張 鵬，李俞甫，吳尚澤，金圣奇，王家慶，3，Короткова Ирина Павловна，郭文潔*

(1.沈陽(yáng)工學(xué)院生命工程學(xué)院，撫順 113122；2.俄羅斯濱海國(guó)立農(nóng)學(xué)院，烏蘇里斯克市 692506；3.俄羅斯南烏拉爾國(guó)立大學(xué)食品技術(shù)與生物系，車?yán)镅刨e斯克州 454080)

急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)是胰腺的一種外分泌功能障礙，氧化自由基和促炎因子在該病的發(fā)生發(fā)展過程中扮演著重要的角色[1]，因此，除了抗炎以外，抗氧化也是治療急性胰腺炎的手段之一。目前，已有研究發(fā)現(xiàn)，柚皮素通過調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激能夠有效保護(hù)雨蛙素和L-精氨酸誘導(dǎo)的胰腺炎小鼠[2]，相關(guān)研究結(jié)果在異甘草素上也得到證實(shí)，其主要機(jī)制是調(diào)控Nrf2/HO-1信號(hào)通路[3]。核轉(zhuǎn)錄因子Nrf2是細(xì)胞抗氧化反應(yīng)的中樞調(diào)節(jié)者，Nrf2通過與抗氧化原件HO-1相互作用調(diào)節(jié)抗氧化酶的表達(dá)，發(fā)揮抗氧化作用[4]。丹皮酚(C9H10O3，paeonol，PAE)是從毛茛科植物牡丹根皮中提取，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤以及保護(hù)神經(jīng)等藥理作用[5]。丹皮酚及其衍生物的化學(xué)結(jié)構(gòu)中具有酚羥基官能團(tuán)，在抗氧化、去除氧自由基[6]方面效果顯著。因此，本課題組在前期丹皮酚體外抗氧化研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討其體內(nèi)抗氧化能力，并深入探究丹皮酚在急性胰腺炎小鼠中的抗氧化機(jī)制，希望從分子水平證明丹皮酚的體內(nèi)抗氧化能力。近年來，盡管急性胰腺炎的相關(guān)研究成果頗多，但臨床治療方法及藥物較為單一。因此，研究治療急性胰腺炎的有效藥物對(duì)臨床治療此癥具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

昆明系雄性小鼠50只，體質(zhì)量18～22 g，SPF級(jí)，購(gòu)自遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)股份有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(遼)2020-0001。

1.2 試劑

丹皮酚(純度>98.5%)和L-精氨酸(純度≥98%)均購(gòu)自大連美侖生物技術(shù)有限公司；血清丙二醛(MDA)檢測(cè)試劑盒(A003-1)和總超氧化物歧化酶(SOD)檢測(cè)試劑盒(A001-3)均購(gòu)自南京建成生物科技有限公司；MPO一抗、二抗、組化試劑盒、DAB 顯色劑、蘇木素染液、蘇木素分化液等均購(gòu)自Servicebio公司；Nrf2(稀釋度1∶600)、Keap1(稀釋度1∶600)抗體均購(gòu)自美國(guó)ImmunoWay 生物公司；HO-1(稀釋度1∶600)和β-actin(稀釋度1∶4 000)抗體均購(gòu)自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；BCA蛋白質(zhì)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物有限公司。其他常用試劑購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.3 試驗(yàn)分組與設(shè)計(jì)

試驗(yàn)將小鼠隨機(jī)分成5組，每組10只，分別為空白對(duì)照組、AP模型組和丹皮酚高、中、低劑量組。按小鼠體重，丹皮酚高、中、低劑量組每組小鼠分別灌胃劑量為100、50、25 mg·kg-1丹皮酚，每天灌胃1次，連續(xù)灌胃5 d，每次0.5 mL，同時(shí)空白對(duì)照組和AP模型組給予等體積生理鹽水。試驗(yàn)最后一天對(duì)高、中、低劑量組小鼠灌胃丹皮酚30 min后，再對(duì)AP模型組和丹皮酚高、中、低劑量組小鼠腹腔注射4 g·kg-1的20%L-精氨酸，建立小鼠AP模型。空白對(duì)照組小鼠腹腔注射等量生理鹽水。6 h后檢測(cè)各組小鼠血清中MDA含量和SOD活力。與此同時(shí)，取各組小鼠胰腺組織分別用于相關(guān)基因、蛋白表達(dá)檢測(cè)和MPO免疫組化切片制作。

1.4 測(cè)定指標(biāo)與方法

1.4.1 剖檢肉眼觀察胰腺組織的病理變化 肉眼觀察各組小鼠胰腺組織的病理變化。主要對(duì)胰腺的大小、形狀以及顏色變化，胰腺組織有無出血點(diǎn)、出血斑，是否有壞死灶等進(jìn)行觀察，并用照相機(jī)拍照記錄。

