范文博，馬 紅，馬守正，汪 亮，劉 娣,*

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，哈爾濱 150036；2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所，哈爾濱 150000)

民豬具有抗寒、產(chǎn)仔多、肉質(zhì)好、耐粗飼等突出優(yōu)點(diǎn)。民豬的抗寒能力是它能在東北地區(qū)生存的關(guān)鍵因素，而脂肪是民豬抗寒的主要組織。脂肪組織主要分為3種類(lèi)型：白色脂肪、棕色脂肪及米色脂肪。白色脂肪組織(white adipose tissue，WAT)的主要功能是以三?；视?triacylglycerol，TAG)的形式存儲(chǔ)多余的能量；棕色脂肪組織(brown adipose tissue，BAT)是哺乳動(dòng)物體內(nèi)非顫抖性產(chǎn)熱的主要器官，通過(guò)解偶聯(lián)蛋白 1(uncoupling protein，UCP1)介導(dǎo)的氧化磷酸化與三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)合成的解偶聯(lián)作為熱量來(lái)耗散能量[1-2]。當(dāng)機(jī)體交感神經(jīng)興奮時(shí)，如處于低溫環(huán)境，白色脂肪會(huì)發(fā)生棕色化，轉(zhuǎn)變成米色脂肪組織(beige adipose tissue)[3]，同棕色脂肪一樣，米色脂肪也可以促進(jìn)代謝產(chǎn)熱[4-5]。民豬的抗寒機(jī)理一直是重要的研究方向，豬缺少棕色脂肪，但有研究發(fā)現(xiàn)可能存在米色脂肪[6]。

本試驗(yàn)選取了3個(gè)產(chǎn)熱相關(guān)基因：1)解偶聯(lián)蛋白3(uncoupling protein，UCP3)，解偶聯(lián)蛋白受體基因?qū)儆诰€(xiàn)粒體載體蛋白家族，主要參與機(jī)體的能量代謝，也是影響肉質(zhì)的重要功能基因[7]，UCP3在哺乳動(dòng)物的產(chǎn)熱和脂代謝調(diào)控中有重要作用[8-10]。2)過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體-γ共激活因子-1α(peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator-1α，PGC-1α)，PGC-1α 是參與調(diào)節(jié)適應(yīng)性產(chǎn)熱的主因子。研究表明，PGC-1α 在處于寒冷環(huán)境中的棕色脂肪和骨骼肌中高表達(dá)。PGC-1α作為PPARγ 的輔助激活因子激活了決定棕色脂肪細(xì)胞的主要基因，例如UCPs[11]。3)過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferator-activated receptors，PPARs)，其家族中的PPARα對(duì)調(diào)節(jié)脂肪代謝有重要作用[12]。

本試驗(yàn)還選取了3個(gè)米色脂肪標(biāo)記基因：1)核轉(zhuǎn)錄因子(early B-cell factor，EBF)，其家族中的EBF2在脂肪細(xì)胞的成熟分化中起關(guān)鍵作用[13]；2)四跨膜蛋白家族成員中的分化簇81(cluster designation 81，CD81)，CD81作為細(xì)胞表面的免疫調(diào)節(jié)分子，參與細(xì)胞的黏附，影響細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化[14]；3)血小板衍生生長(zhǎng)因子受體α(platelet-derived growth factor receptors，PDGFRα)，PDGFRα是酪氨酸蛋白激酶受體家族成員之一，是一種跨膜糖蛋白，在脂肪組織形成中具有重要作用[15]。

米色脂肪對(duì)民豬的抗寒能力起重要作用，本研究通過(guò)檢測(cè)產(chǎn)熱基因和米色脂肪標(biāo)記基因的表達(dá)為研究民豬抗寒能力提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

TRIzol、熒光定量試劑、DMEM/F12培養(yǎng)基購(gòu)自L(fǎng)ife Technologies公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、胎牛血清(FBS)、磷酸鹽緩沖溶液(PBS)、胰蛋白酶購(gòu)自TaKaRa公司；青鏈霉素混合液、IV型膠原酶、油紅O染液、地塞米松(DEX)、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX)、胰島素、羅格列酮、吲哚美辛、三碘甲狀腺原氨酸(T3)購(gòu)自Sigma公司；引物由安徽通用生物系統(tǒng)有限公司合成。

