王 莉，陳 潔，聞雙全，鄒 輝，顧建紅，劉學(xué)忠，卞建春，劉宗平，袁 燕*

(1.揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，揚(yáng)州 225009；2.江蘇高校動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚(yáng)州 225009；3.南通市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，南通 226011)

鎘(cadmium，Cd)是一種存在于環(huán)境中的重金屬，與許多重金屬不同，Cd具有良好的水溶性，可經(jīng)水體在土壤中富集并被植物吸收，通過食物鏈進(jìn)入人和動(dòng)物體內(nèi)[1]。呼吸系統(tǒng)和消化系統(tǒng)是Cd進(jìn)入機(jī)體的主要途徑[2]，Cd可通過Ca2+通道和金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白進(jìn)入細(xì)胞，并紊亂細(xì)胞內(nèi)環(huán)境，引起細(xì)胞凋亡[3-4]。凋亡是細(xì)胞程序性死亡的方式之一，細(xì)胞凋亡的有序進(jìn)行在維持細(xì)胞新陳代謝中發(fā)揮重要調(diào)控作用。誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是Cd的毒性作用機(jī)制之一。大腦是Cd富集和損傷的重要靶器官之一，Cd可以改變血腦屏障通透性，透過血腦屏障進(jìn)入神經(jīng)細(xì)胞，引起神經(jīng)細(xì)胞凋亡[2,5]。

凋亡由不同的信號(hào)通路觸發(fā)，主要包括死亡受體通路和線粒體通路，其中，F(xiàn)as/FasL通路是最為經(jīng)典的死亡受體通路，參與調(diào)控多種細(xì)胞的凋亡[6]。Fas形成三聚體與配體FasL結(jié)合，再與具有死亡結(jié)構(gòu)域的Fas相關(guān)死亡域蛋白(Fas-associated death domain，F(xiàn)ADD)結(jié)合，進(jìn)一步激活caspase-8引起細(xì)胞凋亡[7]。此外，由細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular-signal regulated protein kinases，ERKs)、Jun氨基末端激酶(Jun N-terminal kinases，JNKs)和p38/應(yīng)激激活蛋白激酶(stress-activated protein kinases，SAPKs)3個(gè)家族組成的絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)通路是介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的另一重要通路[8]。研究表明，鎘可通過Fas/FasL通路[6]、線粒體通路[9]和MAPK通路[10]誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡。此外，凋亡信號(hào)通路之間存在密切的串?dāng)_關(guān)系。MAPK信號(hào)通路可作為Fas/FasL信號(hào)通路的上游信號(hào)參與調(diào)控細(xì)胞凋亡。研究發(fā)現(xiàn)，抑制MAPK通路可抑制Fas/FasL通路的激活減輕磷脂酶A2(PLA2)誘導(dǎo)的人白血病U937細(xì)胞凋亡[11]。此外，F(xiàn)as/FasL信號(hào)通路也可作為上游信號(hào)調(diào)控MAPK信號(hào)通路參與調(diào)控細(xì)胞凋亡。研究表明，抑制Fas/FasL通路可抑制MAPK通路的激活，緩解急性胰腺炎誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡[12]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)as/FasL通路可激活線粒體通路參與鎘致PC12細(xì)胞(大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞)凋亡[13]。然而，在鎘誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡過程中，F(xiàn)as/FasL通路對(duì)鎘激活MAPK通路的影響尚不明確。

本研究通過10 μmol·L-1醋酸鎘(cadmium acetate，CdAc2)分別處理插入非特異性序列 PC12細(xì)胞與Fas 基因沉默 PC12細(xì)胞12 h；用10 μmol·L-1CdAc2與40 μmol·L-1Z-IETD-FMK(caspase-8 特異性抑制劑)單獨(dú)或聯(lián)合處理PC12細(xì)胞12 h，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率，Hoechst33258 熒光染色法檢測細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)變化，Western blot法檢測Fas/FasL通路相關(guān)蛋白Fas、FasL、FADD、Cleaved caspase-8、死亡結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白(death domain associated protein，Daxx)、凋亡信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1(apoptosis signal-regulating kinase 1，ASK1)與MAPK通路相關(guān)蛋白ERK、p-ERK、JNK、p-JNK蛋白表達(dá)情況，旨在探討Fas/FasL通路對(duì)鎘激活PC12細(xì)胞MAPK通路的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)細(xì)胞株

