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        過量賴氨酸對(duì)斷奶仔豬及其腸道上皮細(xì)胞的影響

        2021-07-26 06:34:20賈紅敏馬永航賀平麗譙仕彥
        畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào) 2021年7期
        關(guān)鍵詞:賴氨酸斷奶氨基酸

        賈紅敏,馬永航,賀平麗,譙仕彥,3*

        (1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,北京 100193;2.中牧實(shí)業(yè)股份有限公司,北京 100095;3.生物飼料添加劑北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100193)

        賴氨酸是豬日糧中的第一限制性氨基酸,賴氨酸的需要量是按照日糧配方中特定的百分比表示。以5~10 kg的斷奶仔豬為例,賴氨酸的需要量與豬的品種、斷奶日齡、日糧類型和養(yǎng)殖條件等因素有關(guān)。在適宜范圍內(nèi),賴氨酸水平的提高可以促進(jìn)其他氨基酸的吸收和利用,提高豬的日增重和飼料轉(zhuǎn)化效率,從而改善豬的生長性能[1-2]。當(dāng)賴氨酸缺乏時(shí),機(jī)體自身蛋白質(zhì)降解,蛋白質(zhì)和肌肉組織沉積減少[3]。

        氨基酸只有在被腸道吸收后才能被腸外組織所利用[4],這是畜禽利用日糧蛋白質(zhì)的重要步驟。研究表明,小腸上皮細(xì)胞的增殖與凋亡是維持細(xì)胞正常生理活動(dòng)的重要部分,對(duì)發(fā)揮腸道的正常功能非常重要。哺乳動(dòng)物的腸道上皮細(xì)胞也是體內(nèi)增殖與凋亡最快的細(xì)胞,平均4~5 d更新一次,此過程需要諸多的營養(yǎng)物質(zhì)。氨基酸可促進(jìn)細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞遷移,并維持腸道屏障等功能[5-7]。有研究表明,谷氨酰胺、精氨酸、亮氨酸和谷氨酸可以加快腸道上皮細(xì)胞蛋白質(zhì)的周轉(zhuǎn),從而促進(jìn)細(xì)胞的增殖[8]。同時(shí),氨基酸還可參與相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)載體的調(diào)控,如日糧添加賴氨酸可顯著提高肉雞腸道中b0,+和y+氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體的表達(dá)[9],也可顯著上調(diào)育肥豬回腸中氨基酸和小肽的表達(dá)。此外,單獨(dú)增加葡萄糖或氨基酸的濃度也會(huì)促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖[10]。

        目前,國內(nèi)外關(guān)于賴氨酸過量添加以及營養(yǎng)調(diào)控相關(guān)機(jī)制的研究較少。本研究旨在進(jìn)一步探究在低蛋白質(zhì)玉米-豆粕型日糧與體外培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基中添加過量的賴氨酸,對(duì)斷奶仔豬生長性能、器官指數(shù)、腹瀉率、血液學(xué)指標(biāo)、腸道上皮細(xì)胞增殖等指標(biāo)的影響,并探究其原因,為調(diào)整飼料配方中賴氨酸等氨基酸的添加量提供試驗(yàn)依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 試驗(yàn)動(dòng)物、日糧與細(xì)胞

        動(dòng)物飼養(yǎng)試驗(yàn)在國家飼料工程技術(shù)研究中心豐寧動(dòng)物試驗(yàn)基地進(jìn)行。試驗(yàn)選取144頭28 d斷奶的杜×長×大三元雜交仔豬,初始體重為(8.39±0.02)kg,隨機(jī)分為4組,每組6個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)6頭仔豬(3頭 閹公豬和3頭母豬)。各組仔豬分別飼喂含有不同賴氨酸(1.3%、2.6%、3.9%和5.2%)的玉米-豆粕型日糧。除賴氨酸水平外,所有日糧的其他營養(yǎng)成分基本維持在相同水平。根據(jù)NRC(2012)中規(guī)定的體重在7~11 kg 和11~25 kg仔豬的營養(yǎng)需要量進(jìn)行配制。

        仔豬自由采食和飲水,記錄每日飼養(yǎng)情況和腹瀉情況。飼養(yǎng)28 d后結(jié)束試驗(yàn),并對(duì)所有斷奶仔豬進(jìn)行稱重。

        試驗(yàn)基礎(chǔ)日糧組成和營養(yǎng)成分見表1。本試驗(yàn)所用賴氨酸為98%賴氨酸鹽酸鹽,其L-賴氨酸含量≥78%。

        表1 試驗(yàn)日糧組成及營養(yǎng)水平Table 1 Ingredient composition and nutrient levels of the diets %

