黃誠彧，徐德全,2,3，馮 哲，周 玲，劉 敏,2*

(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，武漢 430070；2.農(nóng)業(yè)部豬遺傳育種重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，武漢 430070；3.農(nóng)業(yè)動物遺傳育種與繁殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430070)

褪黑素(melatonin，MT)首次提取自牛的松果腺，其主要由色氨酸在酶催化作用下形成。MT微量存在于多種生物體內(nèi)，細(xì)菌、單細(xì)胞真核生物、藻類、植物、無脊椎動物和脊椎動物都要由它參與維持正常生物活動，主要影響糖和脂質(zhì)的代謝、氧化應(yīng)激防御、活性氧(reactive oxygen species，ROS)清除、防止癌變及免疫調(diào)節(jié)等[1-2]。MT對干細(xì)胞具有多種調(diào)控作用，其中，腦組織中松果腺分泌的MT含量很高，有改善組織損傷，預(yù)防神經(jīng)退行性疾病發(fā)生的作用[3]。方佳[4]通過添加MT處理犬間充質(zhì)干細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)MT可有效緩解細(xì)胞衰老，激活抗氧化基因NRF2表達(dá)，并在異種移植后取得良好成效。Gao等[5]發(fā)現(xiàn)，MT能顯著提高誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的重編程效率，下調(diào)凋亡基因P21和P53的表達(dá)，誘導(dǎo)后的干細(xì)胞可表達(dá)OCT4、SOX2、NANOG等標(biāo)志基因。MT還可在癌癥治療過程中充當(dāng)生殖細(xì)胞的保護(hù)劑，能有效緩解白消安等抗癌藥物對精原干細(xì)胞(spermatogonial stem cells,SSCs)的損害，但對SSCs本身會有何種影響仍有待研究[6]。

SSCs是雄性動物體內(nèi)精子發(fā)生的基礎(chǔ)，也是唯一能將遺傳信息傳遞給下一代的成體干細(xì)胞[7-8]。隨著SSCs移植技術(shù)的出現(xiàn)，人們開始逐漸關(guān)注SSCs對精子品質(zhì)的影響作用。豬作為一種重要的經(jīng)濟(jì)牲畜，利用SSCs來提高公豬的繁殖能力是新的研究方向。而豬SSCs的敏感性使其易受外界物質(zhì)的影響，因此，找尋可以促進(jìn)SSCs增殖分化的有益物質(zhì)，或研究有害物質(zhì)對SSCs損傷機(jī)制以制定保護(hù)方案，對提高公豬的生產(chǎn)性能有著重要的意義。本研究以分離自7日齡大白公豬的SSCs作為試驗(yàn)材料，希望通過研究MT對公豬SSCs的影響及作用機(jī)制，進(jìn)而應(yīng)用到生產(chǎn)中達(dá)到提高公豬繁殖性能的目的。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)動物組織采集 睪丸組織采集于華中農(nóng)業(yè)大學(xué)精品豬場提供的3頭7日齡健康大白公豬，酒精擦拭消毒并切開陰囊進(jìn)行睪丸摘取手術(shù)，獲取的睪丸用酒精沖洗消毒后放置在冰盒中于30 min內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室用于細(xì)胞分離。

1.1.2 主要藥品試劑及儀器 RIPA 裂解液、BCIP/NBT堿性磷酸酯酶顯色試劑盒、ROS檢測試劑盒、脂質(zhì)氧化MDA檢測試劑盒、總谷胱甘肽檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；褪黑素購自北京百靈威科技有限公司；胎牛血清(FBS)、DMEM/F12培養(yǎng)基購自 Gibco 代理公司；膠質(zhì)細(xì)胞神經(jīng)源性因子(glial cell line-derived neurotrophic factor，GDNF)、白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor，LIF)購自武漢匯宇誠生物科技有限公司；TRIzol、PVDF膜及熒光定量板購自莫納生物科技有限公司；2×SYBR Green qPCR Master Mix 購自 Bimake 公司；IV型膠原酶、胰蛋白酶、磷酸鹽緩沖液(PBS)、青鏈霉素購自Hyclon公司；Western blot 試劑盒購自武漢賽維爾生物技術(shù)有限公司；β-tubulin、Bax、總Caspase3、Bcl-2、UCHL1抗體購自 ABclonal 公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔 IgG 購自碧云天公司；SOD2抗體購自Bioswamp公司；CCK-8 試劑盒(cell counting kit-8,Cat No.40203)購自上海翊圣生物科技有限公司；豬ST細(xì)胞購自武漢大學(xué)細(xì)胞庫。

