王素華，王忠才，黃凌哲，莫虹斐，吳紹強(qiáng)，呂繼洲，趙治國，帥江冰

(1.溫州海關(guān)綜合技術(shù)服務(wù)中心，溫州 325027；2.杭州海關(guān)技術(shù)中心，杭州 310012； 3.中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院動(dòng)物檢疫所，北京 100029；4.呼和浩特海關(guān)技術(shù)中心，呼和浩特 010020)

反芻動(dòng)物埃立克體(Ehrlichiaruminantium)是一類專性細(xì)胞內(nèi)寄生的革蘭陰性細(xì)菌[1]。由反芻動(dòng)物埃立克體引起的疾病統(tǒng)稱心水病，是一種人畜共患的自然疫源性疾病[2]，這種疾病幾乎分布在撒哈拉沙漠以南非洲的所有地區(qū)和加勒比海的一些島嶼上，并傳播至其他國家，其傳播者主要是鈍眼蜱屬的希伯來鈍眼蜱和美洲鈍眼蜱[3-5]。該病是牛、綿羊、山羊及其他反芻動(dòng)物最重要的傳染病之一，臨床癥狀包括發(fā)熱、食欲不振、呼吸困難和猝死，死亡率高達(dá)80%[2，6-7]。心水病的流行與傳播媒介蜱的消長和活動(dòng)規(guī)律相一致，具有明顯的地方性和季節(jié)性[1-7]。心水病不僅威脅農(nóng)牧業(yè)健康發(fā)展和食品安全，對(duì)流行國家造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，而且被認(rèn)為是一種潛在的新出現(xiàn)的人畜共患病[8-9]。

早期診斷可以有效控制反芻動(dòng)物心水病。心水病傳統(tǒng)的診斷方法是基于臨床癥狀的血液涂片鏡檢和血清學(xué)檢測(cè)，這些檢測(cè)方法耗時(shí)較長，難以適應(yīng)快速診斷和控制疫情的需要，也不適合蜱樣本內(nèi)的Ehrlichiaruminantium檢測(cè)[10]。隨著分子檢測(cè)技術(shù)的快速發(fā)展，常規(guī)PCR、套式PCR、LAMP和熒光定量PCR等檢測(cè)技術(shù)已應(yīng)用于反芻動(dòng)物血液和蜱體內(nèi)Ehrlichiaruminantium的檢測(cè)[11-13]。這些檢測(cè)方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，常規(guī)PCR方法特異性和敏感性較低，擴(kuò)增時(shí)容易產(chǎn)生假陽性；LAMP技術(shù)污染的可能性較大，條件控制要求比PCR更嚴(yán)格；套式PCR方法耗時(shí)、污染風(fēng)險(xiǎn)高。為了解決這些問題并滿足定量結(jié)果的需要，本研究將TaqMan和Eva Green熒光定量PCR技術(shù)應(yīng)用于反芻動(dòng)物埃立克體的檢測(cè)和定量分析。因其特異性強(qiáng)、敏感性高、安全省時(shí)，該技術(shù)已在醫(yī)學(xué)檢測(cè)和其他各個(gè)領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。反芻動(dòng)物埃立克體的分子檢測(cè)主要集中在pCS20、16S RNA和map1等基因序列或基因家族[14-15]，本研究針對(duì)pCS20高度保守和特異的基因片段設(shè)計(jì)特異性引物和探針，建立pCS20TqM和pCS20EGqPCR檢測(cè)方法，以便快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)反芻動(dòng)物埃立克體，為心水病的防控及分子流行病學(xué)研究提供技術(shù)支持和試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病原核酸及臨床樣品