        本試驗(yàn)使用的細(xì)胞是豬小腸上皮細(xì)胞(IPEC-J2),培養(yǎng)基是添加10%胎牛血清、1%胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-亞硒酸鈉和5 μg·L-1表皮生長因子的DMEM/F12完全培養(yǎng)基。將IPEC-J2細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中,置于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng),用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù),使細(xì)胞個(gè)數(shù)在104個(gè)·孔-1左右時(shí)進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

        1.2 動(dòng)物屠宰和樣品采集

        在試驗(yàn)結(jié)束時(shí)(28 d),從每欄中挑選1頭體重接近該欄平均值的斷奶仔豬??崭?2 h后,用抗凝真空采血管和非抗凝真空采血管從仔豬前腔靜脈采集血液樣品分別用于血常規(guī)、血生化和血清氨基酸等指標(biāo)分析。非抗凝釆血管采集的血液樣品在4 ℃下,以3 500 r·min-1離心10 min分離血清,分裝后置于-80 ℃保存。所有仔豬采取電擊放血法屠宰,取十二指腸、空腸和回腸組織[11],用磷酸緩沖鹽溶液沖洗食糜后,將腸段浸沒于4%多聚甲醛溶液中,用于后續(xù)的腸道形態(tài)和病理分析。

        1.3 測(cè)定指標(biāo)及方法

        1.3.1 動(dòng)物試驗(yàn)指標(biāo)測(cè)定

        1.3.1.1 日糧組分:日糧的干物質(zhì)、粗蛋白質(zhì)、總磷、鈣、常用氨基酸分別根據(jù)中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 6435—2014[12]、GB/T 6432—2018[13]、GB/T 6437—2018[14]、GB/T 6436—2018[15]、GB/T18246—2019[16]和GB/T15399—2018[17]相應(yīng)方法進(jìn)行測(cè)定。

        1.3.1.2 生長性能及腹瀉率:記錄并計(jì)算0~14 d、15~28 d和0~28 d每欄仔豬的平均日采食量、平均日增重和耗料增重比。每天觀察并記錄每頭豬的糞便情況,并計(jì)算0~14 d、15~28 d和0~28 d斷奶仔豬的腹瀉率,腹瀉率=試驗(yàn)期內(nèi)該欄仔豬腹瀉的總頭次/(該欄豬頭數(shù)×試驗(yàn)天數(shù))×100%[18]。

        1.3.1.3 器官指數(shù):屠宰后,取仔豬的心、肝、脾、肺和腎等器官稱重,并計(jì)算器官指數(shù)。器官指數(shù) =器官重/體重×100%。

        1.3.1.4 血液生理生化指標(biāo):取仔豬的血液樣品,抗凝真空采血管采集的血液用多功能全自動(dòng)血常規(guī)分析儀(MindrayBC-2800,深圳,中國),分析紅細(xì)胞計(jì)數(shù)(red blood cell,RBC)、血紅蛋白(haemoglobin,HGB)、紅細(xì)胞比積(hematokrit,HCT)、平均紅細(xì)胞體積(mean corpuscular volume,MCV)與平均紅細(xì)胞血紅蛋白含量(mean corpuscular hemoglobin,MCH)等血常規(guī)指標(biāo)。

        非抗凝真空采血管采集的血液樣品,分離血清,測(cè)定生化參數(shù)[19]和氨基酸等指標(biāo)。經(jīng)全自動(dòng)生化分析儀(Hitachi 7020,Hitachi High-Technologies Corporation,日本),測(cè)定血清中的總蛋白(total protein,TP)、白蛋白(albumin,ALB)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase,AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase,ALT)等生化指標(biāo)。將0.5 mL血清置于離心試管中,加入1.5 mL磺基水楊酸(4%),振蕩搖勻,冰浴20 min。再加入氫氧化鋰,充分振蕩搖勻,并吸取2 mL置于專用離心管中,4 ℃條件下11 000×g離心30 min,取上清液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾,采用氨基酸分析儀(S-433D氨基酸分析儀,賽卡姆公司,德國),通過鋰離子交換色譜柱與茚三酮在130 ℃的環(huán)境下進(jìn)行衍生反應(yīng),測(cè)定游離氨基酸濃度。免疫球蛋白A(immunoglobulin A,IgA)、免疫球蛋白M(immunoglobulin M,IgM)及免疫球蛋白G(immunoglobulin G,IgG)采用比色法,按照試劑盒(北京華英生物技術(shù)研究所,中國)說明書,使用全自動(dòng)生化儀(日立7160型,日立集團(tuán),日本)進(jìn)行測(cè)定。鈣(calcium,Ca)、鉀(kalium,K)、鈉(sodium,Na)和氯(chlorine,Cl)等無機(jī)離子測(cè)定采用離子電極法,按照Beckman試劑盒說明書,使用(貝克曼DXC800,美國貝克曼庫爾特公司,美國)設(shè)備進(jìn)行測(cè)定。類胰島素生長因子-I(insulin-like growth factor-I,IGF-I)、胰島素(insulin,INS)、胰高血糖素(glucagon,GLU)等激素指標(biāo),按照試劑盒(北京華英生物技術(shù)研究所,中國)說明書,使用全自動(dòng)放免計(jì)數(shù)儀(r-911型,中國科技大學(xué)實(shí)業(yè)總公司,中國)進(jìn)行測(cè)定。

