王 娟，肖亞軍，劉榮雁，劉艷群

（綿陽市第三人民醫(yī)院，四川 綿陽 621000）

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmoriary disease，COPD）是臨床上常見的一種致死性疾病。有研究指出，預(yù)計(jì)到2030 年此病將成為全球第三大致死性疾病[1]。吸煙被認(rèn)為是誘發(fā)COPD 的主要因素[2]。吸入香煙煙霧是慢性肺病發(fā)生發(fā)展的主要驅(qū)動因素，吸煙產(chǎn)生的氣體混合物由約4500 種有害成分（包括尼古丁、一氧化碳、氰化物、甲醛、可吸入顆粒物等）組成[3]。肺臟長期接觸這些有害物質(zhì)會引發(fā)多種疾病，其中包括COPD 和肺癌[4]。柚皮苷主要存在于柑橘類水果中，是一種天然的二氫類黃酮，具有抗氧化、抗微生物、抗癌和抗炎等多種作用[5-6]。有研究發(fā)現(xiàn)，具有強(qiáng)大抗炎、抗氧化作用的柚皮素可用于治療支氣管損傷及炎癥反應(yīng)。相關(guān)的研究表明，柚皮素可通過激活Nrf2 通路治療百草枯誘導(dǎo)的人支氣管上皮細(xì)胞BEAS-2B病變[7]。在本文中，筆者主要是探討柚皮素對COPD 大鼠模型肺功能的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

雄性SD 大鼠，體重220±20 g，由成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動物有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（川）2020-030，實(shí)驗(yàn)動物使用許可證號：SYXK（川）2019-189。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

柚皮素（Naringenin），購自西安匯林生物科技有限公司；脂多糖，購自索萊寶科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

BW-YLS-8A 多功能誘咳引喘儀（上海軟隆科技發(fā)展有限公司生產(chǎn)）；SAR-1000 多功能小動物呼吸功能測定儀（上海玉研科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)）；RM2016 轉(zhuǎn)輪式切片機(jī)（德國徠卡公司生產(chǎn)）；PHY-Ⅲ型病理組織漂烘儀（常州市中威電子儀器有限公司生產(chǎn)）；DxH800 血液分析儀〔貝克曼庫爾特商貿(mào)（中國）有限公司生產(chǎn)〕。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 分組、造模及給藥 取40 只SD 大鼠分為空白組、模型組、柚皮素低劑量組和柚皮素高劑量組，每組10 只大鼠。對除空白組大鼠外的其余各組大鼠均進(jìn)行COPD 造模。具體的造模方法是：對大鼠進(jìn)行為期1 周的適應(yīng)性喂養(yǎng)后，開始對其進(jìn)行造模。在進(jìn)行造模的第1 d 和第14 d，為其在氣管內(nèi)滴注脂多糖，每次滴注1 mg/kg。分別于進(jìn)行造模的第2 d ～第13 d、第15 d ～第28 d，對其進(jìn)行香煙煙霧暴露處理。每日在同一時(shí)間將大鼠置于煙霧箱內(nèi)進(jìn)行2 次香煙煙霧暴露，每次點(diǎn)燃10 支香煙，每次暴露0.5 h。具體的暴露方法是：將點(diǎn)燃的香煙懸掛于煙霧箱內(nèi)，然后將大鼠置入煙霧箱。從首次滴注脂多糖后第1 天開始，為柚皮素低劑量組大鼠使用低劑量的柚皮素進(jìn)行灌胃（每次20 mg/kg，每天1 次），為柚皮素高劑量組大鼠使用高劑量的柚皮素進(jìn)行灌胃（每次40 mg/kg，每天1 次），為空白組大鼠與模型組大鼠使用等量的生理鹽水進(jìn)行灌胃，各組大鼠均持續(xù)灌胃28 d。

1.4.2 檢測呼吸功能指標(biāo) 在末次給藥24 h 后，使用4% 的戊巴比妥鈉對各組大鼠進(jìn)行麻醉，使用小動物呼吸功能測定儀檢測其第一秒用力呼氣量（forced expiratory volume in one second，F(xiàn)EV1）、呼吸峰值流量（peak expiratory flow，PEF）和用力肺活量（forced vital capacity, FVC）。

1.4.3 肺泡灌洗液細(xì)胞分類計(jì)數(shù) 末次給藥24 h 后處死各組大鼠，收集其肺泡灌洗液，使用分析儀進(jìn)行細(xì)胞分類計(jì)數(shù)，檢測肺泡灌洗液中中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞與淋巴細(xì)胞的數(shù)量。

1.4.4 病理學(xué)觀察 采集各組大鼠的肺臟樣本，將其置于4%的多聚甲醇中固定24 h，然后進(jìn)行脫水，并制作石蠟切片。使用蘇木精- 伊紅對切片進(jìn)行染色后，在顯微鏡下觀察其中肺臟組織的病理改變。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS 25.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料用百分比（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠呼吸功能指標(biāo)的比較

對各組大鼠進(jìn)行呼吸功能檢測后發(fā)現(xiàn)，與空白組大鼠相比，模型組大鼠的FVC、FEV1、PEF 均較低，P＜0.05；與模型組大鼠相比，柚皮素高劑量組大鼠的FVC、FEV1、PEF 均較高，P＜0.05 ；柚皮素低劑量組大鼠與模型組大鼠的FVC、FEV1、PEF 相比，P＞0.05。詳見表1。

