李茹意，趙俊金，趙羚均，段晨瑩，李 欣，王 棟*

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學動物科學技術學院，長春 130118；2.全國畜牧總站，北京 100125；3.中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193)

雙磺酸基烷化劑白消安(1,4-丁二醇二甲磺酸酯)可用于造血干細胞移植患者移植前調(diào)理，也是慢性粒細胞白血病慢性期治療藥物，能有效減輕粒細胞總負荷，緩解癥狀，改善患者狀態(tài)[1-2]；還經(jīng)常被用于制備精原干細胞移植受體，并進行精子發(fā)生機理研究[3]。但利用白消安長期治療，會損害患者睪丸，甚至導致不育現(xiàn)象[4]。

睪丸內(nèi)生精小管上皮中，支持細胞(sertoli cells,SCs)間及支持細胞和生精細胞間形成了外質(zhì)特化(ectoplasmic specializations,ES)、緊密連接(tight junction,TJ)、間隙連接(gap junctions,GJ)和橋粒連接(anchoring junction,AJ)等各種連接復合體，它們相互鏈接共同構(gòu)成血睪屏障(blood testis barrier,BTB)[5-7]，這種特殊的血液-組織屏障阻擋了血液中各種來源生物大分子的通過[8]，可保護機體自身免受免疫反應傷害，使睪丸成為機體重要的免疫豁免區(qū)[9]。然而，越來越多的研究表明，睪丸炎癥是誘發(fā)雄性生殖障礙甚至不育的重要因素，這一免疫豁免區(qū)的炎癥反應，特別是炎癥因子對睪丸機能的調(diào)節(jié)作用逐漸成為研究的焦點[10-12]。研究表明，動物體內(nèi)IL-1、IL-6、和TNF-α等炎性因子含量升高，可引發(fā)睪丸炎癥，損害到BTB結(jié)構(gòu)[13-15]。而對小鼠的研究表明，以25 mg·kg-1的劑量腹腔注射白消安后會導致小鼠不育，并在注射21 d后，在不育小鼠體內(nèi)檢測到TNF-α的mRNA水平顯著增加[16]。然而，目前白消安處理對睪丸的毒性機理尚不明確，白消安是否通過了BTB并誘導了睪丸損傷？

為此，本研究對白消安處理小鼠進行睪丸生物素示蹤試驗，采用液質(zhì)聯(lián)用靶向測定其附睪尾精液，并對小鼠血清進行炎性因子ELISA檢測，以深入揭示白消安對睪丸的毒性機理，為降低白消安毒性損傷，提高制備精原干細胞移植受體的效率及安全性提供理論基礎，為探討白消安作用下雄性生精機能的科學防護與恢復治療提供科學指導。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及飼養(yǎng)管理

選取96只7～8周齡健康、繁殖性能正常的ICR品系雄性小白鼠，均購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。整個試驗過程中，試驗鼠在20～25 ℃、自然光照條件下飼養(yǎng)，自由采食、飲水，每周更換1次墊料。試驗鼠及試驗方法均符合中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所動物實驗福利倫理審查(No.IAS2019-13)要求。

1.2 主要試劑及藥品配制

白消安(busulfan)、氯化鈉(NaCl)、二甲基亞砜(DMSO)購自美國Sigma公司；酒精、二甲苯購自北京化學試劑公司；戊巴比妥鈉購自德國Merck公司；石蠟購自上海華靈康復器械廠；甲醛溶液購自汕頭市西隴化工廠；多聚甲醛購自天津市光復精細化工研究所；雙氧水 (H2O2)、蘇木素購自武漢賽維爾生物有限公司；EZ-LinkTMSulfo-NHS-LC-Biotin和Streptavidin-Alexa Fluor?555 conjugate購自美國APExBIO公司；炎性因子TNF-α、IL-1β和IL-6 的ELISA試劑盒購自江蘇酶免生物科技有限公司。