        1.3.1.5 腸道形態(tài):取4%多聚甲醛固定后的十二指腸、空腸和回腸組織,包埋后切為4 μm的切片置于載玻片上,進(jìn)行蘇木精-伊紅染色操作。每個(gè)樣品至少做3張切片,每個(gè)切片選取10個(gè)完整而典型的絨毛視野,利用 Olympus BX 51 顯微鏡(深圳,中國)觀察小腸形態(tài)。通過放大40 × 10倍數(shù),對(duì)絨毛高度和隱窩深度進(jìn)行測(cè)量,并計(jì)算兩者的比值。統(tǒng)計(jì)并記錄每100個(gè)腸上皮細(xì)胞中杯狀細(xì)胞的數(shù)目。

        1.3.1.6 組織病理學(xué):取經(jīng)4%多聚甲醛固定后的肝、腎組織,用石蠟包埋后,經(jīng)過修塊、脫水和包埋等程序后切片,切片制作方法同“1.3.1.5”,用蘇木精-伊紅染色,晾干,在顯微鏡下進(jìn)行組織病理觀察與分析,并拍攝代表性的樣本。

        1.3.2 細(xì)胞處理及指標(biāo)測(cè)定

        1.3.2.1 不同賴氨酸濃度對(duì)IPEC-J2細(xì)胞增殖的影響:以DMEM/F12培養(yǎng)基中已含有的賴氨酸濃度0.5 mmol·L-1為對(duì)照,將IPEC-J2細(xì)胞分別加入1、2、4或8 mmol·L-1的賴氨酸,共5個(gè)處理,每個(gè)處理10個(gè)重復(fù),處理24 h后,通過CCK-8試劑盒測(cè)定細(xì)胞的增殖情況。

        1.3.2.2 氨基酸平衡對(duì)細(xì)胞增殖的影響:以DMEM/F12培養(yǎng)基中原有的賴氨酸濃度為0.5 mmol·L-1為基礎(chǔ),按照DMEM/F12培養(yǎng)基中氨基酸的組分及濃度比例(表2),配制如下處理液:處理1:0.5 mmol·L-1賴氨酸;處理2:2.0 mmol·L-1賴氨酸(4倍濃度);處理3:2.0 mmol·L-1賴氨酸 + 其他必需氨基酸(1~9,4倍濃度);處理4:2.0 mmol·L-1賴氨酸 + 其他必需氨基酸 + 條件性必需氨基酸(1~15,4倍濃度);處理5:2.0 mmol·L-1賴氨酸 + 所有的氨基酸 (1~21,4倍濃度)。將IPEC-J2細(xì)胞處理24 h,每個(gè)處理10個(gè)重復(fù),用CCK-8試劑盒測(cè)定細(xì)胞增殖情況。

        表2 氨基酸的組分及濃度Table 2 Composition and concentration of amino acids

        1.3.2.3 堿性氨基酸平衡對(duì)細(xì)胞增殖情況的影響:以DMEM/F12培養(yǎng)基中原有的賴氨酸濃度0.5 mmol·L-1為基礎(chǔ),以NRC(2012)中仔豬營養(yǎng)需要的堿性氨基酸比例關(guān)系,將IPEC-J2細(xì)胞分別加入以下5個(gè)處理。處理1:0.5 mmol·L-1賴氨酸;處理2:2.0 mmol·L-1賴氨酸;處理3:2.0 mmol·L-1賴氨酸 + 0.91 mmol·L-1精氨酸;處理4:2.0 mmol·L-1賴氨酸 + 0.69 mmol·L-1組氨酸;處理5:2.0 mmol·L-1賴氨酸 + 0.91 mmol·L-1精氨酸 + 0.69 mmol·L-1組氨酸。每個(gè)處理10個(gè)重復(fù),處理24及48 h后,用CCK-8試劑盒測(cè)定細(xì)胞增殖情況。