1.2 樣品采集

試驗(yàn)動(dòng)物來(lái)自黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所養(yǎng)殖基地，采集1月齡東北民豬的背部皮下脂肪組織用于前體脂肪細(xì)胞的培養(yǎng)。采樣程序:屠宰后迅速去除皮毛，用無(wú)菌的剪刀、鑷子剪下1 cm ×1 cm的背部皮下脂肪組織塊。用含有10%雙抗(青霉素和鏈霉素)的無(wú)菌PBS溶液沖洗2～3遍后，將組織塊浸泡于15 mL含有雙抗的PBS溶液中，然后冷藏保存帶回實(shí)驗(yàn)室。

1.3 民豬前體脂肪細(xì)胞的分離培養(yǎng)

將民豬脂肪塊放于100 mm培養(yǎng)皿中，滴加少量組織消化液(DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基含1%IV型膠原酶，10 mmoL·L-1CaCl2),并用剪刀將組織塊剪成細(xì)小的碎塊。組織剪好后，轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中，加入足量的組織消化液和2%濃度的BSA(用DMEM/F12培養(yǎng)基配置，現(xiàn)用現(xiàn)配)，封口膜封口，置37 ℃搖床中,150 r·min-1震蕩消化40～50 min,期間每10～15 min檢查一次組織消化情況;待組織樣消化完全后,加入等體積的DMEM/F12細(xì)胞培養(yǎng)基(含1%雙抗、10%FBS)終止消化;用100 μm細(xì)胞篩過(guò)濾組織消化產(chǎn)物,將濾液轉(zhuǎn)移至干凈的50 mL離心管中;1 000 r·min-1離心5 min;棄上清,將細(xì)胞沉淀用1 mL細(xì)胞培養(yǎng)基重懸，轉(zhuǎn)移到60 mm培養(yǎng)皿中，再加3 mL細(xì)胞培養(yǎng)基后放入37 ℃，5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中過(guò)夜。第2天用PBS沖洗培養(yǎng)皿3次，將未貼壁細(xì)胞洗去，并加入4 mL DMEM/F12細(xì)胞培養(yǎng)基(含1%雙抗、10%FBS)繼續(xù)培養(yǎng)，每2 d更換1次培養(yǎng)基，至細(xì)胞生長(zhǎng)至合適的密度。

1.4 民豬前體脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化

當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)后，將生長(zhǎng)培養(yǎng)基換成含有0.5 mmoL·L-1IBMX、5 μg·mL-1胰島素、1 μmoL· L-1地塞米松、1 μmoL·L-1羅格列酮、1 μmoL·L-1三碘甲狀腺原氨酸 (T3)、1 μmoL·L-1吲哚美辛的DMEM/F12細(xì)胞培養(yǎng)基(含1%雙抗、10%FBS)，2 d后換液，替換成只含有5 μg·m L-1胰島素、1 μmoL·L-1三碘甲狀腺原氨酸(T3)及1 μmoL·L-1羅格列酮的DMEM/F12細(xì)胞培養(yǎng)基(含1%雙抗、10%FBS)，每2 d換液1次至第8天。在誘導(dǎo)培養(yǎng)的第0、2、4、6、8天收集細(xì)胞RNA樣用于檢測(cè)基因的表達(dá)量。

1.5 油紅O染色法檢測(cè)脂滴形成

將誘導(dǎo)分化第8天的民豬前體脂肪細(xì)胞拿出，棄去培養(yǎng)皿內(nèi)培養(yǎng)基，用PBS輕輕地洗3次，加入4%多聚甲醛固定30 min。用PBS洗3次去除多聚甲醛，向培養(yǎng)基中加入油紅O工作液至剛好沒(méi)過(guò)底部進(jìn)行染色。染色30 min后，吸出油紅O，再用PBS清洗3次。使用相差顯微鏡觀察。

1.6 基因定量引物設(shè)計(jì)

利用Primer 5.0在線(xiàn)設(shè)計(jì)軟件，根據(jù)GenBank上豬的UCP3、PGC-1α、PPARα、EBF2、CD81、PDGFRα序列設(shè)計(jì)定量引物，以β-actin為內(nèi)參基因，基因的引物序列由安徽通用生物系統(tǒng)有限公司合成。引物序列見(jiàn)表1。

