傅 芳，王 利*，羅曉林，官久強

(1.西南民族大學(xué) 青藏高原動物遺傳資源保護與利用教育部和四川省重點實驗室，成都 610041；2.四川省草原科學(xué)研究院，成都 611731)

胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白(insulin-like growth factor binding proteins,IGFBPs)是IGFs的重要組成之一，與IGF配體、IGF受體間相互作用共同調(diào)節(jié)生物學(xué)過程，是胚胎正常發(fā)育和出生后機體生長必需的生長因子，參與了脊椎動物生長、新陳代謝、生殖和免疫等調(diào)控過程[1-2]。IGFBPs主要涉及IGF依賴和獨立作用，IGF依賴作用主要體現(xiàn)在調(diào)節(jié)IGF的生物利用度，獨立作用主要體現(xiàn)在細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期等調(diào)控作用[3]。IGFBP4是IGF信號通路中一種重要的抑制因子，與IGF配體具有較強的親和力，主要表現(xiàn)為IGF依賴作用，可與IGF配體結(jié)合調(diào)節(jié)生物活性[4]。IGFBP5作為IGFBPs家族中最保守的成員，也主要表現(xiàn)為IGF依賴作用，體現(xiàn)在既能高親和地與IGF配體結(jié)合以降低游離IGF配體濃度達到抑制IGF配體的作用，又能結(jié)合IGF配體后將其募集到低濃度區(qū)域達到促進IGF配體的作用[5]。IGFBP4和IGFBP5可通過協(xié)同作用參與諸多生物過程如肝的生長發(fā)育等，在動物的生長發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用[6]。目前已知的7種IGFBPs(IGFBP1～IGFBP7)雖都能與IGF配體結(jié)合，但在組織器官分布及生物學(xué)作用上不盡相同。迄今為止，關(guān)于黃牛[7]、綿羊[8]和山羊[9-10]等多種大型家畜的IGFBP4和IGFBP5相繼被克隆報道，但尚未見其在牦牛中的研究。

牦牛(Bosgrunniens)是我國青藏高原高山牧區(qū)特有的畜牧種質(zhì)資源，常年生活在氣候寒冷、高度缺氧、強紫外線、牧草缺少等極端生態(tài)環(huán)境中，它們?yōu)樯钤诟吆０蔚霓r(nóng)牧民提供了基本的乳肉品資源，也是當(dāng)?shù)匦竽翗I(yè)發(fā)展的重要保障[11-12]。麥洼牦牛主產(chǎn)于四川省阿壩藏族羌族自治州海拔3 500 m以上的紅原縣瓦切、麥洼及若爾蓋縣包座一帶，是乳肉兼用高原型地方優(yōu)良品種，也是我國動物遺傳資源中珍稀的畜種資源和基因庫[13-14]。肝是哺乳動物機體內(nèi)最大的消化腺及代謝器官，利用內(nèi)分泌因子不斷調(diào)節(jié)新陳代謝平衡，在各種營養(yǎng)/有害物質(zhì)代謝、蛋白質(zhì)合成和消化液合成等過程中發(fā)揮重要功能[15-16]。動物生長發(fā)育過程中，外源性細(xì)胞色素P450等生物活性物質(zhì)可對肝的成熟和代謝進行調(diào)節(jié)[17]。因此，本研究以麥洼牦牛為試驗對象，克隆IGFBP4和IGFBP5基因序列，分析其分子結(jié)構(gòu)及功能，并探究其在麥洼牦牛肝組織不同生長階段的表達特征，為該類因子對牦牛肝生長發(fā)育調(diào)控及其功能研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本采集及處理

試驗動物分為1日齡組、15月齡組和5歲齡組的健康雌性麥洼牦牛，每組3個生物學(xué)重復(fù)，體重分別約為(12.35±1.85)、(98.88±2.50)和(268.55±27.82)kg，采自四川省阿壩藏族羌族自治州紅原縣?？崭?4 h后快速放血處死，取5歲齡麥洼牦牛心、肝、脾、肺、腎、小腸組織及1日齡、15月齡和5歲齡 麥洼牦牛肝組織放入液氮中冷凍，并于-80 ℃ 保存?zhèn)溆?。部?日齡、15月齡和5歲齡麥洼牦牛肝組織用4%多聚甲醛固定，運回實驗室置于常溫備用。