熒光定量RT-qPCR儀 LightCycler480 型(Roche 公司)；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(德國 MEMMERT 公司)；凝膠成像系統(tǒng)(美國 IBM 公司)；Western blot電泳儀(武漢賽維爾生物技術(shù)有限公司)；PerkimELmer 2030 酶標(biāo)儀(聯(lián)想生物有限公司)。

1.2 飼養(yǎng)層細(xì)胞制備

傳代培養(yǎng)豬支持細(xì)胞(sertoli cells，ST)，當(dāng)細(xì)胞密度長至80%左右加入15 μg·mg-1的絲裂霉素C，在37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1 h。孵育完成后使用PBS沖洗3次ST細(xì)胞以清除殘留的絲裂霉素C。獲得的ST細(xì)胞即成為飼養(yǎng)層細(xì)胞，可按需求使用或凍存。

1.3 豬睪丸細(xì)胞分離純化

1.3.1 細(xì)胞懸液制備 采集7日齡大白豬睪丸，酒精消毒后于30 min內(nèi)帶回進(jìn)行細(xì)胞分離。用無菌手術(shù)刀切開睪丸外側(cè)漿膜白膜并剝離睪丸實(shí)質(zhì)，滴加PBS沖洗3次，剪碎成2～3 mm3大小組織塊。剪碎的組織加入3倍體積膠原酶IV于37 ℃消化25 min，如觀察到生精小管則表示消化完全。加入3倍體積胰蛋白酶與DNAseI于37 ℃消化20 min，如消觀察到生精小管被消化則表示消化完全，加入含血清培養(yǎng)液終止消化。依次經(jīng)200和400目細(xì)胞篩過濾，過濾后的液體即為睪丸細(xì)胞懸液。

1.3.2 差速貼壁法純化細(xì)胞 將0.1%明膠溶液覆蓋于培養(yǎng)皿底層在37 ℃環(huán)境中包被30 min，包被完成后，在使用前PBS沖洗3次以去除多余明膠。過篩后的細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)皿中，在37 ℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行差速貼壁。其中，第一次差速貼壁過程持續(xù)2 h，將漂浮在培養(yǎng)液中的未貼壁細(xì)胞移至新培養(yǎng)皿中。第二次差速貼壁過程4 h，漂浮在培養(yǎng)液中的未貼壁細(xì)胞轉(zhuǎn)移至飼養(yǎng)層細(xì)胞上培養(yǎng)。

1.4 SSCs的堿性磷酸酶染色

棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，PBS清洗細(xì)胞去除殘留血清成分。加入4%多聚甲醛固定細(xì)胞30 min，固定期間配制堿性磷酸酶染色液，染色液需現(xiàn)用現(xiàn)配，避光4 ℃保存。棄去4%多聚甲醛，PBS清洗2～3遍以除去殘留，加入染色液避光孵育10～20 min。棄去染色液，PBS清洗后在顯微鏡下觀察染色情況。

1.5 SSCs的免疫熒光染色

挑SSCs克隆至細(xì)胞爬片上培養(yǎng)，待細(xì)胞長至合適狀態(tài)使用PBS清洗3次去除血清成分。加入4%多聚甲醛沒過細(xì)胞，固定30 min后PBS清洗殘留的多聚甲醛。加入0.1% Triton X-100透化細(xì)胞10 min，PBS清洗細(xì)胞爬片。加入10% 胎牛血清、1% 牛血清白蛋白的封閉液緩沖液，封閉細(xì)胞30 min。在封閉液中稀釋抗體，4 ℃一抗孵育過夜、37 ℃二抗孵育1 h，樹脂封片后觀察。由武漢賽維爾生物技術(shù)有限公司負(fù)責(zé)制作。

1.6 引物設(shè)計

在NCBI數(shù)據(jù)庫查中下載基因蛋白編碼(CDS)區(qū)序列作為模板，通過Oligo 7軟件設(shè)計引物后，將引物序列發(fā)至上海生工生物有限公司進(jìn)行合成。引物序列見表1。

