毛 婷，祁宏山，季 彬,，鄭 群，郭 琪，穆永松，毛雪琴，王治業(yè),

（1.甘肅省科學(xué)院生物研究所，甘肅省微生物資源開(kāi)發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州 730000；2.甘肅華瑞農(nóng)業(yè)股份有限公司，甘肅張掖 734500；3.青海金祁連乳液股份有限公司，青海祁連 810400）

2009 年，我國(guó)正式推出《奶酒》的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 23546-2009[1]，乳清酒屬于奶酒中的一種，是指以乳清液、乳清粉等為主要原料，經(jīng)發(fā)酵等工藝釀制而成的飲料酒。我國(guó)大多數(shù)奶酪企業(yè)產(chǎn)量小，乳清的排放量不是很多，但將乳清直接排放會(huì)造成資源的浪費(fèi)及環(huán)境的污染，利用乳清液提取乳清粉、乳清蛋白或乳糖所需要的設(shè)備技術(shù)成本較高，而且利用的并不是全部的乳清成分。乳清中約含水95%，乳糖3%～4%，乳清蛋白0.3%～0.7%，乳酸1%，檸檬酸<0.2%，除此之外還含有多種維生素和礦物質(zhì)及微量元素[2?4]，利用乳清發(fā)酵制成酒可完全利用乳清中的營(yíng)養(yǎng)成分，減少資源的浪費(fèi)。牦牛是我國(guó)青藏高原牧區(qū)特色牲畜之一，牦牛乳與其他普通牛乳相比，β-乳球蛋白、血清白蛋白及礦物質(zhì)含量都較高，是營(yíng)養(yǎng)價(jià)值極高且稀缺的國(guó)內(nèi)高端乳源[5]，而牦牛乳清中營(yíng)養(yǎng)成分也高于其他普通乳清，利用牦牛乳清發(fā)酵制備，可獲得營(yíng)養(yǎng)豐富的牦牛乳清酒。

傳統(tǒng)的奶酒生產(chǎn)都是采用“先乳酸發(fā)酵后酒精發(fā)酵”工藝制備低度數(shù)乳清酒[6]，利用乳酸菌分解乳糖產(chǎn)生乳酸，但發(fā)酵過(guò)程中乳糖利用不足會(huì)造成酒液度數(shù)偏低，發(fā)酵遲緩現(xiàn)象，因此傳統(tǒng)的生產(chǎn)工藝很難生產(chǎn)出質(zhì)量穩(wěn)定的高品質(zhì)奶酒[7?9]。制備≥10%Vol高度數(shù)的乳清酒，一種是采用蒸餾工藝制備成蒸餾型奶酒。Dagone等[10]利用乳酸克魯維酵母連續(xù)發(fā)酵并采用蒸餾工藝，最終得到酒精度為35.4%Vol的蒸餾型乳清酒，但通過(guò)蒸餾后乳清中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)部分流失。另一種是將乳清液與其他功能性含糖高物質(zhì)混合發(fā)酵，提高發(fā)酵液中可發(fā)酵性糖含量。孫子羽等[11]通過(guò)在乳清液中添加黑枸杞，提高發(fā)酵液中可發(fā)酵性糖含量獲得酒精度為12.3%Vol的黑枸杞乳清酒，但增加了黑枸杞汁制備工藝，工藝復(fù)雜，生產(chǎn)成本較高。

乳酸克魯維酵母在好氧條件下可以充分利用乳糖產(chǎn)生酒精并散發(fā)水果的香味賦予酒體豐富的氣味，但菌株耐酒精能力弱；釀酒酵母可以利用葡萄糖、蔗糖等發(fā)酵糖生產(chǎn)酒精但不能利用乳糖產(chǎn)酒精。因此，本試驗(yàn)采用乳酸克魯維酵母及釀酒酵母進(jìn)行兩段式發(fā)酵并采用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)建立數(shù)學(xué)模型，確定了一種發(fā)酵型牦牛乳清酒的工藝方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