1.4.2 胰腺組織MPO免疫組化染色 制作胰腺組織的 MPO 免疫組化切片，觀察胰腺組織中 MPO 的分布及表達(dá)。切片、封閉、洗片、一抗孵育、洗片、二抗孵育、洗片、DAB顯色操作后，顯微鏡下觀察，陽(yáng)性表達(dá)產(chǎn)物會(huì)被染成棕褐色。比較各試驗(yàn)組中 MPO的分布及表達(dá)。

1.4.3 小鼠氧化指標(biāo)檢測(cè) 按照試劑盒檢測(cè)方法，測(cè)定各組小鼠血清的MAD含量和SOD活力。

1.4.4 小鼠胰腺組織目的基因mRNA表達(dá)量測(cè)定 測(cè)定小鼠胰腺組織中HO-1、Keap1和Nrf2的mRNA表達(dá)量變化。取小鼠胰腺組織制備胰腺組織裂解液，提取胰腺組織總RNA，通過反轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA，以cDNA為模板，采用HO-1、Keap1和Nrf2基因引物(詳見表1)，按照課題組前期摸索的試驗(yàn)條件，以cDNA模板1 μL，上游和下游引物(10 μmol·L-1)各0.5 μL，SYBR GREEN mastermix 10 μL，用dd H2O補(bǔ)足至20 μL的體系，進(jìn)行Real-time PCR檢測(cè)，并利用2-△△CT方法分析結(jié)果。

表1 RT-PCR引物序列Table 1 The primer sequences used in the real-time PCR

1.4.5 小鼠胰腺組織目的蛋白表達(dá)量測(cè)定 按照總蛋白提取試劑盒說明書操作提取小鼠胰腺組織總蛋白，采用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒定量蛋白樣本，蛋白定量后按照每孔20 μL蛋白上樣液上樣并進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳條件為電壓80 V，恒壓電泳2.5 h，電泳完成后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，之后采用5%的脫脂奶粉進(jìn)行膜的封閉，分別用HO-1、Keap1和Nrf2一抗4 ℃過夜孵育，相應(yīng)二抗37 ℃孵育45 min。加入ECL進(jìn)行底物發(fā)光后，掃描膠片，分析蛋白條帶的灰度值。

1.6 試驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

所有數(shù)據(jù)需要進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，使用SPSS Statistics 17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行一維方差分析，經(jīng)過分析之后的各組試驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果均列入三線表中。

2 結(jié) 果

2.1 胰腺組織病理變化觀察

腹腔注射20%L-精氨酸6 h后，各組小鼠胰腺組織病理變化見圖1。圖1B為AP型組，與空白對(duì)照組相比，小鼠胰腺組織出現(xiàn)明顯的紅腫、出血、水腫等病理變化。不同劑量丹皮酚組對(duì)急性胰腺炎小鼠胰腺組織均有改善作用，其中，中劑量組和高劑量組效果較明顯。

A.空白對(duì)照組；B.急性胰腺炎模型組；C.丹皮酚低劑量組；D.丹皮酚中劑量組；E.丹皮酚高劑量組A.Blank control group;B.AP model group;C.Paeonol low-dose group;D.Paeonol medium-dose group;E.Paeonol high-dose group圖1 肉眼觀察小鼠胰腺組織病理變化Fig.1 The pathological changes of pancreatic tissue in mice were observed by naked eyes

2.2 胰腺組織MPO免疫組化染色

髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)又稱過氧化物酶，是血紅素輔基的血紅素蛋白酶，存在于中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞的嗜苯胺藍(lán)顆粒中，是髓細(xì)胞的特異性標(biāo)志[7]。為了進(jìn)一步了解20%L-精氨酸對(duì)小鼠胰腺組織造成的損傷程度，考察不同劑量丹皮酚對(duì)急性胰腺炎胰腺組織的改善情況，本試驗(yàn)制作MPO免疫組化切片，觀察MPO的分布及表達(dá)。如圖2所示，圖2B為AP模型組，與空白對(duì)照組相比，胰腺組織發(fā)生嚴(yán)重的崩解現(xiàn)象，組織間隙增寬，如箭頭所示出現(xiàn)大量單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，其中，中性粒細(xì)胞被染成棕黃色，說明出現(xiàn)明顯的氧化損傷及炎癥反應(yīng)。不同劑量組丹皮酚有不同程度的MPO分布，隨著劑量的增加，如圖2C～E所示，MPO表達(dá)及分布明顯減少。不僅如此，隨著丹皮酚劑量的增加，胰腺組織病理?yè)p傷也得到明顯的改善，尤其是高劑量組丹皮酚，接近于空白對(duì)照組。

