升高，生長速率加快[2,8]。3日齡肉雞于36 ℃ 高溫環(huán)境中熱處理24 h后，與對照組相比，熱處理組的體重和采食量均顯著下降，直到5日齡后，熱處理組采食量開始顯著增加，出現(xiàn)補償性生長[9]。本試驗中，早期熱應激組肉仔雞整個飼養(yǎng)期的平均日增重顯著升高，這種補償性生長現(xiàn)象與前人研究結果一致[2,8]。此外，熱應激后的肉仔雞生長速度增加，可能跟食欲增加有關，本試驗發(fā)現(xiàn)，早期熱應激后伴隨采食量的增加；也可能與熱應激后肉仔雞有較高的消化吸收速率有關，Uni等[9]發(fā)現(xiàn)，熱處理可立即引起小腸上皮細胞增殖和刷狀緣膜酶活性下降，而熱處理24 h后上皮細胞增殖加快，絨毛數(shù)量快速增長，酶表達及活性增加，提高了消化效率，降低了食物的消化吸收時間。在試驗初期動物受到高溫熱處理，其內臟器官有一定的熱損傷，隨后恢復或超過正常水平，表明動物對熱環(huán)境產生適應性[10]。本試驗所測的組織或器官如骨骼肌、腹脂、心和肝等指數(shù)并未在熱應激后發(fā)生改變，說明早期熱應激并未對機體的后期生長發(fā)育產生顯著影響。

3.2 早期熱應激對肉仔雞血漿生化指標的影響

酮體是脂肪酸在肝中氧化分解的中間產物，僅在肝中產生，當機體處于饑餓或低血糖狀態(tài)時，體內會大量產生酮體，在肝外組織氧化分解，給機體供能。此外，酮體分子小，極性大，易溶于水，能通過血腦屏障，為腦組織供能。在本試驗中，早期熱應激影響了后期機體酮體產生，這一結果與Kubera等[11]的試驗結果相一致。酮體水平的升高也可能是一種儲備性反應，當機體遭受急性熱應激后，機體代償性地儲備更多的能量底物，以備機體應對之后的應激反應。

有研究表明，育雛早期進行熱應激處理的肉雞生長到后期時，熱應激組與對照組的血液總蛋白、葡萄糖及甘油三酯水平均無顯著差異[12-13]。同樣，在本試驗中，早期熱應激對后期肉仔雞血漿葡萄糖、甘油三酯和尿酸含量都未有顯著影響。這些研究都說明，早期熱應激對機體的葡萄糖、蛋白質和脂肪代謝都沒有明顯的影響。

3.3 早期熱應激對肉仔雞骨骼肌發(fā)育相關基因表達的影響

IGFs在肌肉細胞的分化和生長過程中具有重要的正向調控作用，IGFs在次級纖維的形成過程中表達量增加，它的作用是刺激成肌細胞增殖，維持肌纖維的分化[14-15]。IGF-1可以通過增加蛋白合成和肌肉生成及降低蛋白降解率和細胞凋亡來刺激肌肉的生長[16]。IGF-1 mRNA水平會隨著營養(yǎng)水平而變化，禁食會降低28日齡雄性肉仔雞骨骼肌IGF-1 mRNA 水平。在本試驗中，早期熱應激顯著增加了胸肌中IGF-1和IGF-1R基因表達，暗示IGF-1信號在遭受早期熱應激的肉仔雞胸肌中發(fā)揮重要作用，IGF-1信號可能參與了前期熱應激調節(jié)肉仔雞體重增加的過程。

GH是動物生長發(fā)育過程中最主要的激素，調節(jié)機體中大部分的糖分、脂肪、蛋白質和核酸的代謝[17]，品系、年齡、日糧成分、睡眠、運動、應激、血糖水平等對GH的分泌都有影響[18-19]。GH能刺激蛋白質和膠原的合成，并且促進組織攝取和利用循環(huán)系統(tǒng)中的氨基酸。本試驗中，早期熱應激并未對后期肉仔雞骨骼肌中GH和GHR的基因表達產生顯著性的影響，這一結果與氧化應激反應的結果相一致，氧化應激并未改變骨骼肌細胞中GH的表達[20]。但本試驗結果與生理應激反應結果不一致，生理應激通過抑制HPA軸，降低機體內GH分泌[21]。這些研究表明，機體內GH信號的激活受到應激方式的影響。

胰島素能夠促進機體內葡萄糖的轉運，INSR1主要在骨骼肌表達，促進肌肉攝取利用葡萄糖[22]。本試驗中，早期熱應激并未顯著改變血液中胰島素的含量和骨骼肌中INSR的表達，說明早期熱應激并未影響到后期肉仔雞骨骼肌中胰島素信號。此外，熱應激也未對血漿中葡萄糖水平產生顯著影響，這一結果與本團隊前期的試驗發(fā)現(xiàn)相一致[23]，說明早期熱應激對肉仔雞后期的血糖吸收和代謝都無明顯影響。

4 結 論

本研究結果顯示，早期熱應激顯著增加肉仔雞后期增長速度，骨骼肌中IGF-1信號可能參與此調節(jié)過程，GH信號和胰島素信號可能未參與此過程；早期熱應激并未顯著影響后期各組織器官的發(fā)育。