牦牛乳清液 青海金祁連乳液有限公司；乳酸克魯維酵母（CICC 1772）工業(yè)微生物菌種保藏中心；釀酒酵母（GSCII 32168）甘肅省工業(yè)微生物菌種保藏中心；麥芽粉 蘭州黃河麥芽有限公司；三乙胺 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；正己烷 上海佰曄生物科技中心；斐林試劑 南京化學(xué)試劑股份有限公司；葡萄糖 上海萌椏生物科技有限公司；甲醛溶液 上?？ㄟ~舒生物科技有限公司。

ULTIMATE高效液相分析儀 美國(guó)賽默飛有限公司；HE-WD-300 干燥箱 廣州澳德瑪電子科技有限公司；SKY-100C恒溫?fù)u床 上海蘇坤實(shí)業(yè)有限公司；UV-6100S紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海美譜達(dá)儀器有限公司；MJ-150Ⅱ培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司；DARO反滲透儀 西安迪奧環(huán)?？萍加邢薰?；ZRN-PH-D型臺(tái)式pH計(jì) 北京中瑞能儀表技術(shù)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件 麥芽汁培養(yǎng)基：干麥芽粉與水按照質(zhì)量比1:4 在50～60 ℃水浴鍋中糖化3～4 h后煮沸，將煮沸的糖化液用4 層紗布過(guò)濾，取上清液121 ℃滅菌20 min后待用[12]。乳酸克魯維酵母種子液：在無(wú)菌條件下將乳酸克魯維酵母菌株以4%接種量接種于麥芽汁培養(yǎng)基，在28 ℃，200 r/min條件下培養(yǎng)18 h。釀酒酵母種子液：在無(wú)菌條件下將釀酒酵母菌株以4%接種量接種于麥芽汁培養(yǎng)基，在28 ℃，200 r/min條件培養(yǎng)下24 h。

1.2.2 工藝流程 牦牛乳清液→濃縮→接種（乳酸克魯維酵母）→發(fā)酵→成分調(diào)整合并→接種（釀酒酵母）→發(fā)酵→過(guò)濾→冷卻→包裝→成品。

1.2.3 乳清液的濃縮 乳清液中乳糖含量為3.5%～4.5%，傳統(tǒng)的濃縮和分離手段能耗太大，因此采用反滲透分離技術(shù)可以有效分離濃縮低濃度溶液。本研究采用芳香聚酰胺卷式反滲透膜、壓力為0.5 MPa、溫度為40 ℃進(jìn)行乳清液的濃縮[13]以提高牦牛乳清中固形物的含量。檢測(cè)不同濃縮倍數(shù)下乳清液中的乳糖含量及乳清濁度，確定乳清濃縮倍數(shù)。

1.2.4 發(fā)酵工藝條件優(yōu)化

1.2.4.1 乳酸克魯維酵母發(fā)酵 在濃縮后的乳清液中接入4%活化后的乳酸克魯維酵母種子液，在30 ℃，200 r/min條件下培養(yǎng)，每隔6 h取樣檢測(cè)乳糖含量，當(dāng)乳糖濃度≤1%時(shí)停止發(fā)酵，確定乳酸克魯維酵母發(fā)酵時(shí)間，靜置并排除酵母獲得上清醪液待用。

1.2.4.2 釀酒酵母發(fā)酵 用0.1 mol/L NaOH溶液調(diào)整上述醪液pH，加入30%食品級(jí)白砂糖，同時(shí)接入活化后的釀酒酵母種子液，在200 r/min條件下培養(yǎng)24 h后靜置培養(yǎng)，當(dāng)發(fā)酵液中酒精度不再變化時(shí)可以判斷為發(fā)酵結(jié)束，排除酵母，采用硅藻土過(guò)濾后降溫至0 ℃保藏2 d，罐裝后采用巴氏滅菌法在60 ℃滅菌30 min，即可得到成品牦牛乳清酒。在總接種量為5%，初始pH6.0，發(fā)酵時(shí)間24 h條件下研究不同發(fā)酵溫度（16、20、25、30、35、37、42 ℃）對(duì)釀酒酵母酒精度的影響確定最佳發(fā)酵溫度，依次研究不同總接種量（5%、7%、9%、11%、13%、15%、17%）、初始pH（4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7、7.5）、發(fā)酵時(shí)間（12、24、48、72、96、120、144 h）對(duì)釀酒酵母酒精度的影響。在單因素優(yōu)化的基礎(chǔ)上以醪液酒精度（Y）為評(píng)價(jià)指標(biāo)，分別選取發(fā)酵溫度（A）、總接種量（B）、發(fā)酵時(shí)間（C）及初始pH（D）為考察因素，根據(jù)Box-Behnken進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，將所得試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Design-Expert軟件進(jìn)行多元回歸擬合分析，變量的編碼和水平如表1 所示。其中發(fā)酵時(shí)間為接入釀酒酵母24 h后靜置培養(yǎng)的時(shí)間，接種量為乳酸克魯維酵母和釀酒酵母的總接種量（乳酸克魯維酵母接種量4%）。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)的因素和水平設(shè)計(jì)Table 1 Factors and levels design of response surface test