1.2 主要試劑及儀器

1.1×T3 Super PCR Mix、DL-2000 DNA marker購自北京擎科公司；RNAiso Plus、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒、TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ購自日本TaKaRa公司；動物全蛋白提取試劑盒(C510003)、HRP標(biāo)記的山羊抗兔/鼠IgG(D110058、D110087)、PVDF印跡膜(F619536)、ECL發(fā)光試劑(C510043)購自上海生工公司；BCA Protein Assay Kit購自天根生化科技有限公司；多克隆兔抗IGFBP4和IGFBP5(bs-10585R、bs-0406R)購自北京Bioss公司；單克隆鼠抗β-actin(CW0096)購自北京康為世紀(jì)公司；組化二抗試劑盒(產(chǎn)品編號為SP9001)購自北京中杉金橋公司。

穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀(型號為DYY-6B)購自北京市六一儀器廠；冷凍離心機(型號為5430R)購自德國Eppendorf公司；凝膠成像系統(tǒng)(型號為Universal Hood II)、實時熒光定量PCR儀(型號為CFX96)、半干轉(zhuǎn)膜儀(型號為Trans-Blot TurboTMSystem)、免染蛋白印跡轉(zhuǎn)運系統(tǒng)(型號為ChemiDocTMImaging System)購自美國Bio-Rad公司；紫外可見分光光度計BioSpec-nano購自日本島津生命科學(xué)公司；光學(xué)顯微鏡(型號為CX22)購自日本OLMPUS公司；石蠟切片機(型號為RM2235)、徠卡顯微成像系統(tǒng)(型號為DM1000)購自德國Leica公司。

1.3 IGFBP4和IGFBP5基因擴增

取5歲齡牦牛心、肝、脾、肺、腎和小腸及1日齡、15月齡和5歲齡牦牛肝于液氮中快速冷凍，各加入RNAiso Plus提取總RNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳及BioSpec-nano分別檢測RNA的完整性和質(zhì)量。參考本試驗室已有牦牛肝轉(zhuǎn)錄組序列，用Primer Premier 5.0設(shè)計引物序列，詳見表1，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。取肝cDNA(采用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒合成cDNA)進行PCR擴增，反應(yīng)體系：模板cDNA 1 μL，上、下游引物(10 μmol·L-1)各1 μL，1.1×T3 Super PCR Mix 22 μL。反應(yīng)程序：98 ℃ 2 min；98 ℃ 10 s，63 ℃ 10 s，72 ℃ 30 s，共35個循環(huán)；72 ℃ 2 min；4 ℃保存。將陽性PCR產(chǎn)物送公司測序。

表1 基因的引物序列Table 1 Primer sequence of genes

1.4 IGFBP4和IGFBP5基因生物信息學(xué)分析

采用DNAStar、DNAMAN等軟件組裝、翻譯測序結(jié)果，并通過Blast與NCBI數(shù)據(jù)庫序列進行比對；應(yīng)用Mega5.2軟件中的鄰接法(Neighbor-Joining，NJ算法)構(gòu)建氨基酸系統(tǒng)進化樹，用MegAlign軟件分析其基因同源性；用ExPASy在線軟件(https://www.expasy.org)進行蛋白結(jié)構(gòu)分析。

1.5 IGFBP4和IGFBP5基因表達譜分析

用qRT-PCR方法檢測IGFBP4和IGFBP5基因在5歲齡牦牛各組織中的表達情況。以β-actin作為內(nèi)參基因，引物序列詳見表1。qRT-PCR擴增體系：模板cDNA 1 μL，上、下游引物各0.8 μL，ddH2O 2.2 μL，TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ 5.2 μL。擴增程序：95 ℃ 3 min；95 ℃ 10 s，65 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，共39次循環(huán)；熔解曲線65～95 ℃ 每5 s增加0.5 ℃。

1.6 IGFBP4和IGFBP5 mRNA在牦牛不同生長階段肝中的表達

以β-actin作為內(nèi)參基因，用qRT-PCR方法檢測IGFBP4和IGFBP5基因在1日齡、15月齡和5歲齡 牦牛肝中的表達水平。反應(yīng)體系、程序同1.5，引物序列詳見表1。用本實驗室已有的肝RNA-Seq數(shù)據(jù)分析IGFBP4和IGFBP5基因在1日齡、15月齡和5歲齡牦牛肝中的表達水平。