        1.4 統(tǒng)計(jì)方法

        采用SAS 8.1的GLM模型中的ANOVA程序進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析,通過線性和二次效應(yīng)評(píng)估。若不同處理間存在顯著差異,則進(jìn)一步采用Duncan’s多重比較法進(jìn)行檢驗(yàn)。以平均值和SEM來表示統(tǒng)計(jì)結(jié)果。P<0.05表示差異顯著,P<0.01表示差異極顯著。

        2 結(jié) 果

        2.1 日糧添加不同水平的賴氨酸對(duì)斷奶仔豬生長性能、器官指數(shù)和腹瀉率的影響

        由表3可見,增加SID Lys的劑量顯著降低了斷奶仔豬各階段的ADFI和ADG (P<0.05),提高了F/G (P<0.05),并呈線性關(guān)系(P<0.05)。在1~14、15~28和1~28 d三個(gè)階段,1.3%、2.6%、3.9%和5.2% SID Lys添加組之間ADG均顯著降低(P<0.05)。在試驗(yàn)的任何階段,1.3%和2.6% SID Lys添加組的F/G以及3.9%和5.2% SID Lys添加組的ADFI均無顯著差異(P>0.05)。當(dāng)日糧中添加高劑量的SID Lys時(shí),斷奶仔豬的生長性能受到顯著影響(P<0.05)。日糧SID Lys含量的提高,對(duì)斷奶仔豬的器官指數(shù)和腹瀉率無顯著影響(P>0.05)。

        表3 日糧添加不同水平賴氨酸對(duì)斷奶仔豬生長性能的影響Table 3 Effect of dietary Lys levels on growth performance of weaned piglets

        2.2 日糧添加不同水平的賴氨酸對(duì)斷奶仔豬血液常規(guī)、血清生化、免疫指標(biāo)、無機(jī)離子和生長激素的影響

        從表4可知,日糧SID Lys含量的提高顯著降低了MCV和 MCH(P<0.05),并呈線性關(guān)系(P<0.05),而對(duì)其他的血液常規(guī)指標(biāo)無顯著影響。除Cl-外,日糧SID Lys含量對(duì)斷奶仔豬的血清生化、免疫指標(biāo)、無機(jī)離子和生長激素指標(biāo)無顯著影響(P>0.05)。

        表4 日糧添加不同水平賴氨酸對(duì)斷奶仔豬血液常規(guī)指標(biāo)的影響Table 4 Effect of dietary Lys levels on haematological parameters in weaned piglets

        2.3 日糧添加不同水平的賴氨酸對(duì)斷奶仔豬血清氨基酸的影響

        由表5可知,隨著日糧中SID Lys含量的提高,顯著影響了血清中賴氨酸、組氨酸、亮氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、酪氨酸和鳥氨酸的水平,其中對(duì)必需氨基酸中賴氨酸、亮氨酸、色氨酸和苯丙氨酸的影響還呈線性和二次關(guān)系(P<0.05)。2.6%的SID Lys添加組與對(duì)照組相比,其血清中賴氨酸、亮氨酸、色氨酸、苯丙氨酸等必需氨基酸與非必需氨基酸中酪氨酸、鳥氨酸的含量差異顯著(P<0.05);而2.6%SID Lys日糧添加組與3.9%、5.2%組相比,以上氨基酸的含量基本差異不顯著(P>0.05)。

        表5 日糧添加不同水平賴氨酸對(duì)斷奶仔豬血清游離氨基酸的影響Table 5 Effect of dietary Lys levels on serum amino acid concentrations in weaned piglets μmol·L-1

        2.4 日糧添加不同水平的賴氨酸對(duì)斷奶仔豬腸道形態(tài)的影響

        如表6所示,十二指腸的腸道形態(tài)指標(biāo)不受日糧中Lys的影響(P>0.05)。隨著日糧中SID Lys含量的提高,空腸的絨毛高度顯著降低(P<0.05),且呈線性關(guān)系(P<0.05),其中1.3%和2.6%的SID Lys添加組之間、3.9%和5.2%的SID Lys添加組間差異不顯著(P>0.05)。在回腸中,隱窩深度和杯狀細(xì)胞個(gè)數(shù)受SID Lys含量的顯著影響(P<0.05)。