表1 基因定量引物序列Table 1 Real-time PCR primer sequence of genes

1.7 細(xì)胞總RNA的提取、檢測(cè)和反轉(zhuǎn)錄

按照TRIzol試劑盒使用說(shuō)明提取民豬前體脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化細(xì)胞的總RNA，利用瓊脂糖凝膠電泳法對(duì)提取的總RNA進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)。提取的RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，反應(yīng)體系：1)5×gDNA Eraser Buffer 2 μL,gDNA Erase 1 μL，RNA (1 000/RNA 濃度)μL，F(xiàn)ree H2O補(bǔ)足10 μL。擴(kuò)增條件：42 ℃ 2 min，16 ℃ 1 min；冰浴2 min。2)Primre Seript RT Enzyine Mix I 1 μL,RT Primer Mix 1 μL，5×Primre Seript Buffer2 4 μL，F(xiàn)ree H2O 4 μL。擴(kuò)增條件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，16 ℃ 1 min。

1.8 qRT-PCR驗(yàn)證

用設(shè)計(jì)的定量引物(表1)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系:cDNA樣品0.5 μL，2×SYBR Green PCR Mixture 10 μL，上、下游引物各0.5 μL，滅菌水補(bǔ)充至20 μL。每個(gè)樣品重復(fù)3次。擴(kuò)增條件:95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，72 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)；熔解曲線(xiàn)程序?yàn)椋?5 ℃ 15 s；60 ℃ 1 min；95 ℃ 15 s；60 ℃ 1 min。每組試驗(yàn)重復(fù)3次。采集熒光信號(hào)繪制擴(kuò)增曲線(xiàn)和熔解曲線(xiàn)。

1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

以β-actin基因?yàn)閮?nèi)參，qRT-PCR數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt法分析，計(jì)算UCP3、PGC-1α、PPARα、PDGFRα、EBF2、CD81每個(gè)基因的相對(duì)表達(dá)量。試驗(yàn)均設(shè)置3個(gè)重復(fù)，所有數(shù)據(jù)使用GraphPad Prisms軟件中的One-way ANOVA進(jìn)行方差分析和顯著性檢驗(yàn)。P<0.05表示差異顯著,P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 脂肪細(xì)胞RNA的提取

本試驗(yàn)采用TRIzol法提取細(xì)胞不同誘導(dǎo)時(shí)間點(diǎn)的RNA,并用1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)。從圖1 中可以看出，所有樣品的 RNA 在凝膠上均顯示出3條清晰明亮的條帶，由上至下分別為28S、18S、5S。經(jīng)紫外分光光度計(jì)測(cè)定，提取的總 RNA 質(zhì)量較好，可用于后續(xù)基因表達(dá)量的檢測(cè)。

圖1 RNA電泳圖Fig.1 RNA detection electrophoresis map

2.2 民豬前體脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化及油紅O鑒定

前體脂肪細(xì)胞在不誘導(dǎo)分化正常傳代培養(yǎng)時(shí)只會(huì)出現(xiàn)少數(shù)分化現(xiàn)象，由圖2可以看到誘導(dǎo)處理第0 天時(shí)細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形，幾乎沒(méi)有脂滴形成，在加入誘導(dǎo)分化試劑培養(yǎng)第2天時(shí)，視野中出現(xiàn)了亮的脂滴，第4天明顯看到形成的脂滴變多，并有聚攏的趨勢(shì)，當(dāng)誘導(dǎo)分化第6天時(shí)，開(kāi)始出現(xiàn)大片脂滴聚攏現(xiàn)象，從圖中可以看到脂滴覆蓋率達(dá)到60%，第8天時(shí)，視野下是大片脂滴，覆蓋率達(dá)80%，有的地方出現(xiàn)脂滴重疊現(xiàn)象。在第8天進(jìn)行油紅O染色，也可以清晰看到脂滴被染成紅色，確定誘導(dǎo)分化成功。

A～E.誘導(dǎo)分化第0、2、4、6、8天細(xì)胞形態(tài)；F.第8天油紅O染色細(xì)胞形態(tài)A-E.Cell morphology on day 0,2,4,6 and 8 of differentiation;F.On day 8,the morphology of cells stained with Oil red O圖2 誘導(dǎo)分化和油紅O染色的民豬前體脂肪細(xì)胞(100×)Fig.2 Adipogenic differentiation and Oil red O staining of preadipocytes of Min pig(100×)

2.3 目的基因在民豬前體脂肪細(xì)胞中的表達(dá)