PC12細(xì)胞(rat pheochromocytoma cell)購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫(ATCC Number：CRL-1721)；Fas基因沉默PC12細(xì)胞株由本課題組前期構(gòu)建。

1.2 主要試劑

RPMI 1640和胎牛血清(Life Technologies，USA)，L-谷氨酰胺和青鏈霉素(BBI，USA)，F(xiàn)as、FasL、FADD、Cleaved caspase-8兔多克隆抗體(Abcam，UK)，Daxx、ASK1、ERK1/2、p-ERK1/2、JNK1/2、p-JNK1/2兔單克隆抗體(CST，USA)，β-actin和辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記山羊抗兔二抗(CST，USA)，嘌呤霉素(Invitrogen，USA)，F(xiàn)as shRNA慢病毒和NC shRNA慢病毒(山東維真生物科技有限公司)，L-多聚賴氨酸、Hoechst 33258、醋酸鎘(Sigma-Aldrich，USA)，Z-IETD-FMK(Abcam，UK)，別藻蛋白(APC)和7-氨基放線菌素 D(7-AAD)細(xì)胞凋亡雙染試劑(BD，USA)，其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 主要儀器

DMI3000B型倒置顯微鏡(Leica，Germany)，EPOCH型酶標(biāo)儀(BioTek，USA)，蛋白質(zhì)電泳設(shè)備、轉(zhuǎn)膜設(shè)備及GIS-1000凝膠成像處理系統(tǒng)(BIO-RAD，USA)，Tanon化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)(上海天能科技有限公司)，激光共聚焦顯微鏡(Leica，Germany)，F(xiàn)ACS Aria型流式細(xì)胞儀(BD，USA)。

1.4 1640培養(yǎng)液配制

RPMI 1640培養(yǎng)基一袋(10.4 g)，碳酸氫鈉1.5 g，丙酮酸鈉0.1 g，葡萄糖2.5 g，完全溶解于800 mL超純水中，調(diào)節(jié)pH至7.2～7.4，定容至1 L。0.22 μm正壓濾膜器過濾除菌，分裝，4 ℃保存?zhèn)溆谩Ｊ褂们凹尤?0%胎牛血清，100 U·mL-1青霉素和100 U·mL-1鏈霉素，2 mL谷氨酰胺。

1.5 細(xì)胞培養(yǎng)

將PC12細(xì)胞、插入非特異性序列PC12細(xì)胞(NC組細(xì)胞)或Fas基因沉默PC12細(xì)胞(Fas shRNA組細(xì)胞)用RPMI 1640完全培養(yǎng)液于37 ℃、50 mL·L-1CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞融合率達(dá)到80%，進(jìn)行傳代(1∶2～1∶4)培養(yǎng)。

1.6 Hoechst 33258 染色觀察細(xì)胞核形態(tài)的變化

將NC組和Fas shRNA組細(xì)胞以每孔1.0×105個(gè)細(xì)胞密度分別接種于加有玻璃爬片并用L-多聚賴氨酸包被的的24孔板中培養(yǎng)24 h(細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長期)，根據(jù)本課題組前期研究結(jié)果[13]，本研究選擇10 μmol·L-1CdAc2分別處理NC組細(xì)胞(Cd組)和Fas shRNA組細(xì)胞(Fas shRNA+Cd組)12 h，棄培養(yǎng)基，4%多聚甲醛4 ℃固定30 min，PBS漂洗2次，加入5 mg·L-1Hoechst 33258熒光染色液室溫避光孵育10 min，PBS漂洗2次，封片，激光共聚焦顯微鏡觀察拍照。

1.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率

將NC組和Fas shRNA組細(xì)胞以每孔1.0×106個(gè)細(xì)胞密度分別接種于6孔培養(yǎng)板上培養(yǎng)24 h(細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長期)，用10 μmol·L-1CdAc2處理NC組細(xì)胞(Cd組)和Fas shRNA組細(xì)胞(Fas shRNA+Cd組)12 h。處理完成后，收集細(xì)胞，離心棄上清，用1 mL PBS洗滌細(xì)胞2次。加入200 μL 1×Binding Buffer重懸細(xì)胞，200目篩網(wǎng)過濾細(xì)胞至流式管中，別藻蛋白(APC)和7-氨基放線菌素D(7-AAD)各5 μL單獨(dú)或聯(lián)合處理，室溫避光孵育15 min，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。早期凋亡細(xì)胞和晚期凋亡細(xì)胞占總細(xì)胞比例和即為細(xì)胞凋亡率。