反芻動(dòng)物埃立克體(E.ruminantium)、牛巴貝斯蟲(B.bovis)、牛雙芽巴貝斯蟲(B.bigemina)、環(huán)形泰勒蟲(Theileriaannulata)、犬埃立克體(E.Canis)、牛埃立克體(E.bovis)、馬埃立克體(E.equi)和立氏埃立克體(E.risticii)的基因組DNA由溫州海關(guān)綜合技術(shù)服務(wù)中心動(dòng)植物檢疫實(shí)驗(yàn)室提取、合成和保存。鈍眼蜱采自溫州口岸進(jìn)境鹽漬牛皮，-80 ℃保存于溫州海關(guān)綜合技術(shù)服務(wù)中心動(dòng)植物檢疫實(shí)驗(yàn)室。

1.2 主要試劑和儀器

Quick-DNATM提取和純化試劑盒購自ZYMO RESEARCH公司；2×TaqMan?Universal Master Mix II購自美國ABI公司；2×SsoFast Eva Green Supermix預(yù)混液購自美國Bio-Rad公司；TaqDNA聚合酶(5 U·μL-1)、dNTPs(10.0 mmol·L-1)、MgCl2(25 mmol·L-1)、DL5000 DNA Marker均購自寶生物工程(大連)有限公司。qTOWER3G touch熒光定量PCR儀購自德國椰拿公司；Kingfisher Duo Prime全自動(dòng)核酸提取純化儀、NanoDrop2000核酸蛋白分析儀購自美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 引物探針設(shè)計(jì)

pCS20是反芻動(dòng)物埃立克體特異性鑒定基因，根據(jù)GenBank中登錄的反芻動(dòng)物埃立克體pCS20基因(AY236058～AY236069)，用軟件Primer 5.0分別設(shè)計(jì)TaqMan和Eva Green熒光定量PCR引物和探針，使用FAM熒光素標(biāo)記TaqMan熒光定量PCR檢測(cè)探針；在pCS20基因相對(duì)保守區(qū)域設(shè)計(jì)3對(duì)引物，選擇最佳引物序列用于Eva Green熒光定量PCR擴(kuò)增。TaqMan熒光定量PCR引物和探針序列見表1，Eva Green熒光定量PCR引物序列見表2。引物和探針由上海華大基因科技有限公司合成。

表1 pCS20TqM熒光定量PCR引物和探針序列Table 1 Primers and probe for pCS20TqM qPCRs

表2 pCS20EG熒光定量PCR引物序列Table 2 Primers for pCS20EG qPCRs

1.4 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品制備

根據(jù)NCBI中EhrlichiaruminantiumKwanyanga株pCS20基因序列(GenBank登錄號(hào)：AY236063)合成基因片段共1 050 bp，全基因由上海華大基因科技有限公司合成。選擇EcoRⅤ和NdeⅠ兩個(gè)酶切位點(diǎn)，將目的基因克隆于pUC57載體中構(gòu)建重組質(zhì)粒pUC57-pCS20，重組質(zhì)粒經(jīng)鑒定正確后，質(zhì)粒濃度稀釋為20 ng·μL-1，按照公式(6.02×1023拷貝·mol-1)×質(zhì)粒濃度(ng·μL-1)×10-9/(DNA長度×660)=1.74 ×109拷貝·μL-1，作為pUC57-pCS20質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品備用。

1.5 優(yōu)化TaqMan和Eva Green熒光定量PCR反應(yīng)條件

1.5.1 優(yōu)化退火溫度 試驗(yàn)使用qTOWER3G touch熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增和分析，分別以TaqMan?Universal Master Mix II(4440038，ABI,USA)和SsoFast Eva Green?Supermix(1725200，BIO-RAD,USA)作為反應(yīng)緩沖液。在緩沖液試劑盒推薦的反應(yīng)體系下進(jìn)行退火溫度優(yōu)化，TaqMan和Eva Green熒光定量PCR分別設(shè)置51～60 ℃ 10個(gè)整數(shù)值梯度退火溫度，反應(yīng)條件為50 ℃ 2 min去除UNG，95 ℃預(yù)變性10 min，然后95 ℃ 15 s變性，51～60 ℃退火延伸1 min并收集熒光，共40個(gè)循環(huán)。