高文鵬的這個信息太重要了，對我更重要。決定景花廠命運(yùn)的關(guān)鍵時刻來了，而且，決定我命運(yùn)的關(guān)鍵時刻也來了。我要把自己的命運(yùn)和景花廠的命運(yùn)緊密聯(lián)系在一起。景花廠的前景雖然不容樂觀，但不管前路多么曲折，我都有信心。我甚至看到了景花廠百轉(zhuǎn)千折后的柳暗花明，看到了我和阿花風(fēng)雨同舟后的明媚春光。阿花再高不可攀，但畢竟是個女人，只要她沒有看破紅塵，就必定會有男人能走進(jìn)她的心靈深處。

表1 基因引物序列Table 1 The sequences of gene primers

1.7 褪黑素處理SSCs

將MT粉末溶于DMSO中配制母液于-20 ℃避光保存，使用時提前解凍并用細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋。SSCs傳代至細(xì)胞平板中培養(yǎng)，待細(xì)胞長至90%匯合度左右加入含添加物的細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行處理。設(shè)置MT濃度梯度(0、50、250、500、1 000 μmol·mL-1)組處理SSCs，每組設(shè)3個試驗(yàn)重復(fù)，空白對照組加入0.1% DMSO處理。

1.8 SSCs的總RNA提取及cDNA合成

細(xì)胞總RNA利用TRIzol法提取，經(jīng)核酸濃度測定儀測定濃度，1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)RNA質(zhì)量。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。

1.9 實(shí)時定量PCR檢測

依據(jù)定量PCR試劑盒配制反應(yīng)體系，使用LightCycler 480 Real-Time PCR Detection System進(jìn)行實(shí)時定量PCR擴(kuò)增，LightCycler?480 Software1.5軟件收集定量PCR數(shù)據(jù)。定量體系(2×SYBR Green qPCR Master Mix 5 μL，上、下游引物各0.2 μL，cDNA 0.5 μL，ddH2O補(bǔ)足至10 μL)于95 ℃預(yù)變性3 min。40個循環(huán)：95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃ 延伸30 s。

數(shù)據(jù)分析以β-actin為內(nèi)參基因，按照2-△△Ct方法計算各基因相對表達(dá)豐度。每個樣品設(shè)有3個獨(dú)立生物學(xué)重復(fù)，每個重復(fù)進(jìn)行3個技術(shù)重復(fù)。

1.10 CCK8檢測SSCs的細(xì)胞活力

將SSCs傳至96孔細(xì)胞板中培養(yǎng)，每孔加入100 μL含添加物的細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)，進(jìn)行檢測前先用PBS清洗2～3次去除添加物殘留。各處理組設(shè)6個生物學(xué)重復(fù)，同時建立不含細(xì)胞的空白對照組，在每孔中加入100 μL常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)液和10 μL CCK 8。37 ℃溫箱中孵育30～60 min，放入酶標(biāo)儀內(nèi)檢測并記錄450 nm波長吸光度。計算各孔細(xì)胞的細(xì)胞活力，計算公式為：細(xì)胞活力(%)=[A(加藥)-A(空白)]/[A(對照)-A(空白)]×100。其中，A(加藥)為具有細(xì)胞、CCK8溶液、藥物溶液孔的吸光度；A(對照)為具有細(xì)胞、CCK8溶液而不含藥物孔的吸光度；A(空白)為只含有培養(yǎng)液、CCK8溶液孔的吸光度。

1.11 SSCs的總ROS檢測

按1∶1 000比例添加Rousp處理30 min設(shè)置陽性對照，用無血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA濃度為10 μmol·L-1，對于6孔板每孔加入稀釋液不能少于1 mL。37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min后，用無血清培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3次，熒光顯微鏡下觀察。

1.12 SSCs的總GSH含量檢測

離心收集細(xì)胞，加入細(xì)胞沉淀體積3倍量的蛋白去除試劑S溶液并充分震蕩。然后利用液氮和37 ℃水浴對樣品進(jìn)行兩次快速的凍融，4 ℃或冰浴放置5 min后，4 ℃ 10 000×g離心10 min，取上清用于總谷胱甘肽(glutathione，GSH)的測定。在96孔 板中加入10 μL樣品和150 μL總谷胱甘肽檢測工作液，孵育5 min后加入50 μL (0.5 mg·mL-1)NADPH，室溫孵育25 min并利用酶標(biāo)儀測定412 nm 吸光度。