1.8 免疫印跡法檢測相關(guān)蛋白表達(dá)

10 μmol·L-1CdAc2分別處理NC組(Cd組)與Fas shRNA組(Fas shRNA+Cd組)PC12細(xì)胞12 h；或根據(jù)本課題組前期研究結(jié)果[13]，用40 μmol·L-1Z-IETD-FMK與10 μmol·L-1CdAc2單獨(dú)或聯(lián)合處理PC12細(xì)胞12 h。離心收集細(xì)胞，添加含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液(1∶100)，超聲破碎細(xì)胞，于冰上裂解20 min，4 ℃ 12 000 r·min-1離心10 min，收集上清，BCA法測定蛋白濃度并將濃度調(diào)成一致，加入5×SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)上樣緩沖液，隔水煮沸8 min，于超低溫冰箱保存?zhèn)溆?。蛋白樣品?jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)分離后，轉(zhuǎn)印至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入相應(yīng)一抗，4 ℃孵育過夜，含吐溫20的三羥甲氨基甲烷緩沖液(TBST)洗滌6次，5 min·次-1，根據(jù)一抗來源孵育對(duì)應(yīng)的HRP標(biāo)記的二抗，室溫孵育2 h；含吐溫20的三羥甲氨基甲烷緩沖液(TBST)洗滌6次，5 min·次-1。利用Tanon化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)進(jìn)行增強(qiáng)性化學(xué)發(fā)光法(ECL)顯影檢測蛋白表達(dá)情況，Image Lab軟件分析灰度值，目的蛋白條帶灰度值與β-actin蛋白條帶灰度值的比值，即為目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 PC12細(xì)胞Fas蛋白沉默的鑒定

Western blot檢測Fas蛋白表達(dá)量的變化，結(jié)果如圖1所示，NC組與Control組相比，F(xiàn)as蛋白的表達(dá)量無顯著差異(P>0.05)；與NC組相比，F(xiàn)as shRNA組Fas蛋白的表達(dá)量極顯著下降(P<0.01)。

不同大寫字母表示組間差異極顯著(P<0.01)；相同字母表示組間差異不顯著(P>0.05)，下同Different capital letters show significant difference between groups (P<0.01)；no significant differences in the same letters (P>0.05)，The same as below圖1 PC12細(xì)胞Fas蛋白沉默的鑒定Fig.1 Identification of the silence of Fas protein in PC12 cells

2.2 Fas shRNA對(duì)鎘致PC12細(xì)胞凋亡的影響

10 μmol·L-1CdAc2分別處理NC組與Fas shRNA組細(xì)胞12 h，Hoechst 33258染色，激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞核形態(tài)變化。結(jié)果如圖2所示，與NC組相比，Cd組中細(xì)胞核固縮濃染，呈典型凋亡形態(tài)變化的細(xì)胞核數(shù)量上升，細(xì)胞凋亡率極顯著升高(P<0.01)，F(xiàn)as shRNA組與Fas shRNA+Cd組細(xì)胞呈凋亡典型變化的細(xì)胞極少，細(xì)胞凋亡率無顯著差異(P>0.05)；與Fas shRNA組相比，Cd組細(xì)胞呈典型凋亡形態(tài)變化的細(xì)胞核數(shù)量上升，細(xì)胞凋亡率極顯著升高(P<0.01)，F(xiàn)as shRNA+Cd組細(xì)胞凋亡率無顯著差異(P>0.05)；與Cd組相比，F(xiàn)as shRNA+Cd組細(xì)胞核固縮濃染，呈凋亡典型形態(tài)變化的細(xì)胞數(shù)量下降，細(xì)胞凋亡率極顯著降低(P<0.01)。

白色箭頭所示為受損細(xì)胞核The damaged nuclei were marked by white arrows圖2 Fas shRNA對(duì)鎘致PC12細(xì)胞核形態(tài)變化的影響(1 000×)Fig.2 Effects of Fas shRNA on nuclear morphological changes in PC12 cells caused by cadmium(1 000×)