白消安溶液配制：將12 mg白消安粉末溶解在1 mL DMSO中，并加入1 mL生理鹽水，最終白消安濃度為6 mg·mL-1。

DMSO溶液配制：向1 mL DMSO中加入1 mL生理鹽水，混勻，即為DMSO溶液。

1.3 試驗鼠的白消安處理

以睪丸注射白消安作為試驗組、睪丸注射DMSO溶液為對照組，進行白消安睪丸注射試驗，注射方法為單點注射，共有96只試驗鼠。小鼠睪丸注射白消安的濃度參考文獻[16]，即6 mg·mL-1白消安為試驗組注射濃度。

白消安試驗組：以60 mg·kg-1體重劑量腹腔注射2%戊巴比妥鈉進行小鼠全身麻醉，使麻醉鼠保持仰臥姿勢，把睪丸從腹腔輕揉地擠入陰囊，然后用75%醫(yī)用酒精對陰囊部位消毒，用左手食指與拇指固定單側(cè)睪丸，右手持無菌靜脈輸液針(針頭另一側(cè)連接1 mL注射器，內(nèi)含白消安注射液)，根據(jù)睪丸表面血管分布情況，避開睪丸白膜上的血管直接穿透陰囊進入睪丸，用力推注射器將白消安注入睪丸，白消安注射濃度為每側(cè)6 mg·mL-1，根據(jù)小鼠體重決定注射劑量，計算方法為注射白消安體積等于小鼠體重 (V=M，V：注射體積，單位μL；M：小鼠體重，單位g)。對側(cè)睪丸采用同樣處理后，處理鼠單籠飼養(yǎng)，觀察表現(xiàn)。

對照組：雄性ICR小鼠雙側(cè)睪丸分別注射與處理組等體積的DMSO溶液，注射步驟參考白消安試驗組。

1.4 白消安處理鼠睪丸的生物素示蹤

1.4.1 白消安處理鼠的生物素示蹤處理 分別于白消安處理后0、12、24、36 h，按照注射白消安的方法，將25 μL 生物示蹤素EZ-LinkTMSulfo-NHS-LC-Biotin(溶于PBS中，達到10 mg·mL-1的濃度)注入小鼠睪丸，同樣處理對側(cè)睪丸。每個時間點注射3只鼠，共12只。

1.4.2 切片染色 注射生物示蹤素30 min后，脫頸處死小鼠，用剪刀從陰囊取出睪丸，組織OCT包埋劑包埋，置于液氮中快速冷凍后，-20 ℃冷凍切片機中切割為5 μm厚睪丸切片，載玻片貼片后室溫干燥10 min，待組織切片完全貼合在載玻片上，室溫下，用1 mL 4%PFA(多聚甲醛)固定10 min，固定后PBS重復洗滌，然后用移液槍吸取6 μL Streptavidin-Alexa Fluor?555 conjugate，用PBS稀釋到1.5 mL，再用移液槍滴在切片上，室溫下避光染色30 min。

1.4.3 細胞核染色及封片處理 切片染色結(jié)束后，PBS重復洗滌，去除殘余的Streptavidin-Alexa Fluor?555 conjugate，再取4′,6-diamidino-2-phenylindole(DAPI)室溫下避光染細胞核5 min。染色結(jié)束后，用中性樹脂分別滴于載玻片四角，蓋上蓋玻片。封片后，避光干燥30 min，然后置于熒光顯微鏡下觀察切片。

1.5 液質(zhì)聯(lián)用靶向測定附睪尾精液白消安含量

1.5.1 樣本采集 分別于睪丸注射白消安后第0.5、1、2、3、4、5、6、9、12、24、36、48、60、72 h，脫頸處死試驗鼠，用剪刀從陰囊中取出附睪，用鑷子擠出精液，收集至1.5 mL離心管中，以備后續(xù)液質(zhì)聯(lián)用靶向測定白消安含量。每個時間點注射3只鼠，共42只。

1.5.2 樣品前處理 向附睪精液樣品加入1 mL乙腈，超聲5 min后，20 000×g離心5 min，取0.5 mL上清液至上樣小瓶，進行液質(zhì)聯(lián)用靶向測定。