1.13 SSCs的總蛋白提取及凋亡蛋白的Western blot檢測

根據(jù)蛋白大小按照Western blot試劑盒(賽維爾)內(nèi)推薦濃度制膠。分別制作10%分離膠與5%濃縮膠，蛋白點(diǎn)樣后90 V電壓下電泳25 min，確保條帶位于兩層膠交界處。120 V電壓繼續(xù)電泳50 min，至蛋白marker完全分離。剪取PVDF膜浸泡在甲醇中激活5 min后，確保PVDF膜與蛋白膠之間無氣泡并能完全覆蓋,將轉(zhuǎn)膜夾安裝在電泳槽中，加入預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜液，埋在冰中用200 mA穩(wěn)定電流轉(zhuǎn)膜1 h。PVDF膜浸入含5%脫脂奶粉的TBST封閉液中，與37 ℃搖床100 r·min-1孵育2 h?？贵w按需求提前稀釋，一抗4 ℃孵育過夜，二抗與37 ℃ 搖床100 r·min-1孵育1 h。清洗PVDF膜，加入顯影液后放入化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)采集圖像，利用ImageJ 軟件進(jìn)行條帶光灰度值分析。

1.14 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析及作圖使用Praphpad prism 5軟件，兩組間數(shù)據(jù)差異采用t檢驗(yàn)分析。無差異時不表示(P>0.05)，差異顯著以*表示(P<0.05)，差異極顯著時以**表示(P<0.01)。

2 結(jié) 果

2.1 豬SSCs的鑒定

2.1.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 分離的細(xì)胞培養(yǎng)至14 d 左右時，團(tuán)塊大小和數(shù)量不斷增大，并可用肉眼觀察到細(xì)胞培養(yǎng)板中的白色克隆團(tuán)(圖1A)。在400倍 顯微鏡下觀察克隆團(tuán)，可觀察到克隆團(tuán)主要由無色圓形細(xì)胞聚集而成(圖1B)。本研究在培養(yǎng)豬SSCs過程中發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)的SSC呈圓形或橢圓形，并且在體外培養(yǎng)過程中單獨(dú)的細(xì)胞會聚集轉(zhuǎn)變?yōu)橛辛Ⅲw結(jié)構(gòu)的圓簇型或葡萄簇型，符合SSCs體外培養(yǎng)的生長特性[9-10]。

A.細(xì)胞克隆團(tuán)；B.顯微鏡觀察細(xì)胞克隆團(tuán)(400×)A.Cloning cluster;B.Microscopic observation of the cell clones(400×)圖1 克隆團(tuán)細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察Fig.1 Observation of the morphology of clonal cells

2.1.2 AKP染色鑒定克隆樣細(xì)胞 AKP染色前觀察細(xì)胞狀態(tài)，圓簇型克隆團(tuán)及飼養(yǎng)層細(xì)胞處于無色透明狀態(tài)(圖2A)。染色后觀察，克隆團(tuán)細(xì)胞被染為棕褐色，飼養(yǎng)層細(xì)胞大部分不著色(圖2B)。可初步說明克隆團(tuán)內(nèi)存在SSCs。

A.AKP染色前克隆團(tuán)無色透明；B.AKP染色后克隆團(tuán)著深褐色A.The clone cluster is colorless and transparent before AKP staining;B.After AKP staining,the clone cluster with alkaline phosphatase positive is dark-brown圖2 克隆團(tuán)細(xì)胞堿性磷酸酶染色Fig.2 Alkaline phosphatase staining of clonal cells

