權(quán) 衡，陳啟偉，宮曉煒，王燕萍，秦明星，朱雨佳，鄭福英*，藺國珍*

(1.西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，蘭州 730030；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所，家畜疫病病原生物學(xué)國家重點實驗室，蘭州 730046)

鴨疫里默氏桿菌(Riemerellaanatipestifer，R.anatipestifer)是黃桿菌科里默氏菌屬的一種桿狀或橢圓狀、無芽胞、無鞭毛、可形成莢膜的革蘭陰性菌。該菌主要感染1～5周齡的雛鴨，可通過呼吸道、皮膚傷口和消化道等多種途徑導(dǎo)致鴨的急性或慢性敗血癥和漿膜炎。目前公認的鴨疫里默氏桿菌的血清型有21種，我國主要流行的菌株為血清1型、2型和10型。目前鴨疫里默氏桿菌在全國均有流行，血清型也不盡相同，并且不同血清型的菌株之間無交叉保護作用，給疫苗預(yù)防增加了很大難度。所以利用抗生素進行預(yù)防和治療成為控制鴨疫里默氏桿菌感染和流行的重要手段，同時很大程度上增加了多重耐藥菌株的出現(xiàn)和傳播[1]。

細菌耐藥可分為固有性耐藥和獲得性耐藥兩大類。細菌的耐藥機制有多種，如外排泵的外排、細胞膜通透性的改變、藥物靶點基因的突變、滅活酶、鈍化酶、修飾酶的產(chǎn)生等[2]。外排泵系統(tǒng)是介導(dǎo)細菌固有性和獲得性耐藥的一種主要機制，研究外排泵使我們更加了解轉(zhuǎn)運蛋白的結(jié)構(gòu)和功能[3]。到目前為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了8種與細菌多重耐藥相關(guān)的外排泵，其中有近一半屬于普遍存在的ABC和MFS蛋白家族[4-5]。

MFS轉(zhuǎn)運蛋白家族是目前已知的最大的膜轉(zhuǎn)運蛋白家族之一，存在于從細菌到植物和哺乳動物的所有門中，其功能與許多生命活動息息相關(guān)[6]，通常作為單組分泵，能夠?qū)⑿∪苜|(zhì)通過內(nèi)膜轉(zhuǎn)運。MFS轉(zhuǎn)運蛋白主要作用于糖的吸收，但一些MFS蛋白也參與藥物外排，從而導(dǎo)致細菌產(chǎn)生耐藥性[7]。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)多株鴨疫里默氏桿菌為多重耐藥菌，對其進行全基因組測序和比較基因組學(xué)分析，并應(yīng)用qPCR、EB外排、CCCP和PAβN外排泵抑制劑等方法進行研究后，發(fā)現(xiàn)在鴨疫里默氏桿菌基因組上主要存在MFS、RND和ABC三類外排泵[8]。本試驗研究的Rant蛋白屬于MFS外排泵，rant基因在目前已發(fā)表的鴨疫里默氏桿菌基因組序列中高度保守，核苷酸序列相似性為89.24%～100.00%，氨基酸序列相似性為94.07%～100.00%。

rant基因在RA-LZ01株基因組中的編號為GE296_RS02115，位于458 069—459 286 bp，開放讀碼框大小1 218 bp，編碼405個氨基酸，其蛋白分子量大小為44.5 ku。用TMHMM2.0分析其結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)Rant蛋白的跨膜螺旋數(shù)為12個。依據(jù)MFS蛋白序列的水解分析和拓撲學(xué)結(jié)構(gòu)預(yù)測，幾乎所有的MFS蛋白都具有一個統(tǒng)一的由親水環(huán)連接的12個跨膜α螺旋(TMs)組成的拓撲學(xué)結(jié)構(gòu)，其N-端和C-端都位于細胞質(zhì)中[9]。用TMHMM2.0預(yù)測出的Rant蛋白的結(jié)構(gòu)符合MFS蛋白的結(jié)構(gòu)特征，支持Rant蛋白屬于MFS家族。