        表6 日糧添加不同水平賴氨酸對(duì)斷奶仔豬腸道形態(tài)的影響Table 6 Effect of dietary Lys levels on intestinal morphology in weaned piglets

        2.5 日糧添加不同水平的賴氨酸對(duì)斷奶仔豬組織病理學(xué)的影響

        對(duì)斷奶仔豬組織病理學(xué)檢測(cè)(圖略),發(fā)現(xiàn)肝組織部分出現(xiàn)空泡和淋巴細(xì)胞灶等,腎組織部分出現(xiàn)少數(shù)腎球囊輕度擴(kuò)張或髓質(zhì)的間質(zhì)輕度水腫,但組間差異不顯著(P>0.05)。

        2.6 不同濃度的賴氨酸對(duì)IPEC-J2細(xì)胞增殖的影響

        本試驗(yàn)觀察了不同濃度的賴氨酸對(duì)IPEC-J2細(xì)胞增殖的影響,結(jié)果如圖1所示。在DMEM/F12培養(yǎng)基中額外添加賴氨酸時(shí),會(huì)對(duì)IPEC-J2細(xì)胞增殖產(chǎn)生不利影響,當(dāng)賴氨酸添加量為1 mmol·L-1,IPEC-J2增殖水平降低,當(dāng)賴氨酸大于2 mmol·L-1時(shí),IPEC-J2的細(xì)胞增殖水平顯著下降(P<0.05),當(dāng)增加到8 mmol·L-1時(shí),細(xì)胞增殖數(shù)目降低了26.24%。

        不同字母表示差異顯著(P<0.05),n=6。下同Values with different letters are significantly different (P<0.05),n=6.The same as below圖1 不同濃度的賴氨酸對(duì)IPEC-J2細(xì)胞增殖的影響Fig.1 Effects of different concentrations of lysine on the cell viability of IPEC-J2 cells

        根據(jù)DMEM/F12培養(yǎng)基中的氨基酸配比模式,觀察了過量氨基酸對(duì)IPEC-J2細(xì)胞的影響,結(jié)果如圖2所示。當(dāng)IPEC-J2中加入2 mmol·L-1的賴氨酸時(shí),細(xì)胞活力顯著降低(P<0.05);將其他的必需氨基酸濃度提高到相同倍數(shù)時(shí),細(xì)胞活力有升高的趨勢(shì);將必需氨基酸和條件性必需氨基酸濃度,以及非必需氨基酸同時(shí)提高到相同倍數(shù)時(shí),細(xì)胞活力又顯著降低(P<0.05)。

        1.0.5 mmol·L-1 Lysine;2.2.0 mmol·L-1 Lysine(4倍濃度);3.2.0 mmol·L-1 Lysine +其他必需氨基酸(表2中1~9,4倍 濃度);4.2.0 mmol·L-1 Lysine + 其他必需氨基酸 + 條件性必需氨基酸(表2中1~15,4倍濃度);5.2.0 mmol·L-1 Lysine + 所有的氨基酸(表2中1~21,4倍濃度)1.0.5 mmol·L-1 Lysine group;2.2.0 mmol·L-1 Lysine group (4×);3.2.0 mmol·L-1 Lysine + EAA(1-9 in table 2,4×);4.2.0 mmol·L-1 Lysine + EAA + CEAA (1-15 in table 2,4×);5.2.0 mmol·L-1 Lysine + AA (1-21 in table 2,4×)圖2 氨基酸平衡對(duì)IPEC-J2細(xì)胞增殖的影響Fig.2 Effects of amino acid balance on the cell viability of IPEC-J2 Cells

        根據(jù)豬營養(yǎng)需要的氨基酸平衡模式,觀察了過量堿性氨基酸(賴氨酸、精氨酸與組氨酸)對(duì)IPEC-J2細(xì)胞的影響,結(jié)果如圖3所示。當(dāng)IPEC-J2細(xì)胞處理24 h時(shí)(圖3A),添加2.0 mmol·L-1Lysine的處理組比添加0.5 mmol·L-1Lysine的對(duì)照組,細(xì)胞活力顯著下降(P<0.05);當(dāng)在處理液中按照相應(yīng)的比例提高精氨酸、組氨酸以及同時(shí)提高這兩種氨基酸時(shí),細(xì)胞活力降低,但與對(duì)照組相比無顯著差異(P>0.05)。當(dāng)IPEC-J2細(xì)胞處理48 h時(shí)(圖3B),2 mmol·L-1Lysine的處理組以及相應(yīng)提高精氨酸、組氨酸的處理組,細(xì)胞活力均顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。