1.5.3 液質(zhì)聯(lián)用靶向測定實驗參數(shù)設置 高效液相色譜使用的色譜柱為ACQUITY UPLC Peptide BEH C18 Column,130?,1.7 μm,2.1 mm * 100 mm；流動相為10 mmol·L-1甲酸銨(A相)-甲醇(B相)，流速為0.3 mL·min-1，洗脫的設置見表1，質(zhì)譜定量離子對的質(zhì)量見表2。

表1 洗脫程序的設置Table 1 Setting of the elution program

表2 質(zhì)譜定量離子對的設置Table 2 Setting of mass spectrometry ion pair

1.6 炎性因子TNF-α、IL-1β和IL-6 的ELISA測定

1.6.1 樣本采集 分別于睪丸注射白消安后第0、12、24、36、48、60、72 h以及4、5、6、7、14、21和28 d，抓取試驗鼠，使其眼球突出，用鑷子拽出一側(cè)眼球，然后用1.5 mL離心管收集血液。每個時間點注射3只鼠，共42只。靜置2 h后，3 000 r·min-1離心15 min分離血清，于-20 ℃冰箱中保存，以備后續(xù)炎性因子檢測研究。

1.6.2 ELISA試驗操作步驟 設置酶標包被板的標準品孔和樣本孔，向各標準品孔分別加入標準品50 μL，加樣時采用濃度由低到高的順序順次加入，樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁。其中，TNF-α標準品濃度依次為0、40、80、160、320、640 pg·mL-1，IL-1β和IL-6標準品濃度依次為0、7.5、15、30、60、120 pg·mL-1；樣品孔分為空白對照孔、待測樣品孔，向待測樣品孔加入樣品稀釋液 40 μL，然后再加待測樣品 10 μL(即將樣品做5倍稀釋)，空白孔不加樣品及樣品稀釋液，加樣后輕輕晃動酶標板混勻，然后，除空白孔外，每孔加入酶標試劑 100 μL，再用封板膜封板后37 ℃ 溫育60 min；將20倍濃縮洗滌液用蒸餾水20倍稀釋后備用；小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30 s后棄去，如此重復5次，拍干；每孔先加入顯色劑A 50 μL，再加入顯色劑B 50 μL，輕輕震蕩混勻，37 ℃ 避光顯色15 min；每孔加終止液 50 μL，終止反應(此時藍色立轉(zhuǎn)黃色)。使用酶標儀檢測各孔吸光度(OD值)，以空白孔調(diào)零，450 nm 波長下依序測量，測定應在加終止液后 15 min內(nèi)進行。

1.7 數(shù)據(jù)分析

使用Excel和SPSS 20.0軟件對數(shù)據(jù)進行整理和統(tǒng)計分析，采用單因素方差分析(one-way ANOVA)以及t檢驗進行組間差異顯著性檢驗，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 睪丸注射白消安24 h后BTB被破壞

小鼠睪丸生物素示蹤結(jié)果顯示，對照組小鼠睪丸曲細精管中，Biotin的紅色熒光只存在于睪丸間質(zhì)中，并未進入曲細精管中，表明對照組睪丸的BTB功能完好，能夠阻擋Biotin由曲細精管外向曲細精管內(nèi)滲漏(圖1A、B)；試驗組中，在注射白消安12 h后，曲細精管內(nèi)也未檢測到Biotin的紅色熒光(圖1C、D)，但在注射24 h后，在曲細精管內(nèi)部檢測到了紅色熒光，表明Biotin已經(jīng)滲漏進曲細精管內(nèi)部(圖1E、F)，BTB已經(jīng)被破壞，在注射36 h后，曲細精管內(nèi)部的Biotin紅色熒光更為清晰，分布更廣泛(圖1G、H)。