1.7 IGFBP4和IGFBP5蛋白在牦牛不同生長階段肝中的表達

取1日齡、15月齡和5歲齡牦牛肝組織樣品，根據(jù)動物全蛋白提取試劑盒提取肝組織總蛋白，按照BCA Protein Assay Kit進行濃度檢測，并將其稀釋為同一濃度，分裝后于-80 ℃保存。將蛋白經(jīng)SDS-PAGE分離后，以25 V轉(zhuǎn)膜30 min，5%脫脂奶粉封閉，先后孵育IGFBP4、IGFBP5、β-actin一抗(4 ℃過夜，1∶1 000/1∶1 000/1∶2 500)和IgG-HRP二抗(室溫1 h，1∶10 000)，利用化學(xué)發(fā)光液進行ECL顯色并拍照。

1.8 IGFBP4和IGFBP5蛋白在牦牛不同生長階段肝中的定位及表達

利用免疫組化染色法檢測 IGFBP4和IGFBP5蛋白的定位及表達。將1日齡、15月齡和5歲齡牦牛肝組織從4%的多聚甲醛固定液中取出，制成石蠟切片。用0.01 mol·L-1PBS代替一抗作陰性對照，脫蠟水化后用枸櫞酸緩沖液(pH 6.0)進行抗原修復(fù)，加入阻斷劑后用PBS (pH 7.4)沖洗；滴加適量的正常山羊血清進行封閉，滴加一抗(多克隆兔抗IGFBP4和IGFBP5均按1∶100稀釋后使用)4 ℃ 孵育過夜后滴加二抗，加入適量DAB顯色液顯色，蘇木精復(fù)染后，脫水、透明、封片。用光學(xué)顯微鏡觀察染色結(jié)果并拍照。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

qRT-PCR檢測結(jié)果以肺的Ct值作為不同組織間差異定量分析的參照，采用2-ΔΔCT法進行分析；Western blot檢測結(jié)果采用Image J軟件測定結(jié)果圖片中的灰度值并進行分析；免疫組化結(jié)果采用Image Pro Plus 6.0計算機圖像分析軟件測定IGFBP4和IGFBP5陽性反應(yīng)物的相對平均光密度值并進行分析。以上各數(shù)據(jù)均使用SPSS 24.0統(tǒng)計軟件進行單因素ANOVA分析，結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 IGFBP4和IGFBP5基因克隆

取5歲齡牦牛心、肝、脾、肺、腎和小腸及1日齡、15月齡和5歲齡牦牛肝的總RNA，檢測可觀察到清晰的5S、18S和28S三條帶，其OD260nm/OD280nm值均在1.8～2.0之間，說明提取的RNA完整性較高、質(zhì)量較好。IGFBP4和IGFBP5基因PCR擴增后分別得到777 和816 bp的條帶(圖1)，將測序得到的基因序列提交至GenBank，序列號分別為MT012934、MT003005。

當(dāng)由于某種原因?qū)е律鲜稣{(diào)節(jié)器動作仍不能降低出口壓力或者仍不能提高出口流量，以至于出口壓力大于安全線PAH時或者出口流量低于安全線FAL時，為防止喘振，聯(lián)鎖動作，旁路閥快速打開，同時DCS上將旁路閥閥開度鎖定在100%上，入口導(dǎo)流葉片閥開度鎖定在0%上，壓縮機卸載。

M.DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1～2.IGFBP4和IGFBP5基因擴增產(chǎn)物M.DNA Marker 2 000 bp；1-2.The products of IGFBP4 and IGFBP5 genes,respectively圖1 IGFBP4和IGFBP5基因PCR結(jié)果Fig.1 PCR amplification of IGFBP4 and IGFBP5 genes

2.2 IGFBP4和IGFBP5基因生物信息學(xué)分析

2.2.1 IGFBP4和IGFBP5系統(tǒng)進化樹構(gòu)建及基因同源性分析 牦牛IGFBP4和IGFBP5基因的開放閱讀框分別為777 和816 bp，分別編碼258和271個氨基酸。IGFBP4和IGFBP5蛋白序列構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹如圖2所示，牦牛IGFBP4和IGFBP5蛋白均最先與黃牛、水牛聚為一簇，再與綿羊、山羊、馬、豬聚為一簇，最后與小鼠、大鼠和人聚為一簇，表明牦牛IGFBP4和IGFBP5蛋白CDS區(qū)高度保守，與黃牛親緣關(guān)系最近，其次為水牛。同源性分析顯示，牦牛IGFBP4和IGFBP5基因與黃牛的同源性最高，分別達99.6%、99.5%，與水牛(99.1%、98.8%)、山羊(98.8%、97.2%)、綿羊(98.7%、97.7%)、豬(95.5%、95.2%)、馬(93.6%、93.8%)、人(95.2%、94.7%)次之，與大鼠(88.0%、90.1%)、小鼠(89.0%、89.8%)的同源性最低。分析同物種間IGFBP4和IGFBP5基因的同源性結(jié)果可知，牦牛、黃牛、水牛、綿羊、山羊、豬、馬、小鼠、大鼠、人基因間同源性在55.1%～59.2%之間，其中牦牛IGFBP4和IGFBP5基因間的同源性達58.7%。