2.3 小鼠血清MDA和SOD檢測(cè)

如表2 所示，與空白對(duì)照相比，AP模型組MDA含量和SOD活力極顯著上升(P<0.01)，說明小鼠AP模型構(gòu)建成功。而經(jīng)過丹皮酚預(yù)處理的藥物組與AP模型組相比，丹皮酚不同劑量組小鼠血清MDA含量均極顯著下降且具有劑量依賴性；丹皮酚不同劑量組小鼠血清SOD的活力均極顯著上升且具有劑量依賴性。

表2 丹皮酚對(duì)急性胰腺炎小鼠血清中SOD活力和MDA含量的影響Table 2 Effect of paeonol on SOD activity and MDA content in serum of mice with acute pancreatitis

A.空白對(duì)照組；B.急性胰腺炎模型組；C.丹皮酚低劑量組；D.丹皮酚中劑量組；E.丹皮酚高劑量組A.Blank control group;B.AP model group;C.Paeonol low-dose group;D.Paeonol medium dose-group;E.Paeonol high-dose group圖2 小鼠胰腺組織MPO免疫組化結(jié)果(400×)Fig.2 MPO immunohistochemical results of pancreatic tissue in mice (400×)

2.4 丹皮酚對(duì)急性胰腺炎小鼠Nrf2/HO-1通路的影響

2.4.1 丹皮酚對(duì)急性胰腺炎小鼠Nrf2/HO-1通路中相關(guān)基因表達(dá)的影響 采用Real-time PCR檢測(cè)小鼠胰腺組織HO-1、Keap1和Nrf2基因mRNA相對(duì)表達(dá)量，如圖3所示，與空白對(duì)照組相比，AP模型組HO-1、Keap1和Nrf2 mRNA表達(dá)量極顯著升高。與AP模型組相比，不同劑量丹皮酚組Nrf2 mRNA表達(dá)量極顯著升高(P<0.01)，Keap1 mRNA表達(dá)量極顯著降低(P<0.01)，中、高劑量丹皮酚組HO-1 mRNA表達(dá)量極顯著升高(P<0.01)，低劑量組無顯著變化。

圖3 小鼠胰腺組織HO-1、Keap1以及Nrf2 mRNA表達(dá)結(jié)果Fig.3 mRNA expression of HO-1,Keap1 and Nrf2 in mouse pancreatic tissue

2.4.2 丹皮酚對(duì)急性胰腺炎小鼠Nrf2/HO-1通路中相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 采用Western blot法得到HO-1、Keap1、Nrf2及內(nèi)參蛋白條帶，如圖4所示，與空白對(duì)照組相比，AP模型組HO-1、Keap1和Nrf2蛋白表達(dá)量極顯著升高(P<0.01)。與AP模型組相比，不同劑量丹皮酚組HO-1、Nrf2蛋白表達(dá)量極顯著升高(P<0.01)，Keap1蛋白表達(dá)量極顯著降低(P<0.01)。不同劑量丹皮酚組各蛋白表達(dá)量呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系。

圖4 小鼠胰腺組織HO-1、Keap1以及Nrf2蛋白表達(dá)結(jié)果Fig.4 Expression of HO-1，Keap1 and Nrf2 protein in mouse pancreatic tissue

3 討 論

小鼠AP模型建立方法有很多，20%L-精氨酸溶液為常見誘導(dǎo)藥物之一，其具有操作簡(jiǎn)單、重復(fù)性好、對(duì)模型動(dòng)物應(yīng)激較小等優(yōu)點(diǎn)，有學(xué)者比較牛黃膽酸鈉、雨蛙肽、L-精氨酸誘導(dǎo)急性胰腺炎效果時(shí)發(fā)現(xiàn)，L-精氨酸誘導(dǎo)AP動(dòng)物模型更具重復(fù)性[8-9]。本課題組前期已完成該模型的建立，試驗(yàn)證明，20%L-精氨酸誘導(dǎo)的小鼠急性胰腺炎模型具有可重復(fù)性、臨床癥狀明顯以及病理變化典型等優(yōu)點(diǎn)。因此，本研究采用4 g·kg-1的20%L-精氨酸腹腔注射構(gòu)建小鼠AP模型。在正常情況下，機(jī)體處于氧化與抗氧化的動(dòng)態(tài)平衡中，當(dāng)機(jī)體受到外來因素刺激時(shí)，往往會(huì)打破此平衡。研究發(fā)現(xiàn)，劇烈的炎癥反應(yīng)是引起氧化應(yīng)激的主要因素之一[10]。因此，本試驗(yàn)通過構(gòu)建小鼠AP模型，考察胰腺炎中的氧化應(yīng)激反應(yīng)，探究抗氧化在保護(hù)胰腺炎中的作用，為急性胰腺炎的發(fā)病機(jī)制、治療方案以及相關(guān)藥物的研發(fā)提供理論依據(jù)。