10 μmol·L-1CdAc2分別處理NC組與Fas shRNA組細(xì)胞12 h，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率。結(jié)果如圖3所示，Q1象限為機(jī)械損傷細(xì)胞，Q2象限為晚期凋亡細(xì)胞，Q3象限為早期凋亡細(xì)胞，Q4象限為正常細(xì)胞。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，與NC組相比，Cd組細(xì)胞凋亡率極顯著升高(P<0.01)，F(xiàn)as shRNA組與Fas shRNA+Cd組細(xì)胞凋亡率無顯著差異(P>0.05)；與Fas shRNA組相比，Cd組細(xì)胞凋亡率極顯著升高(P<0.01)，F(xiàn)as shRNA+Cd組細(xì)胞凋亡率無顯著差異(P>0.05)；與Cd組相比，F(xiàn)as shRNA+Cd組細(xì)胞凋亡率極顯著降低(P<0.01)。

圖3 Fas shRNA對(duì)鎘致PC12細(xì)胞凋亡率變化的影響Fig.3 Effects of Fas shRNA on the change of apoptosis rate in PC12 cells caused by cadmium

2.3 Fas shRNA對(duì)鎘致PC12細(xì)胞Fas/FasL通路相關(guān)蛋白表達(dá)變化的影響

10 μmol·L-1CdAc2分別處理NC組與Fas shRNA組細(xì)胞12 h，Western blot檢測Fas/FasL信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果如圖4、圖5所示，與NC組相比，Cd組Fas、FasL、FADD、Cleaved caspase-8、Daxx、ASK1蛋白表達(dá)量均極顯著升高(P<0.01)，F(xiàn)as shRNA組與Fas shRNA+Cd組Fas蛋白的表達(dá)量極顯著降低(P<0.01)；與Fas shRNA組相比，Cd組Fas、FasL、FADD、Cleaved caspase-8、Daxx、ASK1蛋白表達(dá)量均極顯著升高(P<0.01)，F(xiàn)as shRNA+Cd組Fas、FasL、FADD、ASK1蛋白表達(dá)量差異不顯著(P>0.05)，Cleaved caspase-8蛋白表達(dá)量極顯著降低(P<0.01)，DAXX蛋白表達(dá)量極顯著升高(P<0.01)；與Cd組相比，F(xiàn)as shRNA+Cd組Fas、FasL、FADD、Cleaved caspase-8、Daxx、ASK1蛋白表達(dá)量均極顯著降低(P<0.01)。

不同小寫字母表示組間差異顯著(P<0.05)；下同Different lowercase letters indicate significant differences between groups (P<0.05)；The same as below圖4 Fas shRNA對(duì)鎘致PC12細(xì)胞Fas、FasL、FADD和Cleaved caspase-8蛋白表達(dá)變化的影響Fig.4 Effects of Fas shRNA on the changes of Fas，F(xiàn)asL，F(xiàn)ADD and Cleaved caspase-8 protein expression in PC12 cells caused by cadmium

圖5 Fas shRNA對(duì)鎘致PC12細(xì)胞Daxx和ASK1蛋白表達(dá)變化的影響Fig.5 Effects of Fas shRNA on the changes of Daxx and ASK1 protein expression in PC12 cells caused by cadmium

2.4 Fas shRNA對(duì)鎘致PC12細(xì)胞ERK1/2和JNK1/2磷酸化的影響

10 μmol·L-1CdAc2分別處理NC組與Fas shRNA組細(xì)胞12 h，Western blot法檢測ERK1/2、p-ERK1/2、JNK1/2和p-JNK1/2蛋白表達(dá)情況。結(jié)果如圖6所示，與NC組相比，Cd組p-ERK1/2 /ERK1/2和p-JNK1/2 /JNK1/2比值均極顯著升高(P<0.01)，F(xiàn)as shRNA組與Fas shRNA+Cd組p-ERK1/2 /ERK1/2和p-JNK1/2 /JNK1/2比值均無顯著差異(P>0.05)；與Fas shRNA組相比，Cd組p-ERK1/2 /ERK1/2和p-JNK1/2 /JNK1/2比值均極顯著升高(P<0.01)，F(xiàn)as shRNA+Cd組p-ERK1/2 /ERK1/2和p-JNK1/2 /JNK1/2比值均無顯著差異(P>0.05)；與Cd組相比，F(xiàn)as shRNA+Cd組p-ERK1/2 /ERK1/2和p-JNK1/2 /JNK1/2比值均極顯著降低(P<0.01)。

圖6 Fas shRNA對(duì)鎘致PC12細(xì)胞ERK1/2和JNK1/2磷酸化的影響Fig.6 Effects of Fas shRNA on the phosphorylation of ERK1/2 and JNK1/2 in PC12 cells caused by cadmium