圖2 IGFBP4和IGFBP5蛋白系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建Fig.2 Phylogenetic tree of IGFBP4 and IGFBP5 proteins

2.2.2 IGFBP4和IGFBP5蛋白結(jié)構(gòu)分析 預(yù)測得到IGFBP4和IGFBP5蛋白的分子式分別為C1184H1914N364O363S25、C1294H2092N390O394S28，分子量分別為27.86和30.31 ku，等電點分別為7.10和8.56，說明此兩種蛋白均為弱堿性蛋白。其平均親水性(GRAVY)分別為-0.474和-0.631，可知這兩種蛋白質(zhì)均為親水性蛋白質(zhì)，與ProtScale分析結(jié)果一致。IGFBP4和IGFBP5分別在1～18和2～20位 氨基酸處具有跨膜區(qū)，均為跨膜蛋白；分別在23、20位氨基酸上存在剪切位點峰值(C值：0.702、0.785)，23、20位存在結(jié)合剪切位點峰值(Y值：0.786、0.853)和9、11位存在信號肽峰值(S值：0.984、0.989)，表明均有信號肽序列，為分泌蛋白。

IGFBP4和IGFBP5蛋白分別由59.69%和62.36%的隨機卷曲、25.97%和20.30%的α-螺旋、9.30%和9.23%的延伸鏈、5.04%和8.12%的β-轉(zhuǎn)角組成，表明這兩種蛋白主要結(jié)構(gòu)元件均為隨機卷曲和α-螺旋。IGFBP4和IGFBP5蛋白分別在25～101、174～249位氨基酸和24～100、191～262位 氨基酸均具有胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)域和甲狀腺球蛋白1結(jié)構(gòu)域，分別屬于胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白超家族結(jié)構(gòu)域(IGFBP superfamily)和甲狀腺球蛋白超家族結(jié)構(gòu)域(TY superfamily)。三級結(jié)構(gòu)預(yù)測表明，IGFBP4模型與1wqj.1.A模型一致性最高，可達到97.50%；IGFBP5模型與2 dsq.1.A模型一致性最高，可達到64.63%。

2.3 牦牛IGFBP4和IGFBP5基因組織表達譜

IGFBP4和IGFBP5基因在5歲齡牦牛不同組織中表達量結(jié)果表明，IGFBP4在肝中表達量最高，與腎、心臟、小腸、脾、肺均存在極顯著差異(P<0.01)，腎、心中次之，小腸和脾中表達較弱，肺臟中表達量最低。IGFBP5在肝臟中表達量最高，與腎、心、小腸、脾、肺均存在極顯著差異(P<0.01)，腎、心中次之，小腸和脾中表達較弱，肺中表達量最低(圖3)。

同一組織中IGFBP4和IGFBP5基因差異表達量結(jié)果表明，在心、肝、脾、肺、腎和小腸6種組織中IGFBP4基因的表達量均極顯著高于IGFBP5基因的表達量，具有極顯著差異(P<0.01)(圖3)。計算IGFBP4和IGFBP5基因在不同組織中表達量之間的皮爾遜相關(guān)性可知，其皮爾遜相關(guān)系數(shù)(r)為0.992，即兩基因間表達量呈正相關(guān)。綜上所述，IGFBP4和IGFBP5基因在各組織中均有表達，且IGFBP4基因的表達量極顯著高于IGFBP5，均在肝中表達量最高，存在極顯著差異(P<0.01)，具有組織特異性。