臨床調(diào)查發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激給畜牧業(yè)生產(chǎn)帶來極大損害，除造成免疫失敗和誘發(fā)家畜傳染病以外，亦會(huì)造成奶牛、肉牛、蛋雞和豬生產(chǎn)性能下降，嚴(yán)重時(shí)會(huì)造成動(dòng)物大面積死亡[11]。當(dāng)機(jī)體抗氧化能力減弱甚至消失時(shí)，機(jī)體會(huì)產(chǎn)生大量自由基，進(jìn)而發(fā)生氧化損傷，自由基的過量產(chǎn)生會(huì)導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化，這是細(xì)胞損傷的重要原因之一，MDA是脂質(zhì)過氧化的主要產(chǎn)物[12]。因此，本試驗(yàn)考察不同劑量丹皮酚對(duì)AP小鼠血清MDA含量的影響，從而評(píng)估丹皮酚抗氧化能力。SOD 具有專一清除氧自由基的能力，在自由基引起的炎性疾病中發(fā)揮著不可替代的作用。據(jù)研究報(bào)道，SOD 可有效緩解關(guān)節(jié)炎、急性氣管炎、胸膜炎等炎性疾病中的氧化損傷[13]。因此，本試驗(yàn)通過檢測(cè)各組小鼠血清SOD活力，闡明丹皮酚體內(nèi)抗氧化能力。

炎性疾病中MPO往往會(huì)催化機(jī)體各種化學(xué)反應(yīng)，生成過量的氧化劑，造成機(jī)體氧化損傷[14]。因此，本文利用MPO免疫組化試驗(yàn)，考察丹皮酚對(duì)MPO表達(dá)的影響。為了進(jìn)一步探究丹皮酚對(duì) 20%L-精氨酸誘導(dǎo)的小鼠胰腺氧化應(yīng)激的保護(hù)機(jī)制，本試驗(yàn)對(duì)抗氧化相關(guān)基因mRNA表達(dá)量以及蛋白含量進(jìn)行了測(cè)定。核因子NF-E2相關(guān)因子2(Nrf2)是一種重要的氧化還原敏感性轉(zhuǎn)錄因子，對(duì)維持機(jī)體抗氧化及防御氧化損傷有重要作用[15]。有研究認(rèn)為，Nrf2通過與抗氧化元件HO-1相互作用調(diào)節(jié)抗氧酶的表達(dá)發(fā)揮抗氧化作用[16]。Song等[17]在研究丹皮酚對(duì)載脂蛋白E(ApoE)缺乏小鼠動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展全過程的保護(hù)作用時(shí)發(fā)現(xiàn)，丹皮酚能夠通過提高SOD活性及降低MDA含量進(jìn)而發(fā)揮抗氧化的作用。Li等[18]在探討丹皮酚對(duì)結(jié)扎性牙周炎大鼠的保護(hù)作用時(shí)發(fā)現(xiàn)，丹皮酚能通過增強(qiáng)Nrf2活性，從而減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)，以達(dá)到有效的保護(hù)作用。此外，還有多項(xiàng)研究顯示，丹皮酚可通過激活Nrf2/HO-1通路緩解糖尿病腎纖維化及急性酒精誘發(fā)的肝損傷[19-20]。本研究發(fā)現(xiàn)，丹皮酚可激活Nrf2/HO-1通路，極顯著升高Nrf2/HO-1，降低Keap1 mRNA和蛋白表達(dá)，有效減少胰腺M(fèi)DA含量及MPO的表達(dá)，同時(shí)提高SOD活性。

4 結(jié) 論

本研究根據(jù)課題組前期研究成果，進(jìn)一步將丹皮酚應(yīng)用于急性胰腺炎小鼠，探討基于Nrf2/HO-1信號(hào)通路下丹皮酚對(duì)20%L-精氨酸誘導(dǎo)的小鼠急性胰腺炎氧化損傷的保護(hù)作用。研究發(fā)現(xiàn)，不同劑量丹皮酚通過激活Nrf2/HO-1信號(hào)通路可以有效阻止自身氧化損傷。本試驗(yàn)結(jié)果為臨床急性胰腺炎的治療提供有效替代藥物，同時(shí)也為急性胰腺炎發(fā)病機(jī)制的研究提供新思路。