目前關(guān)于鴨疫里默氏桿菌MFS外排泵rant基因的功能還未見報道，因此本研究以野生株RA-LZ01作為親本株，構(gòu)建rant基因缺失株Δrant和回復(fù)株cΔrant，對野生株RA-LZ01、缺失株Δrant和回復(fù)株cΔrant進行藥敏試驗、測定菌株的生長動態(tài)和致病性，研究rant基因在菌株耐藥性、生長和毒力等方面發(fā)揮的生物學(xué)功能。

1 材料與方法

1.1 試驗菌株和質(zhì)粒

鴨疫里默氏桿菌RA-LZ01(GenBank登錄號：NZ_CP045564.1)和LJW-2保存于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所草食動物細菌病創(chuàng)新團隊實驗室；大腸桿菌ATCC25922購自美國菌種保藏中心(American type culture collection)；大腸桿菌X7213和自殺質(zhì)粒pRE112購自NTCC國家典型培養(yǎng)物保藏中心；穿梭質(zhì)粒pCPRA由本實驗室構(gòu)建。

1.2 培養(yǎng)基、試劑及儀器

胰蛋白胨大豆肉湯(TSB)和胰蛋白胨大豆瓊脂(TSA)購自美國DifcoTM公司；2,6-二氨基庚二酸(DAP)購自東京化成工業(yè)株式會社；LB肉湯、LB瓊脂、抗生素均購自北京Solarbio公司；DNA Marker、限制性內(nèi)切酶XbaⅠ、SphⅠ、PstⅠ、T4連接酶、質(zhì)粒提取試劑盒與膠回收試劑盒均購自TaKaRa(大連)公司；0.22 μm無菌硝酸纖維素濾膜和濾膜裝置購自Millipore公司；紫外分光光度計購于美國 Backman 公司；臺式高速離心機購自Beckman公司；PCR儀購自杭州博日科技公司；酶標(biāo)儀購自自美國Bio-Rad公司；CO2培養(yǎng)箱購自美國Thermo公司；搖床購自上海蘇坤實業(yè)有限公司。

1.3 引物設(shè)計

本研究所用的引物的名稱及其對應(yīng)序列等信息見表1，引物OmpA-F/OmpA-R引用自文獻[10]，其他引物均為本研究中作者設(shè)計。引物由西安擎科澤西生物科技有限責(zé)任公司合成。

表1 PCR引物名稱和序列Table 1 PCR primers and sequences used in this study

1.4 構(gòu)建基因缺失株Δrant

以親本株RA-LZ01和LJW-2菌株基因組為模板，用引物Up-F/Up-R、Erm-F/Erm-R和Do-F/Do-R分別擴增出rant基因上游同源臂、紅霉素基因ermF和下游同源臂，采用融合PCR將上述DNA片段依次融合，用XbaⅠ和SphⅠ將融合的DNA片段克隆至pRE112載體，轉(zhuǎn)化于用CaCl2法制備的大腸桿菌X7213感受態(tài)細胞中，在含50 mg·L-1氯霉素和50 mg·L-1DAP的LB固體平板篩選。用引物Up-F/Do-R進行PCR驗證，并測序比對。得到重組自殺質(zhì)粒pRE112-ErmF和陽性供體菌X7213-pRE112-ErmF[10]。

采用結(jié)合轉(zhuǎn)移和同源重組的方法構(gòu)建基因缺失株[10]。即將供體菌X7213-pRE112-ErmF和受體菌RA-LZ01分別培養(yǎng)至OD600 nm約0.6和1.0。收集菌體后用0.01 mol·L-1的MgSO4溶液洗滌、重懸后混合，用0.22 μm無菌硝酸纖維素膜過濾后將濾膜貼于含有50 mg·L-1DAP的TSA平板，培養(yǎng)24 h，用MgSO4溶液洗下菌苔，在含1 mg·L-1紅霉素、2 mg·L-1多黏菌素B、5%胎牛血清的TSA平板上篩選，用引物OmpA-F/OmpA-R、Rant-F/Rant-R和Erm-F/Erm-R進行PCR驗證。同時用引物Rant-缺失測序-F/Rant-缺失測序-R擴增后進行測序并比對。鑒定合適的菌株命名為Δrant。