        A.IPEC-J2細(xì)胞處理24 h;B.IPEC-J2細(xì)胞處理48 h.1.0.5 mmol·L-1 Lysine;2.2.0 mmol·L-1 Lysine;3.2.0 mmol·L-1 Lysine + 0.91 mmol·L-1 Arginine;4.2.0 mmol·L-1 Lysine + 0.69 mmol·L-1 Histidine;5.2.0 mmol·L-1 Lysine + 0.91 mmol·L-1 Arginine + 0.69 mmol·L-1 HistidineA.IPEC-J2 cells treated for 24 h;B.IPEC-J2 cells treated for 48 h.1.0.5 mmol·L-1 Lysine group;2.2.0 mmol·L-1 Lysine group;3.2.0 mmol·L-1 Lysine + 0.91 mmol·L-1 Arginine;4.2.0 mmol·L-1 Lysine + 0.69 mmol·L-1 Histidine;5.2.0 mmol·L-1 Lysine + 0.91 mmol·L-1Arginine + 0.69 mmol·L-1 Histidine圖3 堿性氨基酸平衡對(duì)IPEC-J2細(xì)胞增殖的影響Fig.3 Effects of alkaline amino acid balance on the cell viability of IPEC-J2 Cells

        3 討 論

        3.1 日糧添加不同水平的賴氨酸對(duì)斷奶仔豬生長性能的影響

        隨著氨基酸工業(yè)化生產(chǎn)的實(shí)現(xiàn),合成氨基酸開始被廣泛用于豬日糧的配制中,以滿足豬對(duì)氨基酸的需要。有研究表明,在日糧中增加 0.1%~0.2%的合成氨基酸可有效節(jié)約日糧粗蛋白質(zhì)至少2%,而降低日糧粗蛋白質(zhì)水平將最小化必需氨基酸的部分,保證氨基酸營養(yǎng)處于更好狀態(tài)。Hahn和Baker[20]的研究結(jié)果顯示,斷奶仔豬在飼喂 16%粗蛋白質(zhì)并補(bǔ)充 0.2%賴氨酸的日糧后,營養(yǎng)物質(zhì)排出量最少。李德發(fā)等[21]報(bào)道,賴氨酸含量為1.25%的日糧與賴氨酸含量為1.15%的日糧相比,能夠顯著提高5~7周齡 仔豬的平均日增重,改善氮存留量、氮表觀消化率和凈利用率。譙仕彥等[22]研究發(fā)現(xiàn),將日糧賴氨酸含量由1.21%提高到1.41%能夠改善仔豬生長性能和日糧氮利用效率,提高氨基酸用于合成蛋白質(zhì)的效率。謝建兵等[23]以ADG為考察指標(biāo)進(jìn)行研究表明,斷奶仔豬日糧中總賴氨酸最適宜的水平為1.45%。本試驗(yàn)中,隨著日糧中賴氨酸添加量的升高,仔豬在斷奶后28 d的生長性能下降,這說明當(dāng)SID Lys提高到現(xiàn)有需要量的2倍時(shí),對(duì)斷奶仔豬的生長產(chǎn)生了不利影響,以SID Lys水平為1.3%的處理最佳。這與在仔豬中,3~4倍的賴氨酸推薦量(1.15%)降低了采食量與體重的報(bào)道[24]一致。

        賴氨酸水平不同時(shí),豬對(duì)其他氨基酸的需要量也會(huì)有所差別。當(dāng)賴氨酸含量達(dá)到一定水平后,賴氨酸的利用率會(huì)隨著賴氨酸水平的提高而降低。在理想蛋白質(zhì)模型和低氮日糧限制性氨基酸平衡模式研究中[25],其他氨基酸與賴氨酸之間存在一定的比例。而在本試驗(yàn)中,其他氨基酸水平并未隨著SID Lys水平的提高而提高,仔豬不僅無法利用更多的賴氨酸,反而因?yàn)樾枰獎(jiǎng)佑妙~外的能量來完成賴氨酸的轉(zhuǎn)化,引起了能量的相對(duì)不足,導(dǎo)致了仔豬生產(chǎn)性能指標(biāo)的下降[26]。