2.1.3 SSCs分子標(biāo)記檢測 實(shí)時定量PCR檢測結(jié)果表明，干細(xì)胞標(biāo)志基因OCT4在克隆團(tuán)細(xì)胞中表達(dá)量顯著高于ST細(xì)胞與間質(zhì)細(xì)胞(leydig cells，LY)(圖3B)；SSCs標(biāo)志基因NANOG在克隆團(tuán)細(xì)胞中表達(dá)量顯著高于ST細(xì)胞與LY細(xì)胞(圖3 A)；SSCs標(biāo)志基因PLZF在克隆團(tuán)細(xì)胞中表達(dá)量顯著高于ST細(xì)胞與LY細(xì)胞(圖3C)。表明克隆團(tuán)主要由SSCs組成。

A.NANOG基因的表達(dá)差異；B.OCT4基因的表達(dá)差異；C.PLZF基因的表達(dá)差異。*.P<0.05；**.P<0.01，下同A.Difference in expression of NANOG gene;B.Difference in expression of OCT4 gene;C.Difference in expression of PLZF gene.*.P<0.05；**.P<0.01,the same as below圖3 實(shí)時定量PCR檢測標(biāo)志基因表達(dá)量Fig.3 Quantitative real-time PCR detection of marker genes expression

2.1.4 細(xì)胞免疫熒光檢測 熒光顯微鏡下觀察處理后的細(xì)胞爬片,其中DAPI將所有細(xì)胞核染出。調(diào)整熒光鏡片，可觀測到UCHL1及SOX2抗體陽性熒光反應(yīng)(圖4)。將兩組結(jié)果組合，發(fā)現(xiàn)熒光抗體陽性反應(yīng)主要集中于細(xì)胞克隆團(tuán)處，克隆團(tuán)周圍其它細(xì)胞無熒光信號。結(jié)果表明，克隆團(tuán)細(xì)胞特異性表達(dá)SSCs標(biāo)記基因UCHL1與干細(xì)胞標(biāo)志基因SOX2。

2.2 MT對SSCs的影響

2.2.1 MT提高豬SSCs活力 設(shè)置MT濃度梯度組處理SSCs，經(jīng)CCK8細(xì)胞活力檢測發(fā)現(xiàn)，各濃度組在處理細(xì)胞24 h時，細(xì)胞活力無顯著差異；各濃度組在處理48 h時，MT濃度50 μmol·mL-1以上的處理組細(xì)胞活力較對照組顯著上升(P<0.05，圖5)。結(jié)果表明，MT具有提高豬SSCs細(xì)胞活力的作用。

A.48 h時各處理組與對照組間存在顯著差異(P<0.05)A.There is a significant difference between the treatment groups and the control group at 48 h(P<0.05)圖5 MT對豬SSCs活力的影響Fig.5 Effect of MT on the cell viability in SSCs of pigs

2.2.2 MT降低豬SSCs ROS水平 Rosup處理細(xì)胞作為陽性對照(圖6A)，不同濃度MT處理細(xì)胞48 h后檢測各組熒光強(qiáng)度(圖6B～D)。將各組熒光結(jié)果進(jìn)行量化，50 μmol·mL-1處理組ROS水平與對照組無顯著差異，250 μmol·mL-1處理組ROS水平顯著低于對照組(P<0.05，圖6E)。結(jié)果表明，MT處理SSCs后可降低細(xì)胞內(nèi)ROS水平。

A.Rosup處理細(xì)胞30 min；B.DMSO處理細(xì)胞48 h；C.50 μmol·mL-1 MT處理細(xì)胞48 h；D.250 μmol·mL-1 MT處理細(xì)胞48 h；E.ROS熒光強(qiáng)度量化A.Rosup treatment of cells;B.DMSO treated cells for 48 h;C.50 μmol·mL-1 MT treatment for 48 h;D.250 μmol·mL-1 MT treatment for 24 h;E.Quantification of ROS fluorescence intensity圖6 MT對豬SSCs內(nèi)ROS含量的影響Fig.6 Effect of MT on the content of ROS in pig SSCs

2.2.3 MT提高豬SSCs GSH含量 稀釋谷胱甘肽(glutathione，GSH)標(biāo)準(zhǔn)品為2、5、10、15、25 mol·L-1制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖7A)。檢測發(fā)現(xiàn)，50 μmol·mL-1MT處理SSCs 48 h后細(xì)胞內(nèi)GSH含量無顯著變化，250 μmol·mL-1MT處理SSCs 48 h后，細(xì)胞內(nèi)GSH含量極顯著上升(P<0.01，圖7B)。結(jié)果表明，MT添加后可提高SSCs內(nèi)GSH含量。