1.5 構(gòu)建基因回復(fù)株cΔrant

大腸桿菌-鴨疫里默氏桿菌穿梭質(zhì)粒pCPRA系在前期工作中構(gòu)建完成[11]。以親本株RA-LZ01為模板，用引物“Co-F/Co-R”擴增出帶有PstⅠ和SphⅠ酶切位點的rant基因，克隆進pCPRA載體，轉(zhuǎn)化于用CaCl2法制備的大腸桿菌X7213感受態(tài)細胞中，在含100 mg·L-1氨芐和50 mg·L-1DAP的LB固體平板上篩選。用引物“Co-F/Co-R”進行PCR擴增并進行測序比對。得到重組穿梭質(zhì)粒pCPRA-Rant 和陽性供體菌X7213-pCPRA-Rant。同樣利用結(jié)合轉(zhuǎn)移的方法將重組穿梭質(zhì)粒pCPRA-Rant導(dǎo)入缺失株Δrant中構(gòu)建回復(fù)株[10]。在含有1 mg·L-1頭孢西丁的TSA平板上篩選，用引物“OmpA-F/OmpA-R”和“Rant-F/Rant-R”進行PCR驗證，同時用引物“Rant-回復(fù)測序-F/Rant-回復(fù)測序-R”擴增后進行測序并比對。鑒定合適的回復(fù)株命名為cΔrant。

1.6 構(gòu)建菌株穩(wěn)定性測定

缺失株Δrant在含1 mg·L-1紅霉素的TSB中增菌至OD600 nm約1.0，劃線于相同抗性的TSA平板，37 ℃ 5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)至長出單菌落，然后隨機挑取單菌落增菌后繼續(xù)劃板，用此方法傳30代。用引物“OmpA-F/OmpA-R”和“Erm-F/Erm-R”對第1、5、10、15、20、25、30代的菌液進行PCR以驗證缺失株Δrant的穩(wěn)定性。用同樣的方法，將回復(fù)株cΔrant在含1 mg·L-1頭孢西丁的TSB和TSA平板中傳代，用引物“OmpA-F/OmpA-R”和“Co-F/Co-R”進行PCR以驗證回復(fù)株cΔrant的穩(wěn)定性。用引物“Rant-缺失測序-F/Rant-缺失測序-R”和“Rant-回復(fù)測序-F/Rant-回復(fù)測序-R”分別擴增第30代缺失株和回復(fù)株，測序并比對結(jié)果。

1.7 各菌株MIC的測定

用微量肉湯稀釋法測定抗生素對RA-LZ01、Δrant和cΔrant的最小抑菌濃度(minimal inhibitory concentration，MIC)[12-13]。大腸桿菌ATCC25922作為質(zhì)控菌株。將抗生素用TSB在96孔板中以2倍連續(xù)稀釋，抗生素濃度為0.25～128.00 mg·L-1，同時設(shè)置陰性對照(培養(yǎng)基)和陽性對照(菌株)。將菌液增菌至OD600 nm約1.0，用TSB將菌液濃度調(diào)整為107CFU (colony-forming unit，CFU)·mL-1，每孔加入100 μL菌液(106CFU)。37 ℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48 h，在酶標(biāo)儀中測量其OD600 nm，確定抗生素抑制菌株生長的MIC。此試驗重復(fù)3次。

1.8 各菌株生長曲線測定

分別將RA-LZ01、Δrant和cΔrant培養(yǎng)至OD600 nm約1.0，并測定每個菌株的CFU，調(diào)整每個菌株的起始濃度均為109CFU·mL-1。以1∶100的比例分別接種至10 mL TSB中，即每個菌株的接種量均為108CFU。37 ℃ 200 r·min-1培養(yǎng)，每隔1 h取130 μL菌液用紫外分光光度計測量其OD600 nm值，共測定12 h。每個菌株做3組平行試驗[14-15]。

