楊彬 于晶 劉曉智 陳鐳

天津市第五中心醫(yī)院神經(jīng)外科（天津300450）

腦膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)原發(fā)腫瘤之一［1］，惡性膠質(zhì)瘤具有高度侵襲、增殖能力強(qiáng)的特點(diǎn)，常規(guī)手術(shù)加術(shù)后輔助放療能降低部分腦膠質(zhì)瘤復(fù)發(fā)率，提高生存率［2］，但仍有研究報(bào)道常規(guī)手術(shù)加外放療在原發(fā)灶周圍局部復(fù)發(fā)，導(dǎo)致放療失?。?］，提高膠質(zhì)瘤的放療敏感性是目前膠質(zhì)瘤治療研究的重點(diǎn)。miRNA 是一類長(zhǎng)度大約20～25 個(gè)核苷酸非編碼RNA［4］，通過(guò)與靶基因3′-UTR 結(jié)合調(diào)控多種疾病的發(fā)生發(fā)展［5］，多項(xiàng)研究證實(shí)miR-200家族成員影響腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展，本研究通過(guò)Real-time PCR 法檢測(cè)miR-200 家族成員中的miR-209、MEK/ERK 在膠質(zhì)瘤U87 細(xì)胞中的表達(dá)，研究miR-209 對(duì)膠質(zhì)瘤U87 細(xì)胞的增殖和放療敏感性的影響，初步探討miR-209 以及MEK/ERK 信號(hào)在膠質(zhì)瘤放療抵抗中的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象膠質(zhì)瘤U87 細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。

1.2 主要試劑與儀器熒光實(shí)時(shí)定量PCR 試劑盒（TaKaRa，日本），鼠抗人MEK/ERK 抗體（Abcam 公司，美國(guó)），LipofectamineTM2000（Invitrogen 公司，美國(guó)），DMEM 細(xì)胞培養(yǎng)基，青霉素/鏈霉素雙抗試劑，10%胎牛血清，0.25%胰蛋白酶、CCK-8 試劑盒均購(gòu)自自南京凱基生物公司，RIPA 蛋白裂解液（江蘇碧云天公司），miR-209、MEK、ERK、miR-209 mimics 引物序列由杭州四季青生物工程有限公司（表1）。

表1 目的基因引物序列Tab.1 Primer sequence of target gene

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 Real-time PCR 檢測(cè)放療后膠質(zhì)瘤U87 細(xì)胞中miR-209、MEK、ERK mRNA 的表達(dá)細(xì)胞培養(yǎng)：DMEM 完全培養(yǎng)基培養(yǎng)膠質(zhì)瘤U87 細(xì)胞，加10%胎牛血清、青霉素100 U/mL、鏈霉素100 mg/L，培養(yǎng)條件：5%CO2、溫度37 ℃，濕度為95%。收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的膠質(zhì)瘤U87 細(xì)胞，使用6MV X 線照射，照射劑量8 Gy，TRIzol法提取細(xì)胞內(nèi)總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板，miR-209、MEK、ERK引物序列為模板，反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸40 s，共40個(gè)循環(huán)，根據(jù)公式Folds=2-△△Ct來(lái)計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量，其中△△Ct=（Ct檢測(cè)基因-Ctβ-actin）實(shí)驗(yàn)組-（Ct檢測(cè)基因-Ctβ-actin）對(duì)照組。