不同大寫字母表示同一基因在不同組織之間的表達差異極顯著(P<0.01)；**表示同種組織不同基因之間的表達差異極顯著(P<0.01)The different uppercase letters indicate that the expression difference between different tissues in the same gene is extremely significant (P<0.01);Statistically significant expression differences between different genes in the same tissue are indicated by double asterisks (P<0.01)圖3 牦牛IGFBP4和IGFBP5基因的組織表達譜Fig.3 The expression of IGFBP4 and IGFBP5 genes in different tissues of yak

2.4 qRT-PCR檢測IGFBP4和IGFBP5 mRNA在牦牛不同生長階段肝中的表達

分別用qRT-PCR檢測和本實驗室已有的肝RNA-Seq數(shù)據(jù)分析IGFBP4和IGFBP5基因在1日齡、15月齡和5歲齡牦牛肝組織中表達量，結(jié)果表明，IGFBP4和IGFBP5基因在肝組織中均呈時序表達，即5歲齡>15月齡>1日齡，具有極顯著差異(P<0.01，圖4A)。計算肝RNA-seq的FPKM值結(jié)果表明，肝RNA-Seq測序結(jié)果與qRT-PCR結(jié)果一致，表明qRT-PCR的表達結(jié)果可靠(圖4B)。

qRT-PCR檢測同一生長階段中IGFBP4和IGFBP5基因差異表達量結(jié)果表明，在1日齡、15月齡 和5歲齡牦牛肝中IGFBP4基因的表達量均極顯著高于IGFBP5基因的表達量，具有極顯著差異(P<0.01，圖4)。計算IGFBP4和IGFBP5基因在不同生長階段肝中表達量之間的皮爾遜相關(guān)性可知，其皮爾遜相關(guān)系數(shù)(r)為0.990，即兩基因間表達量呈顯著正相關(guān)(P<0.05)。綜上所述，IGFBP4和IGFBP5基因在肝臟組織中呈5歲齡>15月齡>1日齡的時序表達，且IGFBP4基因的表達量極顯著高于IGFBP5基因(P<0.01)。

不同大寫字母表示同一基因在不同生長階段之間的表達差異極顯著(P<0.01)；**表示同一生長階段不同基因之間的表達差異極顯著(P<0.01)，下同The different uppercase letters indicate that the expression difference between different growth stages in the same gene is extremely significant (P<0.01);Statistically expression significant differences between different genes at the same growth stage are indicated by double asterisks (P<0.01);The same as below圖4 IGFBP4和IGFBP5基因在不同生長階段牦牛肝組織中的表達Fig.4 The expression of IGFBP4 and IGFBP5 genes in liver at different growth stages of yak

2.5 Western blot檢測IGFBP4和IGFBP5蛋白在牦牛不同生長階段肝中的表達

Western blot檢測同一生長階段中IGFBP4和IGFBP5蛋白差異表達量結(jié)果表明，在1日齡、15月齡和5歲齡牦牛肝中IGFBP4蛋白的表達量均極顯著高于IGFBP5蛋白的表達量(P<0.01，圖5)。計算IGFBP4和IGFBP5蛋白在不同生長階段肝中表達量之間的皮爾遜相關(guān)性可知，其皮爾遜相關(guān)系數(shù)(r)為0.923，即兩蛋白間表達量呈顯著正相關(guān)(P<0.05)。綜上所述，IGFBP4和IGFBP5蛋白在肝組織中呈5歲齡>15月齡>1日齡的時序表達，且IGFBP4蛋白的表達量極顯著高于IGFBP5蛋白(P<0.01)。

圖5 牦牛IGFBP4和IGFBP5蛋白在不同生長階段牦牛肝組織中的表達Fig.5 The expression of IGFBP4 and IGFBP5 proteins in liver at different growth stages of yak