1.9 各菌株致病性測定

分別將RA-LZ01、Δrant和cΔrant培養(yǎng)至OD600 nm約1.0，并測定每個菌株的CFU，調(diào)整每個菌株的起始濃度均為109CFU·mL-1。將1周齡櫻桃谷鴨隨機分為4組，每組10只，每只腿部肌內(nèi)注射100 μL菌液(108CFU)。1～3組分別接種RA-LZ01、Δrant和cΔrant，第4組注射生理鹽水作為陰性對照。攻毒后連續(xù)觀察14 d制作生存曲線。

2 結(jié) 果

2.1 基因缺失株Δrant和基因回復(fù)株cΔrant的構(gòu)建

用引物Up-F/Do-R進行PCR擴增，并對得到的PCR產(chǎn)物進行測序，證實成功構(gòu)建重組供體菌X7213-pRE112-ErmF。用引物“OmpA-F/OmpA-R”、“Erm-F/Erm-R”和“Rant-F/Rant-R”對基因缺失株Δrant進行PCR鑒定。若ompA和ermF基因擴增出目的條帶，同時rant基因不能擴增出目的條帶，即為Δrant。以引物“Co-F/Co-R”進行PCR擴增并測序鑒定后，證實成功構(gòu)建重組供體菌X7213-pCPRA-Rant。用引物“OmpA-F/OmpA-R”“Rant-F/Rant-R”進行PCR鑒定回復(fù)株cΔrant，若ompA和rant基因均能擴增出目的條帶，即為cΔrant。同時用引物“Rant-缺失測序-F/Rant-缺失測序-R”和引物“Rant-回復(fù)測序-F/Rant-回復(fù)測序-R”擴增并測序后，證實基因缺失株和基因回復(fù)株均構(gòu)建成功(圖1)。

A.缺失株Δrant的鑒定；B.回復(fù)株cΔrant的鑒定；M.DL2000 DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.ompA基因的PCR擴增；2.ermF 基因的PCR擴增；3.rant基因的PCR擴增A.Identification of the deletion strain Δrant;B.Identification of the complemented strain cΔrant;M.DL2000 DNA relative molecular mass standard;1.PCR amplification of ompA gene;2.PCR amplification of ermF gene;3.PCR amplification of rant gene圖1 缺失株Δrant和回復(fù)株cΔrant的鑒定Fig.1 Identification of the deletion strain Δrant and the reverting strain cΔrant

2.2 所構(gòu)建菌株的穩(wěn)定性

穩(wěn)定性結(jié)果顯示，第1、5、10、15、20、25、30代缺失株Δrant均可擴增出ompA和ermF基因(圖2)，回復(fù)株cΔrant可擴增出ompA和rant基因(圖3)，測序結(jié)果均正確。表明缺失株Δrant和回復(fù)株cΔrant均可以穩(wěn)定傳代。

A.ompA基因的PCR擴增；B.ermF基因的PCR擴增；M.DL2000 DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.陽性對照；2～8.第1、5、10、15、20、25、30代菌液；9.陰性對照A.PCR amplification of ompA gene;B.PCR amplification of erythromycin gene;M.DL2000 DNA relative molecular mass standard;1.Positive control;2-8.Amplification from the 1st,5th,10th,15th,20th,25th and 30th generations;9.Negative control圖2 缺失株Δrant穩(wěn)定性測定Fig.2 Determination of stability of deletion strain Δrant

2.3 各菌株的MIC

測定11類27種抗菌素對野生株、缺失株和回復(fù)株的MIC值，結(jié)果顯示：與野生株RA-LZ01相比，四環(huán)素類抗生素中土霉素、強力霉素和四環(huán)素對缺失株Δrant的MIC均減小了75%；與回復(fù)株cΔrant相比，土霉素、強力霉素和四環(huán)素對Δrant的MIC分別減小了75%、50%和75%。其他類抗生素、去污劑和陽離子染料對3種菌的MIC值均無明顯變化(表2)。結(jié)果表明，rant基因介導(dǎo)鴨疫里默氏桿菌對土霉素、強力霉素和四環(huán)素的耐藥性。