1.2.5 理化指標(biāo)檢測(cè) 總糖、酒精度、氨基氮、總酸的檢測(cè)參照《奶酒》標(biāo)準(zhǔn)GB/T 23546-2009[14]。乳糖含量的檢測(cè)參照《嬰幼兒食品和乳品中乳糖、蔗糖的測(cè)定》標(biāo)準(zhǔn)GB/T 5412.5-2010[15]。乳糖利用率（%）=（發(fā)酵前乳糖含量-發(fā)酵液中乳糖含量）/發(fā)酵前乳糖含量×100。酵母細(xì)胞數(shù)測(cè)定采用血球計(jì)數(shù)板法[16]。濁度的檢測(cè)采用分光光度法，以福爾馬肼標(biāo)準(zhǔn)溶液制備標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，與波長(zhǎng)630 nm檢測(cè)[17]。

牦牛乳清液及乳清酒中氨基酸、有機(jī)酸的檢測(cè)采用高效液相色譜法[18]。氨基酸檢測(cè)色譜柱：C18SHISEIDO（4.6 mm×250 mm×5 μm）；進(jìn)樣量10 μL；柱溫40 ℃；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm。有機(jī)酸的檢測(cè)色譜柱：Agilent AQ（4.6 mm×250 mm×5 μm）；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μL；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm。

1.2.6 品評(píng)分析 根據(jù)GB/T 10220-2012《感官分析方法學(xué)總論》建立感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[19]，滿(mǎn)分100 分；從產(chǎn)品色澤、風(fēng)味、口感進(jìn)行牦牛乳清酒的品評(píng)。挑選20 名具有一定經(jīng)驗(yàn)的專(zhuān)業(yè)人士組成評(píng)定小組，進(jìn)行打分，取其平均值作為總感官評(píng)分。具體評(píng)分細(xì)則見(jiàn)表2。

表2 牦牛乳清酒感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)（分）Table 2 Yak whey wine sensory evaluation standard（score）

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均進(jìn)行三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，采用SPSS17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)顯著性分析，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，標(biāo)記小寫(xiě)字母不同者表示差異顯著(P<0.05)，字母相同或部分相同或未標(biāo)記者表示差異不顯著(P>0.05)，應(yīng)用Origin 7.0 軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析和作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳清液的濃縮倍數(shù)

不同濃縮倍數(shù)下濃縮液中乳糖含量及濁度變化如圖1 所示。從圖1 中可以看出，濃縮液中乳糖含量隨濃縮倍數(shù)的增加而增加，而滲析液中乳糖濃度在不同濃縮倍數(shù)下無(wú)明顯減少，這說(shuō)明在不同的濃縮倍數(shù)下，乳糖都沒(méi)有滲透過(guò)去；不同濃縮倍數(shù)下濃縮液乳糖含量及濁度都存在顯著性差異（P<0.05）；濃縮大于2 倍時(shí)，濃縮液濁度呈明顯上升趨勢(shì)；濃縮倍數(shù)為2 倍時(shí)，牦牛乳清中乳糖含量可達(dá)到12.3%，濁度為555 NTU。因此，選取濃縮2 倍的牦牛乳清液，靜置冷卻后用200 目無(wú)菌濾布過(guò)濾，冷卻后備用。

圖1 不同濃縮倍數(shù)下乳清中乳糖含量及濁度變化Fig.1 Lactose content and turbidity changes of whey at different concentration times