2.5 Z-IETD-FMK對(duì)鎘致PC12細(xì)胞ERK1/2和JNK1/2磷酸化的影響

10 μmol·L-1CdAc2與40 μmol·L-1Z-IETD-FMK單獨(dú)或聯(lián)合處理PC12細(xì)胞12 h，Western blot法檢測ERK1/2、p-ERK1/2、JNK1/2和p-JNK1/2蛋白表達(dá)情況。結(jié)果如圖7所示，與Control組相比，Cd組p-ERK1/2 /ERK1/2和p-JNK1/2 /JNK1/2比值均極顯著升高(P<0.01)，Z-IETD-FMK組p-ERK1/2 /ERK1/2和p-JNK1/2 /JNK1/2比值均無顯著差異(P>0.05)，Z-IETD-FMK+Cd組p-ERK1/2 /ERK1/2比值極顯著升高(P<0.01)，p-JNK1/2 /JNK1/2比值無顯著差異(P>0.05)；與Z-IETD-FMK組相比，Cd組p-ERK1/2 /ERK1/2和p-JNK1/2 /JNK1/2比值均極顯著升高(P<0.01)，Z-IETD-FMK+Cd組p-ERK1/2 /ERK1/2比值顯著升高(P<0.05)，p-JNK1/2 /JNK1/2比值無顯著差異(P>0.05)；與Cd組相比，Z-IETD-FMK+Cd組p-ERK1/2 /ERK1/2和p-JNK1/2 /JNK1/2比值均極顯著降低(P<0.01)。

圖7 Z-IETD-FMK對(duì)鎘致PC12細(xì)胞ERK1/2和JNK1/2磷酸化的影響Fig.7 Effects of Z-IETD-FMK on the phosphorylation of ERK1/2 and JNK1/2 in PC12 cells caused by cadmium

3 討 論

細(xì)胞凋亡是由死亡信號(hào)觸發(fā)或內(nèi)外環(huán)境變化，以及在基因調(diào)控下所引發(fā)的細(xì)胞主動(dòng)死亡過程，是多細(xì)胞生物調(diào)控機(jī)體發(fā)育、維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、控制細(xì)胞衰老的重要機(jī)制。細(xì)胞凋亡的發(fā)生和進(jìn)行受精確調(diào)控，具有獨(dú)特而復(fù)雜的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)[14-15]。線粒體通路、死亡受體通路和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是細(xì)胞凋亡的3大經(jīng)典通路，各通路之間相互交叉，共同調(diào)控細(xì)胞凋亡。鎘是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的典型誘導(dǎo)因子之一。體內(nèi)外研究結(jié)果表明，鎘可通過多種途徑誘導(dǎo)神經(jīng)元[16]、星形膠質(zhì)細(xì)胞[17]、小膠質(zhì)細(xì)胞[18]、PC12細(xì)胞[19]等神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生凋亡。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，鎘可引起神經(jīng)細(xì)胞凋亡，上調(diào)Fas/FasL通路相關(guān)蛋白的表達(dá)量[20]，因此抑制Fas/FasL可能成為阻斷細(xì)胞凋亡的途徑。Wang等[21]研究發(fā)現(xiàn)，通過Fas siRNA沉默肝細(xì)胞Fas表達(dá)可以減少細(xì)胞凋亡，提高同種異體移植肝細(xì)胞的存活率。本試驗(yàn)通過NC shRNA或Fas shRNA慢病毒干擾PC12細(xì)胞Fas蛋白表達(dá)。結(jié)果表明，NC shRNA慢病毒不影響PC12細(xì)胞Fas蛋白表達(dá)，可做為陰性對(duì)照進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)；Fas shRNA慢病毒可有效抑制PC12細(xì)胞Fas蛋白表達(dá)，減少鎘引起的細(xì)胞核固縮濃染或變形等細(xì)胞凋亡典型變化，顯著抑制鎘引起的PC12細(xì)胞凋亡率的升高，說明Fas/FasL在鎘致PC12細(xì)胞凋亡過程中具有重要作用。