1.3.2 轉(zhuǎn)染miR-209 對(duì)膠質(zhì)瘤U87 細(xì)胞增殖、放療敏感性的影響收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞，取miR-209 mimics 100 pmol 與Lipofectamine 10 μL充分混勻，室溫孵育1 h，放入培養(yǎng)箱中與膠質(zhì)瘤U87 細(xì)胞培養(yǎng)24 h，使用6MV X 線照射，照射劑量8 Gy，TRIzol 法提取細(xì)胞內(nèi)總RNA，Real-time PCR檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)miR-209、MEK、ERK mRNA的表達(dá)；另取上述細(xì)胞，RIPA 裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)p-MEK（抗體1∶100 稀釋）、p-ERK 蛋白（抗體1∶2 500 稀釋）的表達(dá)；CCK-8 法檢測(cè)miR-209 轉(zhuǎn)染對(duì)8 Gy 放療后膠質(zhì)瘤U87 細(xì)胞增殖的影響：另取轉(zhuǎn)染miR-209、放療后膠質(zhì)瘤U87 細(xì)胞，按照CCK-8 試劑盒說(shuō)明加入試劑，培養(yǎng)24、48 h 后在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀450 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定每孔光密度（OD）值；另取mimics control 作為陰性對(duì)照組，照射后膠質(zhì)瘤U87 細(xì)胞做空白對(duì)照組，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法采用SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料采用（）表示，兩組間數(shù)據(jù)分析采用t檢驗(yàn)；兩組以上數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 放療后膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞中miR-209、MEK、ERK mRNA 的表達(dá)放療后膠質(zhì)瘤U87 細(xì)胞中miR-209相對(duì)表達(dá)量為（0.09±0.02），低于放療前的（0.15±0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.491，P=0.037 4）。放療后膠質(zhì)瘤U87 細(xì)胞中MEK mRNA 相對(duì)表達(dá)量為（0.38±0.11），低于放療前的（0.45±0.14），但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t= 0.879，P= 0.405 0）。相比于放療前ERK mRNA 的相對(duì)表達(dá)（0.36±0.09），放療后ERK mRNA 相對(duì)表達(dá)量為（0.27±0.09），差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.581，P=0.152 5，圖1）。

圖1 放療后膠質(zhì)瘤U87 細(xì)胞中miR-209、MEK、ERK mRNA 的表達(dá)Fig.1 The expression of miR-209，MEK and ERK mRNA in glioma cell line U87 after radiotherapy

2.2 轉(zhuǎn)染miR-209 對(duì)膠質(zhì)瘤U87 細(xì)胞增殖、放療敏感性的影響miR-209 mimics 轉(zhuǎn)染U87 細(xì)胞后，miR-209相對(duì)表達(dá)高達(dá)（7.44±1.58），高于陰性對(duì)照組（0.10±0.03）和空白對(duì)照組（0.08±0.02），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=106.5，P＜0.000 1），表明miR-209已成功轉(zhuǎn)染至U87 細(xì)胞內(nèi)。miR-209 mimics 轉(zhuǎn)染后，MEK mRNA 表達(dá)減少至（0.11±0.05），與陰性對(duì)照組（0.40±0.18）和空白對(duì)照組（0.42 ± 0.15）差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=7.866，P=0.006 6），ERK mRNA表達(dá)減少，與其余兩組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F= 9.891，P= 0.002 9，圖2）。miR-209 mimics 轉(zhuǎn)染U87 細(xì)胞后，p-MEK、p-ERK 表達(dá)均低于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組（圖3）。miR-209 mimics 轉(zhuǎn)染24、48 h，細(xì)胞增殖受到抑制，與陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（F= 21.58，P＜0.000 1，圖4）。

圖2 miR-209 mimics 轉(zhuǎn)染膠質(zhì)瘤U87 細(xì)胞經(jīng)放療后miR-209、MEK、ERK mRNA 的表達(dá)Fig.2 The expression of miR-209，MEK and ERK mRNA in glioma cell line U87 transfected with miR-209 mimics after radiotherapy

圖3 miR-209 mimics 后膠質(zhì)瘤U87 細(xì)胞中miR-209、MEK、ERK 蛋白的表達(dá)Fig.3 The protein expression of MEK and ERK mRNA in glioma cell line U87 transfected with miR-209 mimics after radiotherapy

圖4 miR-209 mimics 抑制膠質(zhì)瘤U87 細(xì)胞增殖Fig.4 miR-209 mimics inhibit proliferation of glioma cell line U87