2.2 牦牛乳清酒發(fā)酵工藝條件優(yōu)化

2.2.1 乳酸克魯維酵母發(fā)酵 發(fā)酵時(shí)間對(duì)乳糖濃度及酒精度的影響結(jié)果如圖2 所示。從圖2 中可以看出，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，乳糖含量降低，酒精度含量升高；發(fā)酵0 h與6 h乳糖含量無(wú)顯著差異（P>0.05）；6 h后乳糖含量隨發(fā)酵時(shí)間顯著降低（P<0.05）；54 h后乳糖含量及酒精度與60 h無(wú)顯著性差異（P>0.05）。利用乳酸克魯維酵母發(fā)酵乳清液產(chǎn)生酒精，54 h后醪液中乳糖含量為0.8%，醪液酒精度為3.5%Vol，計(jì)算醪液中乳糖的利用率可達(dá)到92.7%，靜置排出酵母獲得上清醪液備用，確定乳酸克魯維酵母發(fā)酵時(shí)間為54 h。

圖2 發(fā)酵時(shí)間對(duì)乳糖含量及酒精度的影響Fig.2 Effects of fermentation time on lactose content and alcohol content

2.2.2 單因素實(shí)驗(yàn) 發(fā)酵溫度、總接種量、初始pH及發(fā)酵時(shí)間對(duì)醪液酒精度的影響如圖3 所示，從圖3 中可以看出，15～30 ℃時(shí)，酒精度隨發(fā)酵溫度的升高而升高，發(fā)酵溫度高于30 ℃時(shí)，酒精度呈下降趨勢(shì)，分析原因?yàn)樵谳^高發(fā)酵溫度的條件下，酵母菌的生長(zhǎng)受到限制，菌株利用糖類(lèi)生產(chǎn)乙醇能力降低，另外高溫發(fā)酵易出現(xiàn)菌體自溶現(xiàn)象，從而導(dǎo)致產(chǎn)品風(fēng)味變化[20]；在低溫條件下發(fā)酵雖然有利于產(chǎn)生豐富風(fēng)味物質(zhì)，但隨著醪液酒精度逐漸升高，菌種的生長(zhǎng)進(jìn)程緩慢，發(fā)酵時(shí)間較長(zhǎng)[9]。酒精度隨接種量的增加而增加，接種量高于8%時(shí)，酒精度呈下降趨勢(shì)。接種量過(guò)低，菌種增長(zhǎng)緩慢，發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)；接種量過(guò)高，在主發(fā)酵階段酵母菌生長(zhǎng)過(guò)快、過(guò)密，會(huì)因過(guò)多地利用糖類(lèi)物質(zhì)生長(zhǎng)而導(dǎo)致后發(fā)酵階段各種有益風(fēng)味物質(zhì)積累不足，并且較高的接種量又會(huì)出現(xiàn)大量的酵母菌早衰而導(dǎo)致菌體自溶現(xiàn)象，影響產(chǎn)品的風(fēng)味品質(zhì)[21]。酒精度對(duì)初始pH變化較為敏感，初始pH在5.5～6.5 范圍內(nèi)，添加量過(guò)多或過(guò)少均會(huì)影響酒精度的大?。怀跏紁H為6 時(shí)，酒精度最高達(dá)到13.2%Vol，較高的pH條件不利于酵母菌的生長(zhǎng)，從而影響酵母菌產(chǎn)酒精能力[22]。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，酒精度逐漸升高，發(fā)酵72 h后酒精度不再升高，影響發(fā)酵時(shí)間的因素除了發(fā)酵液中可發(fā)酵性糖含量，酵母菌株的酒精耐受力也是關(guān)鍵的一個(gè)因素，一般酵母菌在酒精度>15%的環(huán)境內(nèi)無(wú)法生存，隨著發(fā)酵過(guò)程中酒精度的升高，酵母菌的發(fā)酵性能逐漸降低也會(huì)造成發(fā)酵的結(jié)束[20]。綜合考慮，選擇發(fā)酵溫度為30 ℃，總接種量為8%，發(fā)酵時(shí)間為72 h，初始pH為6.0。