1.5.2 優(yōu)化反應(yīng)體系 分別在確定退火溫度后對(duì)引物和探針反應(yīng)濃度進(jìn)行優(yōu)化。以20 pmol·μL-1的引物和10 pmol·μL-1的探針各0.25、0.5、0.75、1.0、1.5、2.0 μL進(jìn)行反應(yīng)，選取最佳引物和探針濃度。TaqMan熒光定量PCR 25 μL反應(yīng)體系：TaqMan?Universal Master Mix Ⅱ(2×)12.5 μL，正、反向引物和探針(pCS20 F、pCS20 R和pCS20 probe)各0.25～2.0 μL(6個(gè)濃度梯度)，pUC57-pCS20的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品DNA2.0 μL，加滅菌去離子水補(bǔ)至25 μL。Eva Green熒光定量PCR 25 μL反應(yīng)體系：SsoFast Eva Green?Supermix(2×)12.5 μL，正、反向引物(pCS20 F1～F3和pCS20 R1～R3)各0.25～2.0 μL(6個(gè)濃度梯度)，pUC57-pCS20的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品DNA2.0 μL，加滅菌去離子水補(bǔ)至25 μL。

1.6 特異性試驗(yàn)

利用建立的TaqMan和Eva Green熒光定量PCR方法對(duì)反芻動(dòng)物埃立克體、牛巴貝斯蟲、牛雙芽巴貝斯蟲、環(huán)形泰勒蟲、犬埃立克體、牛埃立克體、馬埃立克體和立氏埃立克體的基因組DNA進(jìn)行檢測(cè)，并以pUC57-pCS20質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品作為陽性對(duì)照，以滅菌去離子水作為陰性對(duì)照，按照“1.5”確定的方法進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，評(píng)價(jià)此方法的特異性。

1.7 敏感性試驗(yàn)

將pUC57-pCS20質(zhì)粒進(jìn)行10倍梯度稀釋，用已建立的反應(yīng)條件進(jìn)行TaqMan和Eva Green熒光定量PCR擴(kuò)增，評(píng)價(jià)此方法的敏感性。

1.8 重復(fù)性試驗(yàn)

將“1.4”制備的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品10倍倍比稀釋，使用4個(gè)濃度梯度進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)，將同一批不同稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)品按建立的方法重復(fù)3次進(jìn)行組內(nèi)重復(fù)試驗(yàn)，對(duì)3次不同時(shí)間段稀釋的同一濃度的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行組間重復(fù)試驗(yàn)，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，分析此方法的重復(fù)性。同時(shí)設(shè)置滅菌去離子水為陰性對(duì)照。

1.9 臨床樣品檢測(cè)

從美國、烏拉圭、蘇丹和南非等不同國家鹽漬牛皮上采集的硬蜱中選取420只鈍眼蜱，其中美國20只、烏拉圭100只、蘇丹和南非各150只，分別用建立的TaqMan、Eva Green熒光定量PCR方法和OIE推薦的套式PCP方法對(duì)420只鈍眼蜱樣本進(jìn)行檢測(cè)。反應(yīng)時(shí)用pUC57-pCS20質(zhì)粒作陽性對(duì)照，用滅菌去離子水作陰性對(duì)照。TaqMan和Eva Green熒光定量PCR以出現(xiàn)典型擴(kuò)增曲線為陽性；套式PCR以電泳檢測(cè)時(shí)出現(xiàn)目的片段，且基因測(cè)序及比對(duì)正確為陽性。

2 結(jié) 果

2.1 TaqMan和Eva Green熒光定量PCR最優(yōu)反應(yīng)條件

經(jīng)退火溫度和引物、探針反應(yīng)濃度優(yōu)化，最終確定了TaqMan和Eva Green熒光定量PCR方法的最佳退火溫度分別為58 ℃和52 ℃，Eva Green熒光定量PCR的最佳引物序列為pCS20 F3和pCS20 R3，稀釋的引物、探針的最佳使用量為0.75 μL。