2.3.1 產(chǎn)熱相關(guān)基因表達(dá)UCP3表達(dá)量隨著脂肪細(xì)胞的分化其表達(dá)量持續(xù)升高，在第6天時(shí)達(dá)到最高值，為第0 天時(shí)表達(dá)量的164倍(P<0.01)，第8天時(shí)表達(dá)量略有降低，但仍為第0天時(shí)的63倍(P<0.01)(圖3)；PGC-1α基因在誘導(dǎo)分化后第2天 表達(dá)量最高，達(dá)到第0天的334倍(P<0.01)(圖3)，第4、6 和8天時(shí)的表達(dá)量與第2天比較有較大幅度地降低，但也分別達(dá)到第0天表達(dá)量的35、22和13倍(圖3)；PPARα的表達(dá)量在誘導(dǎo)后的第2天達(dá)到第0天表達(dá)量的7倍(P<0.01)，并在此后始終保持4～7倍的較高表達(dá)量(P<0.01)(圖3)。

不同大寫(xiě)字母表示組間差異極顯著(P<0.01)。下同Different uppercase letters indicate extremely significant differences among different groups(P<0.01).The same as below圖3 產(chǎn)熱相關(guān)基因表達(dá)情況Fig.3 Expression of genes related to thermogenesis

結(jié)合3種產(chǎn)熱相關(guān)基因在脂肪細(xì)胞成熟分化過(guò)程中的表達(dá)趨勢(shì)可見(jiàn)(圖3)，當(dāng)前體脂肪細(xì)胞向成熟脂肪細(xì)胞分化的過(guò)程中，與產(chǎn)熱相關(guān)的基因表達(dá)量迅速提高，雖然在完成成熟轉(zhuǎn)化后表達(dá)量有所降低，但相比于未分化狀態(tài)時(shí)依然終保持了較高的表達(dá)水平。

2.3.2 米色脂肪轉(zhuǎn)化相關(guān)基因表達(dá)EBF2基因在誘導(dǎo)分化后的第2天表達(dá)量最高，達(dá)到第0天的29倍(P<0.01)，在第4、6 和8 天時(shí)的表達(dá)量比第2天有較大幅度地降低，但也達(dá)到第0天表達(dá)量的7、9和4倍(圖4)；CD81基因在第2、4天的表達(dá)量為第0天表達(dá)量的4倍左右(P<0.01)，第8天和第0天的表達(dá)量接近，為第0天表達(dá)量1.2倍(圖4)。PDGFRα基因的表達(dá)量在第2天時(shí)最高，為第0天表達(dá)量的5倍(P<0.01)，第4天為第0天表達(dá)量的3倍(P<0.01)，第6天幾乎與第0天相同，第8 天時(shí)低于第0天的表達(dá)量(圖4)。結(jié)合3種米色脂肪轉(zhuǎn)化相關(guān)基因表達(dá)情況可見(jiàn)(圖4)，當(dāng)前體脂肪細(xì)胞向成熟脂肪細(xì)胞分化的過(guò)程中米色脂肪特異性基因發(fā)生表達(dá)。

圖4 米色脂肪轉(zhuǎn)化相關(guān)基因表達(dá)情況Fig.4 Expression of genes related to beige fat transformation

3 討 論

3.1 脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中產(chǎn)熱相關(guān)基因的表達(dá)