A.GSH濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線；B.不同濃度MT處理48 h后GSH含量A.GSH concentration standard curve;B.Changes in GSH content after treatment with different concentrations of MT after 48 h圖7 MT對豬SSCs內(nèi)GSH含量的影響Fig.7 Effect of MT on GSH content in pig SSCs

2.2.4 MT抑制凋亡蛋白表達(dá) 選用50、250 μmol·mL-1濃度MT處理細(xì)胞48 h后提取蛋白。蛋白條帶結(jié)果顯示，50與250 μmol·mL-1處理組總Caspase 3、Bax凋亡蛋白亮度隨著MT濃度增加而變暗，Bcl-2抗凋亡蛋白亮度無明顯變化(圖8A)。量化蛋白條帶灰度值，檢測到到250 μmol·mL-1組總Caspase 3表達(dá)量極顯著低于對照組(P<0.01，圖8C)，50 和250 μmol·mL-1組Bax/Bcl-2比值顯著低于對照組(P<0.05，圖8 B)。

A.凋亡蛋白條帶分析；B.Bax/Bcl-2量化蛋白條帶灰度值量化；C.Caspase 3量化蛋白條帶灰度值量化A.Band analysis of apoptotic protein;B.Quantification of gray value of Bax/Bcl-2 protein band;C.Quantification of gray value of Caspase 3 protein band圖8 MT對豬 SSCs內(nèi)凋亡蛋白表達(dá)的影響Fig.8 Effect of MT on the expression of apoptotic protein in pig SSCs

3 討 論

對SSCs的研究需要大量活性和純度高的細(xì)胞，因此，幼齡動物的睪丸是理想的實(shí)驗(yàn)材料。本研究選用了7日齡大白豬睪丸進(jìn)行細(xì)胞分離，此時生精小管內(nèi)SSCs細(xì)胞數(shù)量處于一個巔峰狀態(tài)，且分化進(jìn)程還未發(fā)生。SSCs起源于胚胎外胚層，與胚胎干細(xì)胞具有相同的特性，單個細(xì)胞呈圓形或橢圓形，細(xì)胞直徑約為9～12 μm，胞內(nèi)除線粒體、核糖體外其它細(xì)胞器均不發(fā)達(dá)[11]。Zhang等[12]分離PIC豬的生殖細(xì)胞，在培養(yǎng)過程中細(xì)胞會發(fā)生聚集形成SSCs群落。Zhao等[9]通過分離巴馬香豬的SSCs發(fā)現(xiàn)，體外培養(yǎng)的SSCs會聚集成圓簇狀或葡萄簇狀的克隆團(tuán)。本研究在培養(yǎng)分離的細(xì)胞3 d后觀察到細(xì)胞開始聚集，7 d后觀察到結(jié)構(gòu)緊密的細(xì)胞簇出現(xiàn)，挑克隆觀察發(fā)現(xiàn)，由若干圓形細(xì)胞構(gòu)成，培養(yǎng)過程中具有SSCs的生長特征。

SSCs的分離純化是進(jìn)行體外培養(yǎng)及研究的基礎(chǔ)。最早人們利用胰蛋白酶、DNase Ⅰ曾成功分離出小鼠SSCs，后經(jīng)不斷完善，利用膠原酶Ⅳ、胰蛋白酶及DNase Ⅰ分步消化是最為常用的方法[13]。膠原酶Ⅳ可以消化睪丸組織中的細(xì)胞間質(zhì)，胰蛋白酶消化使細(xì)胞分散，而DNase Ⅰ可以消化漂浮的DNA防止細(xì)胞黏連。本研究以觀察到生精小管的出現(xiàn)表示膠原酶Ⅳ消化完全。胰蛋白酶主要作用是使細(xì)胞分散，本研究中，為避免消化時間過長對SSCs造成損傷，以能觀察到大部分生精小管被消化表示胰蛋白酶消化完全。