TaqMan熒光定量PCR反應(yīng)體系：TaqMan?Universal Master Mix II(2×)12.5 μL，正、反向引物和探針(pCS20 F、pCS20 R和pCS20 probe)各0.75 μL，DNA模板2.0 μL，加滅菌去離子水至25 μL。最終確定該反應(yīng)的循環(huán)參數(shù)：50 ℃ 2 min去除UNG，95 ℃ 10 min預(yù)變性；然后95 ℃變性 15 s，58 ℃延伸1 min并收集熒光，共40個(gè)循環(huán)。

Eva Green熒光定量PCR反應(yīng)體系：SsoFast Eva Green?Supermix(2×)12.5 μL，正、反向引物(pCS20 F3和pCS20 R3)各0.75 μL，DNA模板2.0 μL，加滅菌去離子水至25 μL。最終確定該反應(yīng)的循環(huán)參數(shù)：50 ℃ 2 min去除UNG，95 ℃ 10 min預(yù)變性；然后95 ℃變性 15 s，52 ℃延伸1 min并收集熒光，共40個(gè)循環(huán)。

2.2 TaqMan和Eva Green熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

將質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品pUC57-pCS20 10倍梯度稀釋后，以7個(gè)稀釋度進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，通過系統(tǒng)自動(dòng)分析軟件分析，可以得到以Ct值為縱坐標(biāo)，質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品濃度對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)繪制的熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1)。由圖1可知，在102～108拷貝·μL-1的范圍內(nèi)，兩種熒光定量PCR方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線均呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，TaqMan和Eva Green熒光定量PCR線性關(guān)系表達(dá)式分別為：y=-1.273 lnx+39.307和y=-1.587 lnx+36.932，相關(guān)系數(shù)R2在0.99以上，擴(kuò)增效率均高于90%。標(biāo)準(zhǔn)曲線比較理想。

圖1 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品DNA的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.1 TaqMan and Eva Green Real-time PCR standard curves for pCS20 gene

2.3 特異性分析

利用建立的TaqMan和Eva Green熒光定量PCR方法分別對(duì)反芻動(dòng)物埃立克體、牛巴貝斯蟲、牛雙芽巴貝斯蟲、環(huán)形泰勒蟲、犬埃立克體、牛埃立克體、馬埃立克體和立氏埃立克體的基因組DNA進(jìn)行檢測(cè)，并以pUC57-pCS20質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品作為陽性對(duì)照，以滅菌去離子水作為陰性對(duì)照，僅反芻動(dòng)物埃立克體基因組DNA和pUC57-pCS20質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品出現(xiàn)特異性擴(kuò)增曲線(圖2)，表明該檢測(cè)方法的特異性較好。

1.pUC57-pCS20質(zhì)粒；2.反芻動(dòng)物埃立克體；3～10.牛巴貝斯蟲、牛雙芽巴貝斯蟲、環(huán)形泰勒蟲、犬埃立克體、牛埃立克體、馬埃立克體、立氏埃立克體和陰性對(duì)照1.pUC57-pCS20 plasmid；2. Ehrlichia ruminantium；3-9. B. bovis,B. bigemina ,Theileria annulata ,E. Canis ,E. bovis ,E. equi ,E. risticii and Negative control圖2 特異性試驗(yàn)結(jié)果Fig.2 Specific test of TaqMan and Eva Green Real-time PCR assays

2.4 敏感性分析

將濃度為1.74 ×105拷貝·μL-1的pUC57-pCS20質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行10倍梯度稀釋，按照所建立的條件，分別進(jìn)行TaqMan和Eva Green熒光定量PCR擴(kuò)增。結(jié)果表明，TaqMan熒光定量PCR最低可以檢出1.74×101拷貝·μL-1的 pUC57-pCS20質(zhì)粒，Eva Green熒光定量PCR最低可以檢出1.74拷貝·μL-1的 pUC57-pCS20質(zhì)粒(圖3)。