        3.2 日糧添加不同水平的賴氨酸對(duì)斷奶仔豬器官指數(shù)、腹瀉率、組織病理學(xué)的影響

        動(dòng)物器官指數(shù)可以被看作是機(jī)體機(jī)能狀況的反映,作為一個(gè)重要的生物學(xué)指標(biāo)對(duì)理論實(shí)踐和生產(chǎn)都具有重要意義[27]。本試驗(yàn)在測(cè)定器官指數(shù)和肝、腎組織病理時(shí),未發(fā)現(xiàn)顯著性差異,說明過量賴氨酸(5.2% SID Lys)的添加對(duì)器官指數(shù)和肝腎并無不良影響。本試驗(yàn)在保證蛋白質(zhì)水平一致的情況下,隨著SID Lys的升高,降低了豆粕的使用比例,而大豆中的抗?fàn)I養(yǎng)因子是引起斷奶仔豬腹瀉的主要原因之一,因此,本試驗(yàn)全期各處理組仔豬的腹瀉發(fā)生率較低。

        3.3 日糧添加不同水平賴氨酸對(duì)斷奶仔豬血液指標(biāo)的影響

        在評(píng)價(jià)動(dòng)物個(gè)體或群體的健康狀態(tài)和免疫性能時(shí),通常將血液常規(guī)作為重要指標(biāo)[28]。其中,紅細(xì)胞負(fù)責(zé)運(yùn)輸氧和二氧化碳,其功能主要依賴于紅細(xì)胞內(nèi)的血紅蛋白含量。本試驗(yàn)中,隨著日糧中SID Lys的升高,MCV和MCH顯著降低,說明高賴氨酸添加組的斷奶仔豬中肝造血功能減弱。在血清生化指標(biāo)中,AST和ALT通常被視為肝功能的可靠標(biāo)記物[29],其水平升高表明肝細(xì)胞滲透性增加、肝細(xì)胞受損乃至壞死。在本試驗(yàn)中,AST和ALT含量差異不顯著,說明過量賴氨酸對(duì)仔豬的肝細(xì)胞未造成損傷,這與肝組織切片的結(jié)果一致。UN、T-BIL和CREA都是評(píng)價(jià)動(dòng)物腎功能的指標(biāo)[11]。本試驗(yàn)中,SUN、T-BIL與CREA差異均不顯著,說明過量賴氨酸未對(duì)斷奶仔豬的腎功能造成影響,這與腎組織切片結(jié)果一致。

        隨著日糧中SID Lys的升高,斷奶仔豬血清賴氨酸含量顯著升高,而精氨酸含量不受影響,這進(jìn)一步說明賴氨酸和精氨酸不存在拮抗作用,這與Southern和Baker[30]的研究結(jié)果一致。有研究表明,如果日糧中的非必需氨基酸總量較少,不能滿足動(dòng)物機(jī)體需求,動(dòng)物機(jī)體將開啟一系列轉(zhuǎn)氨反應(yīng),自行合成非必需氨基酸[31]。因此,飼料中賴氨酸的升高和飼料中必需氨基酸比例的不同,造成了機(jī)體氨基酸水平的變化,從而引起了組氨酸、亮氨酸、色氨酸與苯丙氨酸等必需氨基酸以及丙氨酸、天冬氨酸、酪氨酸與鳥氨酸等非必需氨基酸的變化。

        3.4 日糧添加不同水平的賴氨酸對(duì)斷奶仔豬腸道形態(tài)的影響

        氨基酸和小肽主要通過小腸進(jìn)行吸收,而營養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收明顯受到腸絨毛高度和隱窩深度的影響[32-33]。在本試驗(yàn)中,過高的賴氨酸水平會(huì)減少空腸的絨毛高度和回腸的隱窩深度,這與之前仔豬飼喂賴氨酸缺乏日糧的試驗(yàn)結(jié)論相似[34],也與施壽榮等[35]在肉雞上的研究結(jié)果相似,說明賴氨酸的不足與過量都會(huì)影響動(dòng)物對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的消化與吸收。

        3.5 過量賴氨酸對(duì)豬腸道上皮細(xì)胞增殖的影響

        作為一種未完全分化的腸道細(xì)胞,IPEC-J2是從初生仔豬的空腸上皮組織中分離出來的[36],其保持了多種腸道細(xì)胞的特征。本試驗(yàn)采用IPEC-J2細(xì)胞系作為體外模型,研究過量賴氨酸對(duì)仔豬腸道吸收的影響。