SSCs常用的純化方法是差速貼壁法，其利用了不同細(xì)胞間貼壁速率差異的特性。將細(xì)胞懸液在明膠基質(zhì)或?qū)羽みB蛋白包被過的培養(yǎng)皿上短時間培養(yǎng)，SSCs由于貼壁能力差，短時內(nèi)只會松散依附在其它細(xì)胞上層。此時輕輕吹打后收集未貼壁細(xì)胞，并對此進(jìn)行多次貼壁培養(yǎng)，最終即可得到相對純度較高的SSCs[14]。此方法一般用于分離小鼠或大鼠等動物的睪丸細(xì)胞，但近年來有也有用此方法成功分離出牛和豬等大型動物SSCs的報道[15]。本研究共進(jìn)行了兩次差速貼壁獲得3批細(xì)胞，其中第3批細(xì)胞在培養(yǎng)7 d后可觀察到大量SSCs樣克隆團(tuán)出現(xiàn)。由于SSCs差速貼壁后仍無法與其它細(xì)胞徹底分離，故進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)前應(yīng)采用挑克隆培養(yǎng)方式進(jìn)一步純化。

AKP染色是常用的干細(xì)胞鑒定方式。未分化的干細(xì)胞膜上具有高水平的AKP表達(dá)，利用試劑盒可使細(xì)胞內(nèi)的AKP水解生成奈酚，與重氮鹽結(jié)合后呈藍(lán)紫或深褐色顯現(xiàn)，此方法已在小鼠上成功鑒定出SSCs[16-17]。Zhao等[9]通過AKP染色鑒定出了巴馬香豬的SSCs，陳庭鋒[10]通過AKP染色鑒定出了姜曲海豬的SSCs。為避免染色過深造成視野不清晰，本研究的避光染色過程中為15 min，染色后可明顯觀察到細(xì)胞克隆團(tuán)著棕褐色，表明克隆團(tuán)細(xì)胞中存在SSCs。

有報道稱，一些分子可作為豬SSCs標(biāo)志物,但由于其自身功能復(fù)雜等原因，特異性及敏感度較高的SSCs標(biāo)志物仍無法統(tǒng)一[18]。OCT4(POU5F1)屬于POU轉(zhuǎn)錄因子家族的V類，是干細(xì)胞中普遍表達(dá)的特異性基因，其表達(dá)量會隨著干細(xì)胞分化的進(jìn)行而不斷下降[19]。SOX2屬于SOXB1亞家族，作為一種干細(xì)胞中常見的標(biāo)志物，在SSCs及其起源早期原始生殖細(xì)胞(primordial germ cell,PGC)中都有表達(dá)[20-21]。Buaas等[22]在小鼠中敲除PLZF基因后發(fā)現(xiàn)，小鼠產(chǎn)生生殖缺陷，染色后觀察到PLZF與OCT4在未分化SSCs中共表達(dá)，可作為標(biāo)志基因。NANOG被發(fā)現(xiàn)在豬SSCs內(nèi)特異性表達(dá)，表達(dá)量會隨著動物年齡增長而不斷下調(diào)[23]。UCHL1(PGP9.5)全稱泛素末端水解酶1，被證實(shí)在豬、牛、水牛、山羊SSCs上特異性表達(dá)，現(xiàn)常作為家畜生殖細(xì)胞鑒定的有效標(biāo)志物[24]。本研究選用睪丸內(nèi)常見的ST細(xì)胞和LY細(xì)胞作為對照，利用實(shí)時定量PCR的方法檢測標(biāo)志基因在不同細(xì)胞中表達(dá)量的差異。從結(jié)果可以看出，克隆團(tuán)細(xì)胞中干細(xì)胞標(biāo)志基因OCT4及SSCs標(biāo)記基因NANOG、PLZF表達(dá)量均顯著高于對照組，說明，克隆團(tuán)細(xì)胞主要由SSCs組成。采用細(xì)胞免疫熒光法處理細(xì)胞，經(jīng)熒光顯微鏡下可觀察到克隆團(tuán)處具有熒光反應(yīng)，證明克隆團(tuán)細(xì)胞表達(dá)SSCs的標(biāo)記基因UCHL1與干細(xì)胞標(biāo)志基因SOX2。通過上述鑒定結(jié)果可證明，培養(yǎng)得到的克隆團(tuán)細(xì)胞主要為SSCs。