2.5 重復(fù)性分析

為驗(yàn)證所建立檢測(cè)方法的重復(fù)性，對(duì)同一批稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品按照建立的方法重復(fù)3次進(jìn)行組內(nèi)重復(fù)試驗(yàn)，并對(duì)3次不同時(shí)間稀釋的同一濃度的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行組間重復(fù)試驗(yàn)，結(jié)果顯示(表3、4)，TaqMan和Eva Green熒光定量PCR組內(nèi)檢測(cè)的變異系數(shù)為0.00～1.46，組間檢測(cè)的變異系數(shù)為0.49～1.29，表明該方法具有較高的可重復(fù)性。

表3 TaqMan熒光定量PCR的組內(nèi)、組間重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Intra-assay and Inter-assay reproducibility test of the TaqMan Real-time PCR

表4 Eva Green熒光定量PCR的組內(nèi)、組間重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Intra-assay and Inter-assay reproducibility test of the Eva Green Real-time PCR

2.6 臨床樣品檢測(cè)

分別采用TaqMan、Eva Green熒光定量PCR和套式PCR對(duì)420只鈍眼蜱進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如表5所示，上述3種檢測(cè)方法對(duì)鈍眼蜱體內(nèi)埃立克體的檢出率分別為25.48%(107/420)、29.29%(123/420)和24.76%(104/420)。套式PCR檢測(cè)的陽性樣品，TaqMan和Eva Green熒光定量PCR檢測(cè)都為陽性；TaqMan熒光定量PCR檢測(cè)的陽性樣品，Eva Green熒光定量PCR檢測(cè)也都為陽性。對(duì)3種檢測(cè)方法的敏感性進(jìn)行分析，Eva Green熒光定量PCR能檢出單個(gè)拷貝數(shù)的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，TaqMan熒光定量PCR和套式PCR能檢出101拷貝·μL-1的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，Eva Green熒光定量PCR的敏感性更高，能夠檢出痕量的埃立克體DNA。

表5 TaqMan、Eva Green熒光定量PCR和套式PCR對(duì)420個(gè)鈍眼蜱樣品的檢測(cè)結(jié)果Table 5 Results of TaqMan qPCR、EvaGreen qPCR and Nested PCR for 420 Amblyomma samples

1～6.1.74×105～1.74×100 拷貝·μL-1 pUC57-pCS20質(zhì)粒；7.陰性對(duì)照1-6.1.74×105-1.74×100 copies·μL-1 pUC57-pCS20 plasmid；7.Negative control圖3 敏感性試驗(yàn)結(jié)果Fig.3 Sensitivity analysis of TaqMan and Eva Green Real-time PCR assays