        本試驗(yàn)中,當(dāng)加入的賴氨酸濃度高于2.0 mmol·L-1時(shí),IPEC-J2的細(xì)胞活性顯著降低。張海環(huán)[37]的研究表明,對(duì)于IPEC細(xì)胞,細(xì)胞增殖情況隨著賴氨酸的濃度(0、0.5、1.5、4.5和13.5 mmol·L-1)出現(xiàn)先升高后降低的變化,在1.5 mmol·L-1時(shí)細(xì)胞活力最高,但與0.5 mmol·L-1差異不顯著,這與本試驗(yàn)的結(jié)果基本一致。張海環(huán)[37]的研究還證明,當(dāng)賴氨酸濃度達(dá)到1.5 mmol·L-1時(shí),CAT-1,b0,+AT和y+LAT1基因表達(dá)量最高,并且這一數(shù)值極顯著高于其他賴氨酸濃度組。其中原因也許是這一數(shù)值較為適中,既不像在0.5 mmol·L-1時(shí)由于賴氨酸濃度過低無法引起調(diào)控對(duì)象的變化,也不至于在4.5 mmol·L-1以上時(shí)由于賴氨酸濃度過大從而對(duì)細(xì)胞的生長造成不利影響。適當(dāng)提高賴氨酸和葡萄糖的含量有助于增加賴氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體b0,+AT和y+LAT1的表達(dá)[38]。由于賴氨酸本身具有一定的堿性,當(dāng)賴氨酸濃度過高時(shí),培養(yǎng)基的酸堿程度也會(huì)被相應(yīng)改變,進(jìn)而影響細(xì)胞正常生理活動(dòng)。同時(shí),當(dāng)賴氨酸的濃度為1.5 mmol·L-1時(shí),由哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號(hào)通路參與調(diào)控的蛋白質(zhì)合成值可能達(dá)到最大[36],而mTOR不僅是細(xì)胞生長調(diào)節(jié)的重要蛋白質(zhì),還在蛋白質(zhì)合成中發(fā)揮重要的作用。因此,當(dāng)賴氨酸濃度過高時(shí),會(huì)影響細(xì)胞增殖與蛋白質(zhì)的合成。

        本研究中,當(dāng)賴氨酸濃度為2.0 mmol·L-1時(shí),同時(shí)提高其他必需氨基酸的濃度,盡管與0.5 mmol·L-1濃度組差異不顯著,但I(xiàn)PEC-J2的細(xì)胞增殖情況得到了一定的改善,說明氨基酸平衡會(huì)影響細(xì)胞的增殖。有研究表明,賴氨酸/蛋氨酸配比模式會(huì)對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞增殖與酪蛋白合成產(chǎn)生較為顯著的影響[39],在豬的小腸上皮細(xì)胞和骨骼肌細(xì)胞中必需氨基酸會(huì)通過mTORC1信號(hào)通路影響細(xì)胞的增殖和蛋白質(zhì)生物合成[40-41],添加最優(yōu)濃度配比的組氨酸、賴氨酸、蛋氨酸和亮氨酸會(huì)通過增加激活mTOR信號(hào)通路信號(hào)蛋白質(zhì)的磷酸化,從而促進(jìn)酪蛋白合成相關(guān)基因的表達(dá)[42]。

        本研究中,在2.0 mmol·L-1濃度處理的IPEC-J2細(xì)胞中,按照豬對(duì)堿性氨基酸需要量的比例補(bǔ)充精氨酸和組氨酸時(shí),隨著處理時(shí)間的增加,細(xì)胞活力降低,當(dāng)細(xì)胞處理24 h時(shí),補(bǔ)充其他堿性氨基酸的處理組的細(xì)胞活性與2.0 mmol·L-1賴氨酸濃度組相比有提高的趨勢(shì),這符合氨基酸平衡模式的要求。有研究表明,0.3 mmol·L-1是上皮細(xì)胞增殖與蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化適宜的精氨酸濃度[7],本試驗(yàn)中添加的精氨酸為0.91 mmol·L-1,顯然已過量,所以細(xì)胞的生長受到不利影響。這一過程可能與過量的半胱氨酸通過激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號(hào)通路來引起細(xì)胞壞死[43]的原理相似。

        4 結(jié) 論

        本研究顯示,在玉米-豆粕型日糧中添加過多的賴氨酸對(duì)斷奶仔豬的生長產(chǎn)生了負(fù)面作用。飼喂添加1.3% SID Lys的日糧時(shí),斷奶仔豬的生長性能最優(yōu)。SID Lys添加量為2.6%、3.9%與5.2%時(shí),斷奶仔豬的生長性能下降,部分血常規(guī)指標(biāo)、血清游離氨基酸指標(biāo)和腸道形態(tài)均受到不利影響。在IPEC-J2細(xì)胞體外試驗(yàn)顯示,大于2.0 mmol·L-1的賴氨酸對(duì)IPEC-J2細(xì)胞活力具有抑制作用。綜上,在實(shí)際應(yīng)用中,應(yīng)充分考慮氨基酸之間的平衡作用。

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