A.ompA基因的PCR擴增；B.rant基因的PCR擴增；M.DL2000 DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.陽性對照；2～8.第1、5、10、15、20、25、30代菌液；9.陰性對照A.PCR amplification of ompA gene;B.PCR amplification of rant gene;M.DL2000 DNA relative molecular mass standard;1.Positive control;2-8.Amplification from the 1st,5th,10th,15th,20th,25th and 30th generations;9.Negative control圖3 回復(fù)株cΔrant穩(wěn)定性測定Fig.3 Stability determination of the complemented strain cΔrant

表2 抗生素對鴨疫里默氏桿菌野生株、缺失株及回復(fù)株的MICsTable 2 MICs of antibiotics to R.anatipestifer wild strain,deletion mutant and complemented strain mg·L-1

2.4 各菌株的生長動態(tài)

在整個生長周期中，與野生株RA-LZ01相比，缺失株Δrant的生長速率都明顯減慢(P<0.05)。與回復(fù)株cΔrant相比，Δrant在第4—9小時的生長速率明顯下降(P<0.05)?；貜?fù)株cΔrant的生長動態(tài)與野生株相比無明顯變化(圖4)。

圖4 野生株、缺失株及回復(fù)株生長動態(tài)的測定Fig.4 Determination of the growth rates of wild strain,deletion mutant and complemented strain

2.5 各菌株的致病性

與野生株RA-LZ01相比，缺失株Δrant在攻毒后的第5天雛鴨存活率為100%，而野生株RA-LZ01存活率為50%，回復(fù)株cΔrant存活率為60%。在攻毒后第10天缺失株Δrant的存活率為70%，野生株RA-LZ01的存活率為10%，回復(fù)株Δrant的存活率為30%。這表明rant基因的缺失導(dǎo)致其對雛鴨的致死率顯著降低(圖5)，明顯致弱了野生株RA-LZ01的毒力。當(dāng)rant基因回復(fù)后，回復(fù)株cΔrant的毒力也相應(yīng)得到部分回復(fù)。

圖5 鴨疫里默氏桿菌野生株RA-LZ01、缺失株Δrant和回復(fù)株cΔrant感染鴨的毒力試驗Fig.5 The virulence experiment of R.anatipestifer wild strain RA-LZ01,deletion mutant Δrant and complemented strain cΔrant infecting ducklings

3 討 論

鴨疫里默氏桿菌屬于黃桿菌科，里默氏菌屬，可感染鴨、鵝、雞、火雞等多種家禽，其發(fā)病鴨死亡率可高達75%，是危害養(yǎng)鴨業(yè)最嚴重的致病菌之一，給養(yǎng)鴨業(yè)造成嚴重經(jīng)濟損失。并且不同血清型之間沒有交叉保護給疫苗預(yù)防增加了很大難度[16-17]。在實際生產(chǎn)中使用抗生素預(yù)防和治療鴨疫里默氏桿菌感染是一個有效的防控手段，與此同時也導(dǎo)致細菌耐藥性上升，多重耐藥菌株不斷出現(xiàn)和傳播，給鴨疫里默氏桿菌病的防控帶來巨大挑戰(zhàn)?；诖?，研究鴨疫里默氏桿菌的耐藥機制對于控制耐藥菌株的產(chǎn)生和傳播，提高現(xiàn)有抗生素的應(yīng)用效果，以及開發(fā)針對性更強的新型抗生素均具有重要意義[18]。

自MFS家族確立以來，家族成員被迅速擴大，目前由74個家族成員組成。MFS中眾所周知的多重藥物轉(zhuǎn)運蛋白成員包括大腸桿菌的QacA，ErmAB-TolC系統(tǒng)的ErmB、ErmD、MdfA以及乳酸乳球菌的LmrP[9]。研究表明大腸桿菌MdfA是質(zhì)子電化學(xué)梯度驅(qū)動的藥物/質(zhì)子反向轉(zhuǎn)運體，同時發(fā)現(xiàn)MdfA在弗氏志賀菌、腸炎傷寒沙門菌和鼠疫耶爾森菌中具有同源序列。乳酸乳球菌的多重耐藥轉(zhuǎn)運蛋白LmrP可以利用膜電位和化學(xué)質(zhì)子梯度的質(zhì)子動力來介導(dǎo)兩性底物排出細胞。MFS泵屬于最大的繼發(fā)性膜轉(zhuǎn)運蛋白，是轉(zhuǎn)運糖類、中間代謝產(chǎn)物和藥物必不可少的系統(tǒng)。在MFS家族中研究最多的泵是金黃色葡萄球菌的NorA，枯草芽胞桿菌的同源物Bmr、Blt、Tet和MdfA[9]。