圖3 四種不同因素對(duì)酒精度的影響Fig.3 Effects of four different factors on alcohol content

2.2.3 釀酒酵母Box–Behnken響應(yīng)面優(yōu)化 在單因素優(yōu)化的基礎(chǔ)上以醪液酒精度（Y）為評(píng)價(jià)指標(biāo)，以發(fā)酵溫度（A）、總接種量（B）、發(fā)酵時(shí)間（C）及初始pH（D）為考察因素，將所得試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Design-Expert V8.0.6 軟件進(jìn)行多元回歸擬合。Box–Behnken設(shè)計(jì)處理選項(xiàng)及結(jié)果如表3 所示，酒精度（Y）的二次多項(xiàng)回歸方程為：Y=14.08+0.67A?0.43B?0.40C?0.58D+0.05AB+0.12AC+0.00AD?0.42BC+0.01BD+0.15CD?1.18A2?2.60B2?1.67C2?0.52D2。酒精度的回歸模型及方差分析如表4 所示。由表4可知：模型F值為12.14，P值<0.01，表明響應(yīng)面回歸模型達(dá)到了極顯著水平。失擬項(xiàng)F值3.38，P值>0.05，失擬項(xiàng)不顯著，說(shuō)明模型與試驗(yàn)數(shù)據(jù)之間擬合度好，可用此模型預(yù)測(cè)酒精度的情況。模型的確定系數(shù)R2=0.9239，說(shuō)明該回歸模型能解釋92.39%響應(yīng)值的變化。由回歸模型和方差分析可知，方程一次項(xiàng)A、D，方程二次項(xiàng)A2、B2、C2對(duì)酒精度的影響達(dá)到極顯著水平（P<0.01）；方程一次項(xiàng)B、C對(duì)酒精度影響達(dá)到顯著水平（P<0.05），交互項(xiàng)AB、AC、AD、BC、BD、CD、D2對(duì)酒精度的影響不顯著（P>0.05）。根據(jù)F值大小可以判斷出各個(gè)因素對(duì)酒精度的影響的主次順序?yàn)椋喊l(fā)酵溫度>初始pH>總接種量>發(fā)酵時(shí)間。

表3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Design and results of response surface experimental

表4 酒精度的回歸模型和方差分析Table 4 Regression model and variance analysis of alcohol content

各因素的交互作用對(duì)醪液酒精度影響的等高線(xiàn)圖和響應(yīng)曲面如圖4 所示，能比較直觀(guān)地解釋各個(gè)變量和變量之間對(duì)響應(yīng)值的影響。根據(jù)Design-Expert軟件對(duì)建立的回歸方程進(jìn)行參數(shù)優(yōu)化分析，可以得出在發(fā)酵溫度、接種量、發(fā)酵時(shí)間、初始pH在理論上分別取31.4 ℃、7.8%、69.0 h、5.70 時(shí)，可得理論上的最大酒精度為14.4%Vol。結(jié)合實(shí)際操作條件修正發(fā)酵溫度30 ℃、接種量8%、發(fā)酵時(shí)間70 h、初始pH為5.5 進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。

圖4 四因素交互作用對(duì)酒精度的等高線(xiàn)圖和響應(yīng)面圖Fig.4 Contour plots and response surface diagram of interaction of four factors on alcohol content

2.2.4 驗(yàn)證試驗(yàn) 在濃縮2 倍乳清液中按照4%接種量接入活化后的乳酸克魯維酵母種子液，在30 ℃，200 r/min條件下培養(yǎng)54 h后靜置排出酵母獲得上清醪液。用0.1 mol/L NaOH溶液調(diào)整上清醪液至pH5.5，同時(shí)加入30%食品級(jí)白砂糖，接入4%活化后的釀酒酵母種子液（總接種量8%），在200 r/min、30 ℃條件下發(fā)酵24 h，檢測(cè)酵母數(shù)為1.3 億個(gè)/mL，30 ℃靜置培養(yǎng)70 h后，檢測(cè)醪液酒精度為14.1%Vol。由此可見(jiàn)，真實(shí)值與回歸方程所預(yù)測(cè)值14.4%Vol相差不大，說(shuō)明響應(yīng)面優(yōu)化的研究是合理可行的。將醪液采用硅藻土過(guò)濾后降溫至0 ℃保藏2 d，罐裝后采用巴氏滅菌法在60 ℃滅菌30 min，即可得到成品牦牛乳清酒。