死亡受體通路是靶細(xì)胞表面的死亡受體與配體結(jié)合導(dǎo)致死亡結(jié)構(gòu)域(DD)與Fas相關(guān)死亡域(FADD)碳末端的DD結(jié)合，從而激活下游凋亡蛋白執(zhí)行細(xì)胞凋亡的一種途徑[22]。Fas/FasL、腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(TRAIL)和腫瘤壞死因子受體(TNFR)3大主要死亡受體通路中Fas/FasL通路是最主要的死亡受體通路之一，在神經(jīng)細(xì)胞凋亡過程中扮演著重要角色。Fas/FasL通路由Fas/FADD/caspase-8和Fas/Daxx/ASK1兩條相對(duì)獨(dú)立的通路構(gòu)成[23,24]。當(dāng)細(xì)胞受到刺激物誘導(dǎo)發(fā)生凋亡時(shí)，F(xiàn)as/FADD/caspase-8途徑被激活，參與細(xì)胞凋亡[25]。在此過程中，F(xiàn)ADD作為紐帶將凋亡信號(hào)傳遞至細(xì)胞質(zhì)[26]。Daxx是一種可以與Fas死亡結(jié)構(gòu)域結(jié)合的蛋白，Daxx是Fas下游的一種促凋亡蛋白，與FADD平行，位于細(xì)胞核內(nèi)，當(dāng)細(xì)胞受到凋亡刺激時(shí)，Daxx可以與Fas結(jié)合，并依次激活A(yù)SK1和JNK，介導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡，在此過程中ASK1在Fas介導(dǎo)的死亡受體通路和JNK通路之間發(fā)揮橋梁作用[22]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，鎘能夠激活PC12細(xì)胞Fas/FADD/caspase-8通路和Fas/Daxx/ASK1通路，引起Fas、FasL、FADD、Cleaved caspase-8、Daxx和ASK1蛋白表達(dá)量的升高；同時(shí)通過Fas shRNA抑制Fas的表達(dá)，能顯著抑制鎘引起的Fas、FasL、FADD、Cleaved caspase-8、Daxx和ASK1蛋白表達(dá)量的升高。說明抑制Fas的表達(dá)能夠阻斷鎘引起的PC12細(xì)胞Fas/FasL信號(hào)通路的激活。

MAPK通路的各亞族可被不同的外界刺激物激活，形成不同的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，激活不同的轉(zhuǎn)錄因子，介導(dǎo)不同的生物效應(yīng)。MAPK通路的激活因細(xì)胞種類和誘導(dǎo)因子的不同存在很大差異。鎘可以引起大鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞(C6)JNK和p38 MAPK激活，并通過p38 MAPK途徑調(diào)節(jié)絲裂原活化蛋白激酶磷酸酶-1(MKP-1)的表達(dá)[27]。此外，MAPK通路與線粒體通路和Fas/FasL通路之間存在密切的串?dāng)_關(guān)系。MAPK通路可作為線粒體通路和Fas/FasL通路的上游信號(hào)參與細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，鎘可通過ERK和JNK介導(dǎo)的線粒體通路誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡[28]。Liu等[11]研究發(fā)現(xiàn)，磷脂酶A2(PLA2)誘導(dǎo)人白血病U937細(xì)胞凋亡過程中，p38 MAPK與Fas/FasL通路被激活，p38 MAPK抑制劑SB202190抑制p38 MAPK的激活后，抑制了PLA2對(duì)Fas/FasL通路的激活。然而，F(xiàn)as/FasL通路也可作為MAPK通路的上游信號(hào)參與細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)。TNF(腫瘤壞死因子)能夠誘導(dǎo)FADD和ERK激活，在FADD缺失的成纖維細(xì)胞中，TNF(腫瘤壞死因子)誘導(dǎo)的ERK磷酸化水平極顯著降低[29]。在Fas和FasL基因敲除的胰腺炎小鼠模型中，肝細(xì)胞凋亡水平顯著降低，同時(shí)p38 MAPK磷酸化水平也降低[12]。此外，Khelifi等[30]研究發(fā)現(xiàn)，通過RNA干擾(RNAi)技術(shù)抑制Daxx的表達(dá)，可顯著降低JNK的活性，提高成纖維細(xì)胞對(duì)紫外線和氧化應(yīng)激的耐受性，降低細(xì)胞的凋亡率。本研究結(jié)果表明，F(xiàn)as shRNA與40 μmol·L-1Z-IETD-FMK可抑制Fas/FasL通路的激活進(jìn)而抑制鎘激活MAPK通路誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡。說明Fas/FasL通路作為上游信號(hào)調(diào)控下游的MAPK通路參與鎘誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡。

4 結(jié) 論

通過Fas shRNA和Z-IETD-FMK抑制Fas/FasL通路的激活研究了鎘誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡過程中Fas/FasL通路對(duì)MAPK通路激活的影響。結(jié)果表明，抑制Fas/FasL通路可抑制鎘激活MAPK通路誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡，如圖8所示。