UCP3基因?qū)儆诰€(xiàn)粒體載體基因家族，主要參與線(xiàn)粒體呼吸鏈的解偶聯(lián)作用，用于機(jī)體非戰(zhàn)栗產(chǎn)熱。目前，對(duì)豬UCP3基因的研究主要集中在多態(tài)性分析及其對(duì)脂肪沉積和肉品質(zhì)的影響[16-17]。Lin等[18]證明，1周齡藏豬受到冷刺激后出現(xiàn)米色脂肪組織，UCP3基因表達(dá)量顯著上調(diào)，介導(dǎo)機(jī)體脂肪組織產(chǎn)熱，抵抗寒冷環(huán)境對(duì)機(jī)體的影響。PGC-1α是一種轉(zhuǎn)錄共激活因子，是參與調(diào)節(jié)適應(yīng)性產(chǎn)熱的主因子，主要在棕色脂肪組織中表達(dá)，當(dāng)小鼠處于冷暴露時(shí)，PGC-1α在白色脂肪組織中含量明顯增加，并進(jìn)一步促進(jìn)UCP1的表達(dá)，說(shuō)明其在促進(jìn)白色脂肪棕色化中有重要作用[19-20]。PPARα高表達(dá)于代謝活性強(qiáng)的組織，如肝、心、肌肉和米色脂肪組織。肝內(nèi)，PPARα參與調(diào)控肝內(nèi)的3條脂肪酸氧化代謝通路(過(guò)氧化物酶體和線(xiàn)粒體β-氧化及微粒體ω-氧化)，控制著肝內(nèi)脂質(zhì)及機(jī)體能量平衡。在米色脂肪細(xì)胞和巨噬細(xì)胞分化及饑餓過(guò)程中，PPARα的表達(dá)水平均升高[21]。研究發(fā)現(xiàn)，PGC-1α和PPAR家族共同作用于UCP3，是UCP3基因分子調(diào)控的重要組成部分，同時(shí)UCP3對(duì)于PGC-1α誘導(dǎo)的氧化能力至關(guān)重要[22]。本研究中，PGC-1α和PPARα在第2天有較高表達(dá)，UCP3表達(dá)量在2 d 后逐漸升高，說(shuō)明隨著時(shí)間的增加PGC-1α和PPARα促進(jìn)UCP3的表達(dá)，符合上述研究結(jié)果。UCP3、PGC-1α、PPARα表達(dá)量的升高說(shuō)明細(xì)胞產(chǎn)熱能力明顯增加。

3.2 脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中米色脂肪標(biāo)記基因的表達(dá)

EBF2、PDGFRα、CD81是研究發(fā)現(xiàn)的米色脂肪標(biāo)志性基因。通過(guò)對(duì)小鼠EBF2基因的敲除發(fā)現(xiàn)，EBF2控制著小鼠米色脂肪細(xì)胞的形成[23]。EBF2通過(guò)增加PGC-1α的表達(dá)來(lái)促進(jìn)產(chǎn)熱基因轉(zhuǎn)錄，從而促進(jìn)米色脂肪細(xì)胞生成[24]。EBF2在成人棕色前體脂肪中高豐度表達(dá)，表明其在人類(lèi)棕色前體脂肪的形成過(guò)程中也發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[25]。EBF2缺失小鼠的棕色脂肪細(xì)胞和組織顯示出棕色特異性特征和產(chǎn)熱能力的喪失，確定了EBF2是棕色脂肪細(xì)胞功能的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子。通過(guò)在小鼠中研究皮下和內(nèi)臟脂肪發(fā)現(xiàn)，PDGFRα信號(hào)傳導(dǎo)促進(jìn)米色脂肪細(xì)胞生成[26-27]。CD81是在研究中發(fā)現(xiàn)的一種新的更準(zhǔn)確的米色脂肪標(biāo)志基因，Oguri等[28]將CD81+和CD81-細(xì)胞分別從小鼠的腹股溝脂肪中分選出來(lái)并進(jìn)行體外培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，只有CD81+細(xì)胞能夠分化成成熟的脂肪細(xì)胞并表達(dá)多個(gè)米色脂肪所特有的基因。本研究中，EBF2、CD81和PDGFRα在前體脂肪細(xì)胞中均有表達(dá)，且在誘導(dǎo)分化的第2天出現(xiàn)最高表達(dá)量，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的繼續(xù)增加，表達(dá)量明顯降低，可能是前體脂肪細(xì)胞更多向白色脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)化而向米色脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)化的較少。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果顯示，在民豬的前體脂肪細(xì)胞向成熟脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化的過(guò)程中，產(chǎn)熱和米色脂肪標(biāo)記相關(guān)基因的表達(dá)會(huì)隨著誘導(dǎo)時(shí)間的增加而產(chǎn)生規(guī)律性變化。產(chǎn)熱相關(guān)基因的表達(dá)量會(huì)隨著誘導(dǎo)時(shí)間的增加而增加，并維持較高水平；而米色脂肪標(biāo)記基因在誘導(dǎo)第2天表達(dá)量最高，隨后則明顯降低。本研究結(jié)果說(shuō)明，前體脂肪細(xì)胞的分化具有明顯的階段特異性，為進(jìn)一步分析如何影響民豬前體脂肪細(xì)胞向米色脂肪細(xì)胞的分化，以及從分子角度研究民豬抗寒機(jī)理提供參考。