2.3 牦牛乳清酒理化指標(biāo)檢測(cè)

檢測(cè)牦牛乳清酒成品中的總糖、酒精度、氨基氮、總酸含量，如表5 所示。從表5 中可以看出，牦牛乳清酒成品酒中各項(xiàng)指標(biāo)都符合國(guó)家成品奶酒的標(biāo)準(zhǔn)[23]?？偺堑暮康亩嗌偈桥袛喟l(fā)酵是否徹底完成的主要指標(biāo)，也是影響醪液酸甜度的重要因素，根據(jù)總糖含量的多少，可以將酒液分為干型、半干型、半甜型及甜型[24]。牦牛乳清酒中總糖含量為63.3 g/L，在40～70 范圍內(nèi)，屬于半甜型奶酒。氨基酸態(tài)氮是指以氨基酸形式存在的氮元素的總量，在各類(lèi)食品中都規(guī)定了氨基酸態(tài)氮含量，氨基酸態(tài)氮含量越高，說(shuō)明氨基酸含量越高，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值越高[21]。牦牛乳清酒中氨基酸態(tài)氮為0.09 g/L，明顯高于標(biāo)準(zhǔn)中的0.05 g/L，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高。總酸含量是影響酒液口感的重要因素，總酸含量過(guò)高或過(guò)低，會(huì)造成酸甜度不協(xié)調(diào)，牦牛乳清酒中總酸含量為5.2 g/L，酸度適中。牦牛乳清酒中酒精度為14.1%Vol≤18%Vol，符合發(fā)酵型奶酒酒精度的標(biāo)準(zhǔn)。牦牛乳清酒經(jīng)過(guò)兩段式發(fā)酵工藝，在未經(jīng)過(guò)蒸餾工藝條件下，乳糖被充分利用，酒精度達(dá)到較高值。

表5 牦牛乳清酒的感官及理化指標(biāo)Table 5 Sensory and physicochemical indexes of yak whey wine

2.4 牦牛乳清酒中氨基酸、有機(jī)酸的含量及品評(píng)分析

乳清蛋白含有人體必需的8 種氨基酸，且配比接近人體需求比例，被稱(chēng)為蛋白之王，是公認(rèn)的優(yōu)質(zhì)蛋白補(bǔ)充劑之一[25?26]。乳清液經(jīng)發(fā)酵后，將蛋白分解為肽類(lèi)及氨基酸物質(zhì)，提高了產(chǎn)品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，另外經(jīng)酵母菌發(fā)酵，可將乳清液中乳糖轉(zhuǎn)化為乙醇，增加了產(chǎn)品的生物活性及適口性。牦牛乳清液及乳清酒的18 種氨基酸和9 種有機(jī)酸含量如表6 所示。從表6 中可以看出，胱氨酸具有解毒促進(jìn)細(xì)胞氧化還原作用，但在牦牛乳清液及乳清酒中都未檢出；牦牛乳清液經(jīng)過(guò)發(fā)酵，除了蛋氨酸和色氨酸沒(méi)有明顯的增加外，其余15 種氨基酸含量與發(fā)酵前相比都有顯著性增加（P<0.05）；賴(lài)氨酸具有促進(jìn)人體發(fā)育、增加免疫，提高中樞神經(jīng)組織功效，牦牛乳清酒中賴(lài)氨酸含量為401.6 mg/L，與乳清液相比提高了0.5 倍；谷氨酸是身體氧化防御機(jī)制的重要物質(zhì)，牦牛乳清酒中谷氨酸含量為969.6 mg/L，與乳清液相比提高了1.6倍；支鏈氨基酸可以促進(jìn)胰島素及生長(zhǎng)激素的釋放，牦牛乳清酒中三種支鏈氨基酸亮氨酸、纈氨酸和異亮氨酸分別為286.7、330.6、325.5 mg/L，總支鏈氨基酸與乳清液相比提高了0.8 倍；牦牛乳清酒與乳清液相比18 種總氨基酸含量提高了1.1 倍，8 種必需氨基酸含量提高了0.7 倍。