2.6 免疫組化檢測IGFBP4和IGFBP5蛋白在牦牛不同生長階段肝的定位及表達

采用免疫組化技術(shù)檢測IGFBP4和IGFBP5蛋白在不同生長階段牦牛肝中的細(xì)胞定位及表達情況。結(jié)果顯示，以棕黃色或黃色判定為陽性細(xì)胞，在1日齡、15月齡和5歲齡牦牛肝中IGFBP4和IGFBP5蛋白均有表達，主要在肝細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中表達(圖6A-I)。平均光密度值分析發(fā)現(xiàn)，IGFBP4和IGFBP5蛋白在肝組織中均呈時間序列表達，即5歲齡 >15月齡>1日齡，具有極顯著差異(P<0.01，圖6J)。同一生長階段中IGFBP4和IGFBP5蛋白差異表達量結(jié)果表明，在1日齡、15月齡和5歲齡 牦牛肝中IGFBP4蛋白的表達量均極顯著高于IGFBP5蛋白的表達量(P<0.01，圖6J)。計算IGFBP4和IGFBP5蛋白在不同生長階段肝中表達量之間的皮爾遜相關(guān)性可知，其皮爾遜相關(guān)系數(shù)(r)為0.946，即兩蛋白間表達量呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)。通過qRT-PCR、Western blot和免疫組化技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)，IGFBP4和IGFBP5的mRNA和蛋白水平在肝臟組織中均呈5歲齡>15月齡>1日齡的時序表達，且IGFBP4的表達量極顯著高于IGFBP5 (P<0.01)。

用0.01 mol·L-1 PBS代替一抗作陰性對照。KC.枯否細(xì)胞；HCs.肝細(xì)胞；L.淋巴細(xì)胞Negative control was conducted by replacing first antibody with 0.01 mol·L-1 PBS.KC.Kupffer cell;HCs.Hepatocytes;L.Lymphocyte圖6 IGFBP4和IGFBP5蛋白在不同生長階段牦牛肝組織中的定位及表達Fig.6 The expression and localization of IGFBP4 and IGFBP5 proteins in liver at different growth stages of yak

3 討 論

3.1 IGFBP4和IGFBP5基因結(jié)構(gòu)特點

本試驗成功克隆了牦牛IGFBP4和IGFBP5基因CDS序列。牦牛IGFBP4和IGFBP5基因CDS序列與黃牛(GenBank登錄號分別為：NP_776982.1、NP_001098797.1)相比，分別有第3、4位堿基發(fā)生突變，但僅分別導(dǎo)致第7位甲硫氨酸突變?yōu)槔i氨酸(7Met→Val)、第185位賴氨酸突變?yōu)楣劝彼?185Lys→GlT)，其他氨基酸發(fā)生同義突變。由此可推測，上述突變對IGFBP4和IGFBP5在牦牛的表達及其生長調(diào)控具有一定的影響。系統(tǒng)進化樹顯示，牦牛IGFBP4和IGFBP5蛋白序列與黃牛、水牛聚類最近，并且其基因序列均與黃牛、水牛的同源性最高，分析原因可能是三者均為牛屬，這表明IGFBP4和IGFBP5基因在牛屬動物物種之間親緣關(guān)系較近，在物種遺傳進化過程中具有高度保守性，提示不同物種的IGFBP4、IGFBP5基因在功能上可能具有相似性。IGFBPs蛋白一級結(jié)構(gòu)分為3個 明顯的區(qū)域：保守的N端區(qū)域、高變的中央?yún)^(qū)域和保守的C端區(qū)域，哺乳動物IGFBPs的N端和C端具有更高的同源性，這與IGF的高親和力有關(guān)[18]。本試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，牦牛IGFBP4和IGFBP5蛋白的N端和C端均為IGFBP超家族結(jié)構(gòu)域和TY超家族結(jié)構(gòu)域，具有高度同源性，這表明IGFBPs蛋白在動物進化過程中高度保守，具有高度同源性。IGFBP4和IGFBP5蛋白二級結(jié)構(gòu)主要由隨機卷曲和α-螺旋組成，在高級結(jié)構(gòu)中可形成螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋結(jié)構(gòu)，這有助于IGFBP4和IGFBP5在體內(nèi)循環(huán)系統(tǒng)中與IGFs相互結(jié)合，調(diào)控IGFs的半衰期，提高IGFs的生理活性，從而參與IGFs的生長發(fā)育調(diào)控作用[19]。