3 討論

膠質(zhì)瘤是神經(jīng)外科常見(jiàn)的腫瘤，其中膠質(zhì)母細(xì)胞瘤在WHO 的分級(jí)中屬于高級(jí)別膠質(zhì)瘤，具有高度增殖、侵襲的特點(diǎn)［6］，預(yù)期壽命不超過(guò)1年，5年生存率不足4%［7］。以手術(shù)為主、聯(lián)合放化療的綜合治療是目前膠質(zhì)瘤主要治療方法［8］，但大部分患者手術(shù)難以完整切除，加之血腦屏障阻礙使得抗膠質(zhì)瘤藥物在局部很難達(dá)到有效濃度［9］，而術(shù)后輔助放療可降低膠質(zhì)瘤的復(fù)發(fā)率，延長(zhǎng)生存期，是膠質(zhì)瘤患者術(shù)后重要治療手段［10］。隨著放療劑量的累積，膠質(zhì)瘤細(xì)胞出現(xiàn)損傷修復(fù)、細(xì)胞周期的再分布等原因使部分膠質(zhì)瘤患者出現(xiàn)放療抵抗現(xiàn)象［11］，因此放療耐受機(jī)制的研究是目前膠質(zhì)瘤高放療研究的重點(diǎn)。有研究發(fā)現(xiàn)多種基因、信號(hào)通路與放療抵抗密切相關(guān)［12］。

大量研究報(bào)道絲裂原細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（mitogen extracellular signal regulated kinases，MEK）和細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal regulated kinase，ERK）異?；罨龠M(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展，并與腫瘤化療耐藥、放療抵抗密切相關(guān)［13］。MEKERK 信號(hào)通路通過(guò)細(xì)胞表面受體信號(hào)傳導(dǎo)至細(xì)胞核內(nèi)，參與多種病理過(guò)程，受上游RAS 癌基因家族調(diào)控，Ras 被刺激因子激活后，生長(zhǎng)因子受體結(jié)合蛋白2（Grb2），作為接頭分子，與SOS（son of sevenless）的C 端富于脯氨酸的序列相互作用形成受體-Grb2-SOS 復(fù)合物，在Ras 附近形成高濃度的SOS，激活Ras，從而激活Ras-MEK-ERK 信號(hào)通路［14-15］。本研究發(fā)現(xiàn)，X 線照射膠質(zhì)瘤U87 細(xì)胞后，MEK、ERK mRNA 表達(dá)沒(méi)有明顯變化，表明放療并不能刺激Ras-MEK-ERK 信號(hào)通路，亦或是膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞凋亡與Ras-MEK-ERK 信號(hào)通路激活共同作用結(jié)果，但miR-209 表達(dá)減少，通過(guò)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染使膠質(zhì)瘤U87 細(xì)胞內(nèi)過(guò)表達(dá)miR-209 后，細(xì)胞的增殖明顯受到抑制，同時(shí)細(xì)胞內(nèi)MEK、ERK 的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)均明顯降低，表明miR-209 可能通過(guò)下調(diào)MEK-ERK信號(hào)通路增強(qiáng)膠質(zhì)瘤U87 細(xì)胞放療敏感性，本實(shí)驗(yàn)初步闡明腦膠質(zhì)瘤U87 細(xì)胞內(nèi)過(guò)表達(dá)miR-209對(duì)放療后細(xì)胞增殖的影響，表明微小microRNA 可能具有影響膠質(zhì)瘤的放療敏感性的作用，但其具體機(jī)制仍待進(jìn)一步研究探索，本研究為后續(xù)腦膠質(zhì)瘤的后續(xù)臨床研究提供理論基礎(chǔ)。

綜上所述，miR-209 通過(guò)下調(diào)膠質(zhì)瘤U87 細(xì)胞中MEK-ERK 的表達(dá)，能抑制細(xì)胞增殖，增強(qiáng)放療敏感性，為膠質(zhì)瘤放療抵抗的機(jī)制研究提供新方向，同時(shí)為膠質(zhì)瘤的綜合治療提供新的理論依據(jù)。