A、B.對照組；C、D.注射白消安12 h；E、F.注射白消安24 h；G、H.注射白消安36 h。A、C、E、G.EZ-LinkTM Sulfo-NHS-LC-Biotin；B、D、F、H.EZ-LinkTM Sulfo-NHS-LC-Biotin+DAPI。其中，EZ-LinkTM Sulfo-NHS-LC-Biotin染色后呈紅色熒光，細胞核DAPI染色后呈藍色熒光，黃色箭頭指的是EZ-LinkTM Sulfo-NHS-LC-Biotin的滲透范圍A,B.Control group;C,D.Busulfan injection for 12 hours;E,F.Busulfan injection for 24 hours;G,H.Busulfan injection for 36 hours.A,C,E,G.EZ-LinkTM Sulfo-NHS-LC-Biotin;B,D,F,H.EZ-LinkTM Sulfo-NHS-LC-Biotin+DAPI.Among them,EZ-LinkTM Sulfo-NHS-LC-Biotin is stained with red fluorescence,and nucleus DAPI is stained with blue fluorescence.The yellow arrow refers to the penetration range of EZ-LinkTM Sulfo-NHS-LC-Biotin圖1 小鼠睪丸注射白消安后的生物素(EZ-LinkTM Sulfo-NHS-LC-Biotin)示蹤結(jié)果Fig.1 Results of EZ-LinkTM Sulfo-NHS-LC-Biotin tracing in mouse testis after injected with busulfan

2.2 白消安可直接穿過睪丸BTB進入曲細精管

液質(zhì)聯(lián)用檢測結(jié)果表明，睪丸注射白消安30 min 后，附睪精液中就可檢測到最高比例的白消安 (0.038 3±0.001 1)%；隨時間推移，附睪精液白消安含量逐漸遞減(圖2)，這種擴散速度表明，白消安分子可直接穿越BTB，自由進出曲細精管，并隨曲細精管液流，經(jīng)附睪頭進入附睪尾，并以較快的速度衰減。

圖2 小鼠睪丸注射白消安后附睪精液中白消安的相對含量Fig.2 The relative content of busulfan in epididymal semen after injection of busulfan into mouse testis

2.3 睪丸注射白消安后血清中TNF-α、IL-1β和IL-6濃度顯著上升

圖3顯示，睪丸注射白消安后，血清TNF-α、IL-1β和IL-6濃度均逐漸增加，注射36 h后均顯著高于對照組，21 d后達峰值水平，最大濃度分別為TNF-α：(1 855.51±10.32)pg·mL-1、IL-1β：(293.59±3.34)pg·mL-1、IL-6：(340.30±12.55)pg·mL-1，隨后，均逐漸降低。結(jié)果表明，小鼠睪丸注射白消安后，血清中TNF-α、IL-1β和IL-6濃度顯著上升。

3 討 論

目前，使用白消安治療癌癥以及制備SSCs移植受體已經(jīng)越來越普遍，且白消安的癌癥治療成功率及SSCs移植受體制備效果逐漸改善。但由于白消安毒性較強，導致雄性生育能力受到損害，SSCs移植受體制備面臨安全隱患[17-18]。近年來，為深入探索精子發(fā)生與成熟的生理基礎，提升種公畜繁殖效率，實現(xiàn)繁殖控制，SSCs移植受體制備越來越受關注[19]。如何緩解或避免白消安毒性已引起高度重視。本研究首次通過生物素示蹤、液質(zhì)聯(lián)用靶向測定和炎性因子ELISA測定，深入探索了白消安處理導致小鼠雄性不育的毒性機理。

對大鼠腹腔注射CdCl2(3 mg·kg-1)的研究表明，通過大鼠睪丸注射生物素(EZ-LinkTMSulfo-NHS-LC-Biotin)示蹤，最早在注射CdCl23 d后，在曲細精管內(nèi)部觀察到了生物素示蹤的紅色熒光，推斷在注射CdCl23 d后BTB結(jié)構(gòu)被破壞[20-21]。借鑒這一試驗方法，本研究觀察到小鼠睪丸注射白消安24 h后，在曲細精管檢測到了生物素的紅色熒光，并且隨時間推移，曲細精管中的紅色熒光越來越強，分布越來越廣。所以推斷，本研究中，小鼠睪丸白消安注射24 h左右，BTB被破壞，這一時間比CdCl2研究結(jié)果提前了48 h。分析原因，可能是腹腔注射的CdCl2需要通過腹腔血液循環(huán)運輸?shù)酱笫蟛G丸，一方面推遲了對BTB的作用時間，另一方面，腹腔注射后藥物的自由擴散影響了其靶向性，結(jié)果只有少部分藥物抵達睪丸，增加了對機體的毒副作用，也影響了作用效果。