有機(jī)酸可以促進(jìn)食欲、幫助消化，其種類(lèi)和含量的多少對(duì)于產(chǎn)品品質(zhì)和風(fēng)味有著密切關(guān)系[27]。從表6 中可看出，蘋(píng)果酸、馬來(lái)酸及酒石酸在牦牛乳清液及乳清酒中都未檢出；發(fā)酵前后乳酸含量存在顯著性差異（P<0.05），而富馬酸含量無(wú)顯著性差異（P>0.05）；檸檬酸作為一種酸性調(diào)味劑，具有增強(qiáng)食欲及促進(jìn)鈣、磷物質(zhì)的消化吸收作用；琥珀酸別名丁二酸，可產(chǎn)生酸味、呈味，在食品中可用于調(diào)味劑、酸度劑及防腐劑，還可以用于合成抗生素及維生素A、維生素B等[28]，在牦牛乳清酒中檸檬酸、琥珀酸含量分別為1529.3、3826.9 mg/L，而在乳清液未檢出這兩種有機(jī)酸，說(shuō)明發(fā)酵豐富了乳清液的某些有機(jī)酸含量。

表6 乳清液及牦牛乳清酒中氨基酸和有機(jī)酸含量Table 6 Amino acid and organic acid content in whey and yak whey wine

由20 名專(zhuān)業(yè)人員進(jìn)行牦牛乳清酒品評(píng)結(jié)果如表7 所示。從表7 可以看出，產(chǎn)品色澤呈均勻一致的淡黃色，平均得分為8 分；酒液組織均勻無(wú)分層，清澈透明，平均得分為9 分；酒液具有明顯的發(fā)酵乳奶香味，平均得分為32 分；酒液酸甜適中，口感純正柔和，平均得分為42 分。經(jīng)過(guò)計(jì)算，牦牛乳清酒平均總得分為91 分，色澤、透明度、香氣及口感都符合標(biāo)準(zhǔn)，得分較高，酒液無(wú)明顯的缺陷。

表7 牦牛乳清酒的品評(píng)分析結(jié)果（分）Table 7 Evaluation and analysis of yak whey wine（score）

3 結(jié)論

牦牛奶是我國(guó)青藏高原地區(qū)獨(dú)特的奶制品，以牦牛奶為原料生產(chǎn)制備奶酪得到的副產(chǎn)物牦牛乳清液與其他奶制品乳清相比營(yíng)養(yǎng)價(jià)值更為豐富[7]。試驗(yàn)利用乳酸克魯維酵母充分利用乳清中的乳糖生產(chǎn)酒精并產(chǎn)生大量有機(jī)酸性酯類(lèi)物質(zhì)，賦予酒體豐富的風(fēng)味物質(zhì)，再利用耐酒精釀酒酵母提高醪液酒精度。通過(guò)兩段式乳酸克魯維酵母發(fā)酵54 h后，醪液中乳糖含量為0.8%，利用率達(dá)到92.7%，減少了可發(fā)酵性糖添加量，降低了生產(chǎn)成本；采用響應(yīng)面優(yōu)化釀酒酵母在30 ℃、總接種量8%（乳酸克魯維酵母4%）、發(fā)酵時(shí)間70 h、初始pH5.5 條件下，可獲得酒精度為14.1%Vol的發(fā)酵型牦牛乳清酒。牦牛乳清液經(jīng)發(fā)酵獲得的乳清酒各項(xiàng)理化指標(biāo)都符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，總糖含量63.3 g/L，酒精度14.1%Vol，氨基酸態(tài)氮0.09 g/L，總酸5.2 g/L，屬于一種半甜型奶酒。牦牛乳清酒經(jīng)過(guò)專(zhuān)業(yè)人員品評(píng)分析，色澤微黃、清澈透明、奶香與酒香和諧、酒體豐滿(mǎn)，酒液無(wú)明顯的缺陷，滿(mǎn)分100 分，平均總得分為91 分。經(jīng)過(guò)發(fā)酵牦牛乳清液中氨基酸及有機(jī)酸含量都有所提高；部分有益氨基酸、有機(jī)酸顯含量明顯提高；其中必需氨基酸、總氨基酸及有機(jī)酸含量分別提高了0.7、1.1、0.8 倍，豐富了乳清液的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，具有推廣應(yīng)用的價(jià)值。