MT作為一種調(diào)控動物生殖發(fā)育的重要激素，在動物生殖系統(tǒng)中分布廣泛。有研究稱，MT能顯著提高精子質(zhì)量和活力，增強(qiáng)受精過程中精子的超活化作用，可充當(dāng)凍精保護(hù)劑使用[25]。Gholami等[26]對移植了SSCs的小鼠連續(xù)10 d注射MT，HE染色后發(fā)現(xiàn)，注射MT小鼠生精小管內(nèi)細(xì)胞的形態(tài)明顯好于未注射MT的小鼠。對于體外培養(yǎng)的卵母細(xì)胞，MT能顯著提高細(xì)胞的成熟，并保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激的影響[27-28]。雖有關(guān)MT作用的報道已有很多，但其是否對豬SSCs有直接影響仍未見報道。本研究設(shè)置了若干MT濃度組處理SSCs，發(fā)現(xiàn)在處理48 h后50 μmol·mL-1以上試驗(yàn)組細(xì)胞活力發(fā)生顯著升高。表明MT對豬SSCs的細(xì)胞活力有促進(jìn)作用。

精液冷凍過程中常用MT作為保護(hù)劑使用。李崇陽[29]通過研究奶牛性控凍精后發(fā)現(xiàn)，MT能有效緩解精子解凍過程中產(chǎn)生的ROS。本研究在添加MT后發(fā)現(xiàn)，SSCs內(nèi)ROS含量隨MT濃度的上升而下降，GSH含量隨著MT濃度的升高而上升。上述結(jié)果說明，MT是可通過提高SSCs內(nèi)GSH含量來清除細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的ROS，保護(hù)細(xì)胞不受損傷。另一方面，MT主要通過受體介導(dǎo)G蛋白信號傳導(dǎo)途徑行使生理功能，其中，MT1和MT2受體亞型存在于所有脊椎動物中[30]。Yang等[31]發(fā)現(xiàn)，牛ST細(xì)胞MT1、MT2 基因表達(dá)隨著MT濃度提高而上升。李波[32]在用MT處理小鼠SSCs細(xì)胞后檢測到MT1、MT2蛋白表達(dá)升高。本研究下一步將驗(yàn)證MT處理后豬SSCsMT1、MT2基因的表達(dá)變化。

細(xì)胞在正常生理活動過程中或受到外界刺激對導(dǎo)致ROS含量升高。張明[33]在用鎘處理豬ST細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞ROS含量上升發(fā)生氧化損傷并引發(fā)細(xì)胞凋亡。有報道稱，通過添加玉米赤霉烯酮而引發(fā)氧化損傷的ST細(xì)胞中，線粒體會釋放細(xì)胞色素C(cytochrome c，Cyt-c)到胞漿中,活化Caspase 9后進(jìn)一步激活凋亡基因Caspase3的表達(dá)[34-35]。另一方面，促凋亡蛋白Bax可轉(zhuǎn)移至線粒體膜上，形成一條Bax通道來介導(dǎo)Cyt-c釋放的過程[36-37]。同屬于Bcl家族的Bcl-2是抗凋亡蛋白中的一種，除可調(diào)節(jié)Caspase家族的激活外，其BH1、BH2結(jié)構(gòu)域還會與Bax結(jié)合發(fā)生異二聚化來限制Bax的凋亡作用，并通過兩者間比例來決定細(xì)胞的存亡[38-40]。本研究利用Western blot檢測MT處理后細(xì)胞中凋亡蛋白表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)隨著MT濃度升高凋亡蛋白Caspase 3與Bax/Bcl-2比例發(fā)生下降。由于MT能有效清除細(xì)胞受外界刺激或代謝過程中產(chǎn)生的ROS，細(xì)胞損傷得到抑制促使了凋亡基因表達(dá)下調(diào)。如后續(xù)研究可驗(yàn)證MT不會對SSCs產(chǎn)生促分化等其他影響，則可考慮在體外培養(yǎng)SSCs的過程中加入MT來保護(hù)細(xì)胞存活。

4 結(jié) 論

添加MT后可促進(jìn)豬SSCs細(xì)胞活力上升，是由于MT可直接清除細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的ROS，提高了總GSH含量，抑制了凋亡基因的表達(dá)。表明MT具有保護(hù)細(xì)胞不受損傷和促進(jìn)豬SSCs活力的作用。