白消安突破睪丸BTB進入曲細精管，是其發(fā)揮毒害作用的前提，但目前尚未見到關于白消安突破并通過選擇性屏障BTB的研究報道。本研究的檢測結(jié)果表明，小鼠睪丸注射白消安30 min后，白消安即擴散到了附睪精液中，隨時間推移，在附睪精液中的含量逐漸消減，并在注射12 h后，很快由痕量檢出到無法測出。本研究的這一檢測結(jié)果與白消安平均半衰期2.5 h的理論值基本相符[22]。同時，研究表明，BTB復合體可選擇性地允許代謝物、第二信使和其他分子量小于1 ku的分子通過[23-24]，而白消安分子量為246.29 u，遠小于這個分子量閾值[25]，由此推斷，白消安小分子可通過擴散自由進出BTB，并隨曲細精管液流，進入附睪尾。而自由出入BTB的白消安對睪丸造成的傷害，可能是從內(nèi)外多個方向、多個位點同時進行的。

*.P<0.05;**.P<0.01圖3 小鼠睪丸注射白消安后血清炎性因子ELISA檢測結(jié)果Fig.3 ELISA test results of serum inflammatory factors after injection of busulfan into mouse testis

早期研究表明，小鼠腹腔注射白消安(25 mg·kg-1)21 d后，其體內(nèi)TNF-α的mRNA水平顯著增加[16,26]，但是，未見關于其他炎性因子mRNA水平的研究報道，也未見白消安處理后相關因子蛋白水平的研究結(jié)果，無法推知白消安處理是否通過誘發(fā)睪丸炎癥，影響了雄性生殖能力。本研究在白消安處理后，檢測到炎性因子TNF-α、IL-1β和IL-6濃度逐漸增加，并且在處理36 h后，達到顯著水平。研究表明，小鼠各炎性因子的生理范圍分別為TNF-α:365.4～533 pg·mL-1[27-28]、IL-1β:74.45～120 pg·mL-1[29]、IL-6:62.56～115.5 pg·mL-1[30]。本研究中白消安處理72 h后，小鼠體內(nèi)IL-1β濃度超過生理上限，達到(121.83±0.80)pg·mL-1，IL-6濃度超過生理上限，達到(120.99±1.09)pg·mL-1，4 d后，小鼠體內(nèi)TNF-α濃度超過生理上限，達到(572.26±15.39)pg·mL-1，這3種炎性因子突破生理濃度上限，標志了睪丸炎的發(fā)生，隨時間推移，各炎癥因子水平進一步提高，到21 d后達到峰值，隨后逐漸下降，各炎性因子水平變化過程，標志了睪丸炎癥反應發(fā)生、發(fā)展及逐漸恢復的過程。由此推斷，長時間的炎癥反應對睪丸生精機能產(chǎn)生了毒害，影響到了雄性個體的生育機能，甚至導致雄性不育。

研究表明，褪黑素(melatonin)、維生素等被用于緩解白消安處理導致的氧化應激，這些藥物通過抗氧化作用，可有效地降低白消安處理后產(chǎn)生的ROS[31-32]。同時，研究表明，炎癥反應過程中也會激活p38 MAPK信號轉(zhuǎn)導通路，形成大量ROS[33]，所以，氧化應激和炎癥反應是白消安毒害的兩種表現(xiàn)，也可能是導致睪丸毒害的兩個相互影響、互為因果的過程，所以推測，這些藥物在抑制氧化應激的同時，也抑制了炎癥反應，最終緩解了白消安毒性。本團隊后續(xù)將會設計試驗，探索最合適有效的緩解白消安毒性的抗炎藥物，以降低白消安處理的毒副作用，并研究炎癥相關信號通路在減輕或預防雄性不育中的作用，為有效防控白消安處理引起雄性繁殖機能損傷甚至不育提供新思路。

4 結(jié) 論

白消安可自由穿越血睪屏障，在小鼠睪丸注射白消安24 h左右，生物示蹤素突破BTB，且引起血清中炎性因子TNF-α、IL-1β和IL-6濃度升高，并逐漸達顯著水平，于21 d后達到最高濃度，隨后逐漸下降。