目前已經(jīng)報道了幾種介導(dǎo)鴨疫里默氏桿菌耐藥的基因和外排泵，如鴨疫里默氏桿菌CH-1株中B739_0873基因的缺失導(dǎo)致其對氨基糖苷類和去污劑的敏感性增加[19]；RA-GD菌株中的ABC外排泵RanB介導(dǎo)其對有機溶劑的外排[10]，RND外排泵RaeE-RaeF-RopN介導(dǎo)其對氨基糖苷類抗生素和去污劑SDS的抗性[16]；CH3株中M949_0459基因的缺失導(dǎo)致其對替加環(huán)素敏感性增加[20]；Zhu等[21]從212株鴨疫里默氏桿菌中發(fā)現(xiàn)tet(A)、tet(B)、tet(M)、tet(O)、tet(O/W/32/O)、tet(Q)和tet(X)基因都參與了四環(huán)素類抗生素的耐藥等。本研究的藥敏試驗結(jié)果顯示，鴨疫里默氏桿菌RA-LZ01為1株多重耐藥菌株。當(dāng)將rant基因缺失后菌株對四環(huán)素類抗生素的敏感性明顯增加，而當(dāng)rant基因回補后菌株對四環(huán)素類抗生素的抗性得到了完全或部分回復(fù)。

一些研究發(fā)現(xiàn)，多藥外排泵除了介導(dǎo)細菌對抗生素的抗性，還與細菌的多種表型有關(guān)，其中包括細菌的生長和毒力，例如肺炎克雷伯菌中的AcrB[22]、腸炎沙門菌外排泵系統(tǒng)macAB[23]、結(jié)核分枝桿菌中的MmpL11[24]和鼠傷寒沙門菌中的AcrA[25]和AcrB[26]。本研究也發(fā)現(xiàn)，rant基因缺失后鴨疫里默氏桿菌的生長速率降低，說明rant基因參與菌株的生長。

近年來報道了幾個與鴨疫里默氏桿菌毒力相關(guān)的基因，例如CH3株的鐵離子利用相關(guān)基因tonB[27]和LPS合成相關(guān)基因M949_RS01915[28]；血清2型Th4株的OmpA基因[29]；CH-1菌株的莢膜合成相關(guān)基因wza[30]；Yb2 株的調(diào)控相關(guān)基因luxE(AS87_03730)[31]。研究發(fā)現(xiàn)上述基因缺失后菌株毒力有明顯的下降。Li等[10]報道當(dāng)將鴨疫里默氏桿菌RA-GD菌株ABC外排泵基因RIA_1614缺失后毒力下降了43倍(原文獻表述)。本文中rant基因缺失后導(dǎo)致菌株對鴨的感染力下降，特別是感染急性期鴨的發(fā)病率和死亡率均顯著降低，而當(dāng)rant基因回補后菌株毒力有明顯回復(fù)。這些結(jié)果說明rant基因與鴨疫里默氏桿菌的毒力相關(guān)，但該基因滅活導(dǎo)致菌株毒力下降的機制可能比較復(fù)雜，需進行深入研究。

4 結(jié) 論

成功構(gòu)建鴨疫里默氏桿菌rant基因缺失株Δrant和基因回復(fù)株cΔrant。通過基因功能驗證，發(fā)現(xiàn)rant基因介導(dǎo)鴨疫里默氏桿菌對四環(huán)素類抗生素的耐藥性，也與菌株的生長和毒力有一定的相關(guān)性。