3.2 IGFBP4和IGFBP5基因組織表達譜

IGFBPs作為IGFs的高親和力結(jié)合伴侶，是IGFs作用的主要調(diào)節(jié)劑，主要在肝中合成，其親和力主要由磷酸化、糖基化和特異的蛋白水解控制，將特定殘基進行翻譯后修飾，具有促進有絲分裂、誘導(dǎo)細(xì)胞分化、調(diào)節(jié)生長等作用[20]。IGFBP4和IGFBP5基因的功能基本一致，主要表現(xiàn)在IGFs依賴作用。本試驗中，牦牛IGFBP4和IGFBP5基因在各組織中廣泛表達，且IGFBP4基因表達量在心、肝、脾、腎和小腸中均極顯著高于IGFBP5基因表達量(P<0.01)，推測牦牛IGFBPs基因可能以肝和局部組織共同分泌的方式作用于IGF的活性調(diào)節(jié)。IGFBP4通過降低結(jié)締組織生長因子和CXC趨化因子受體4的水平發(fā)揮抗纖維化活性，并具有抑制細(xì)胞增殖、促進軟骨表型表達和抑制肥大分化的作用[21-22]。IGFBP5可促進牙髓干細(xì)胞的血管生成和神經(jīng)源性分化潛能，并促進肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞的增殖、肌細(xì)胞內(nèi)脂肪的分解以及游離脂肪酸向胞外轉(zhuǎn)運[23-24]。IGFBP4在綿羊肝中的相對表達量最高[8]，與本試驗檢測IGFBP4基因在5歲齡牦牛肝組織中表達量最高結(jié)果一致，存在顯著性差異(P<0.01)。IGFBP5在絨山羊腎[25]、綿羊心[8]和草原紅牛脾[26]中的相對表達量最高。而本試驗結(jié)果中，IGFBP5在牦牛肝中的相對表達量最高，表明IGFBP5在不同物種中的相對表達量有所差異，可能由于IGFBP5在各組織中以不同的分泌(自分泌與旁分泌)形式產(chǎn)生所致。

3.3 IGFBP4和IGFBP5在不同生長階段肝中的表達

IGFBPs作為生長發(fā)育的關(guān)鍵作用因子，共同調(diào)控各個組織的生長與發(fā)育，從而促進動物機體的生長[27]。IGFBP4基因在牛卵泡發(fā)育過程中的表達量隨發(fā)育階段而增加，在卵母細(xì)胞中達峰值[28]；IGFBP5基因在藏豬脾、軍牧豬腎中的表達量隨年齡增加而增加，于180日齡達峰值[29]。以上結(jié)果表明，IGFBP4和IGFBP5基因的表達量呈時間表達規(guī)律，即隨年齡的增加而增加，與本試驗結(jié)果一致，qRT-PCR、Western blot和免疫組化結(jié)果顯示，IGFBP4 和IGFBP5的mRNA和蛋白水平在牦牛肝組織不同生長階段的表達隨時間變化表現(xiàn)為上升趨勢，在5歲齡時達到表達峰值，以協(xié)同方式共同調(diào)控牦牛各臟器的生長發(fā)育，這表明牦牛在成年期時其生長發(fā)育達到最佳狀態(tài)。

IGFBPs基因在組織中的表達存在一定的內(nèi)在關(guān)系，可以分析各基因在不同組織的表達對動物體生長發(fā)育的影響。肝組織作為IGFBPs蛋白分泌的主要器官，在mRNA水平的表達上表現(xiàn)為正向相關(guān)，正向協(xié)同調(diào)控各基因的表達與分泌，共同協(xié)同調(diào)控肝的生長發(fā)育[8]。IGFBP4和IGFBP5基因協(xié)同調(diào)控綿羊心、肝等組織的生長發(fā)育[8]與虹鱒魚卵母細(xì)胞的成熟[30]。以上研究表明IGFBP4和IGFBP5基因以協(xié)同方式共同調(diào)控組織生長發(fā)育，與本試驗結(jié)果一致，qRT-PCR、Western blot和免疫組化結(jié)果顯示IGFBP4和IGFBP5的mRNA和蛋白水平在牦牛不同生長階段的肝組織中共同正向協(xié)同表達，即IGFBP4和IGFBP5之間可能正向調(diào)控肝組織的生長與發(fā)育。這表明IGFBP4和IGFBP5在肝組織的不同生長階段相互協(xié)同調(diào)控mRNA與蛋白的表達。

4 結(jié) 論

綜上所述，本研究獲得了麥洼牦牛IGFBP4和IGFBP5基因的cDNA序列，并從mRNA和蛋白水平探討了IGFBP4和IGFBP5在麥洼牦牛不同生長階段肝中的表達規(guī)律。IGFBP4和IGFBP5在麥洼牦牛肝中的表達量與其年齡增長呈正相關(guān)，即5歲齡 >15月齡>1日齡，結(jié)果提示，IGFBP4和IGFBP5可能協(xié)同調(diào)控牦牛肝的生長發(fā)育，這為深入研究IGFBP4和IGFBP5對牦牛的生長發(fā)育，尤其是肝組織的發(fā)育機制提供了試驗依據(jù)。