3 討 論

心水病是一種致命的細(xì)菌性疾病，20世紀(jì)在美國首次發(fā)現(xiàn)[16]，由反芻動(dòng)物埃立克次體引起，經(jīng)鈍眼蜱傳播，在世界范圍內(nèi)嚴(yán)重威脅人和動(dòng)物健康，曾給人類帶來嚴(yán)重災(zāi)難[8-15]。該病目前主要發(fā)生在發(fā)展中國家，當(dāng)前美國反對(duì)生物恐怖主義已將埃立克體列入生物戰(zhàn)劑名單[17]。心水病是牛、綿羊、山羊和其他反芻動(dòng)物最重要的傳染病之一，急性病例死亡率高，一旦出現(xiàn)癥狀則預(yù)后不良。隨著“一帶一路”等國家經(jīng)濟(jì)發(fā)展戰(zhàn)略的實(shí)施與深入推進(jìn)，我國進(jìn)出境動(dòng)物、動(dòng)物產(chǎn)品和運(yùn)輸工具不斷增加，外來動(dòng)物疫病跨境傳入風(fēng)險(xiǎn)逐年加大。反芻動(dòng)物埃立克體相對(duì)于其他微生物而言，繁殖、傳播快，能夠形成氣溶膠，對(duì)我國牛羊等反芻動(dòng)物主要養(yǎng)殖區(qū)的威脅隨著進(jìn)口貿(mào)易的發(fā)展日益突出，一旦侵入將會(huì)給我國牛羊養(yǎng)殖業(yè)帶來嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。因此，迫切需要研發(fā)和建立快速簡便、精準(zhǔn)有效的檢測(cè)方法作為技術(shù)儲(chǔ)備。pCS20是一個(gè)高度保守和特異的基因，世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)推薦的pCS20套式PCR已應(yīng)用于多種反芻動(dòng)物血液和蜱樣本反芻動(dòng)物埃立克體的檢測(cè)[11,18-19]，但套式PCR耗時(shí)且污染風(fēng)險(xiǎn)高，為了解決這些問題并滿足定量檢測(cè)的需要，qPCRs已用于反芻動(dòng)物埃立克體的檢測(cè)和定量分析。Steyn等[14]利用pCS20基因的qPCRs方法對(duì)心水病疫區(qū)的牛、綿羊和山羊血液及采集的蜱樣本同時(shí)進(jìn)行反芻動(dòng)物埃立克體DNA檢測(cè)，血液樣本的陽性檢出率為3.57%(85/2 381)，蜱樣本的陽性檢出率為24.52%(344/1 403)，作者分析認(rèn)為有可能是在動(dòng)物發(fā)熱反應(yīng)之前采集的蜱樣本，血液中病原體含量較低，而飽血蜱體內(nèi)埃立克體的濃度高于感染動(dòng)物的血液，因此，以飽血蜱為研究對(duì)象的pCS20基因擴(kuò)增可能更適合于確定反芻動(dòng)物的埃立克體攜帶狀況。

本研究選取pCS20基因上高度保守的區(qū)域，建立了反芻動(dòng)物埃立克體TaqMan和Eva Green熒光定量PCR，對(duì)來自非洲和美洲不同國家的420只蜱進(jìn)行檢測(cè)，以驗(yàn)證兩種檢測(cè)方法的敏感性，并評(píng)估心水病疫區(qū)媒介蜱感染反芻動(dòng)物埃立克體的情況。TaqMan熒光定量PCR在PCR擴(kuò)增體系中加入TaqMan探針，其特異性有引物和探針雙重保證，進(jìn)一步增加了結(jié)果的可信度；Eva Green是一種新型染料，具有更強(qiáng)的熒光信號(hào)，Eva Green熒光定量PCR在擴(kuò)增反應(yīng)中不易受PCR抑制劑的影響，大大增加了擴(kuò)增和延伸效率[20-21]。臨床試驗(yàn)結(jié)果表明，本研究建立的TaqMan和Eva Green熒光定量PCR方法敏感性均高于OIE推薦的套式PCR方法，Eva Green熒光定量PCR的敏感度高出TaqMan熒光定量PCR一個(gè)數(shù)量級(jí)。

4 結(jié) 論

建立了兩種快速檢測(cè)反芻動(dòng)物埃立克體的熒光定量PCR檢測(cè)方法，TaqMan和Eva Green熒光定量PCR對(duì)pCS20基因的最低檢測(cè)限分別為17.4和1.74拷貝·μL-1，與牛巴貝斯蟲、牛雙芽巴貝斯蟲、環(huán)形泰勒蟲、犬埃立克體、牛埃立克體、馬埃立克體和立氏埃立克體等無交叉反應(yīng)，特異性好。此方法適合大量臨床樣品的檢測(cè)，可應(yīng)用于心水病臨床診斷和疫情監(jiān)測(cè)，為診斷和防控心水病提供技術(shù)支持。