表1 各組大鼠呼吸功能指標(biāo)的比較（± s ）

表1 各組大鼠呼吸功能指標(biāo)的比較（± s ）

注：*與空白組相比，P ＜0.05，#與模型組相比，P ＜0.05。

組別 FVC（L） FEV1（L） PEF（L/s）空白組（n=10） 6.853±0.462 77.85±3.72 47.51±1.30模型組（n=10） 6.013±0.111* 63.57±1.54* 35.90±4.56*柚皮素低劑量組（n=10）6.465±0.284 69.65±4.50 43.24±3.70柚皮素高劑量組（n=10）6.565±0.196# 70.43±3.68# 45.47±3.42#

2.2 各組大鼠的病理學(xué)檢查結(jié)果

進(jìn)行病理學(xué)檢查的結(jié)果顯示，空白組大鼠的肺臟組織結(jié)構(gòu)較為正常，各級支氣管結(jié)構(gòu)完整清晰，肺泡形態(tài)較為正常，肺泡上皮細(xì)胞胞質(zhì)染色均勻，胞核清晰，未見明顯的變性壞死。模型組大鼠肺臟組織的基本形態(tài)結(jié)構(gòu)被破壞，支氣管結(jié)構(gòu)較為模糊，支氣管上皮細(xì)胞壞死，管腔內(nèi)可見大量細(xì)胞團(tuán)。其存在肺泡出血、破裂，肺泡上皮細(xì)胞彌漫性壞死后溶解，壞死區(qū)域大量粉染漿液滲出（內(nèi)含細(xì)胞殘片、炎癥細(xì)胞和紅細(xì)胞），支氣管及血管周圍存在明顯水腫伴炎細(xì)胞浸潤，其疏松結(jié)締組織內(nèi)可見大量淋巴細(xì)胞或中性粒細(xì)胞。柚皮素低劑量組大鼠部分區(qū)域肺泡結(jié)構(gòu)被破壞，出現(xiàn)少量支氣管上皮細(xì)胞壞死后脫落，肺泡上皮細(xì)胞小灶狀壞死，壞死區(qū)域可見肺泡結(jié)構(gòu)模糊，胞核裂解，胞質(zhì)溶解，支氣管及血管周圍輕微水腫伴淋巴細(xì)胞浸潤。柚皮素高劑量組大鼠的各級支氣管較為正常，支氣管上皮細(xì)胞排列較為整齊、緊密，存在少量肺泡上皮細(xì)胞變性壞死，壞死區(qū)域內(nèi)可見巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞或淋巴細(xì)胞散在分布，其血管或支氣管周圍出現(xiàn)輕微水腫，結(jié)締組織較松散。詳見圖1。

圖1 各組大鼠的病理學(xué)檢查結(jié)果

2.3 各組大鼠肺泡灌洗液細(xì)胞分類計(jì)數(shù)結(jié)果的比較

進(jìn)行肺泡灌洗液細(xì)胞分類計(jì)數(shù)的結(jié)果顯示，與空白組大鼠相比，模型組大鼠的肺泡灌洗液中性粒細(xì)胞百分比、嗜酸性粒細(xì)胞百分比、淋巴細(xì)胞百分比均較高，P＜0.05；與模型組大鼠相比，柚皮素高劑量組大鼠的肺泡灌洗液中性粒細(xì)胞百分比、嗜酸性粒細(xì)胞百分比、淋巴細(xì)胞百分比均較低，P＜0.05 ；柚皮素低劑量組大鼠與模型組大鼠的肺泡灌洗液中性粒細(xì)胞百分比、嗜酸性粒細(xì)胞百分比、淋巴細(xì)胞百分比相比，P＞0.05。詳見表2。

表2 各組大鼠肺泡灌洗液細(xì)胞分類計(jì)數(shù)結(jié)果的比較（%,± s ）

表2 各組大鼠肺泡灌洗液細(xì)胞分類計(jì)數(shù)結(jié)果的比較（%,± s ）

注：*與空白組相比，P ＜0.05，#與模型組相比，P ＜0.05。

組別 中性粒細(xì)胞 嗜酸性粒細(xì)胞 淋巴細(xì)胞空白組（n=10） 45.88±1.91 0.42±0.13 29.95±2.53模型組（n=10） 59.12±1.95* 1.19±0.38* 37.70±1.34*柚皮素低劑量組（n=10）57.25±4.15 0.98±0.30 33.30±1.74柚皮素高劑量組（n=10）52.97±4.01# 0.63±0.29# 31.99±1.52#

3 討論

吸煙是慢性肺病的主要誘因。與其他慢性肺病相比，COPD 在吸煙者或長期吸入煙霧人群中的總體發(fā)病率更高[8]。有研究指出，孕婦在孕期接觸香煙煙霧對胎兒的發(fā)育有害[9]。相關(guān)的研究表明，吸煙會促使淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞在呼吸道內(nèi)聚集，誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子的釋放，進(jìn)而可引起氣道炎癥反應(yīng)，加重呼吸道及肺臟細(xì)胞的損傷，嚴(yán)重時(shí)可誘發(fā)COPD[10]。COPD 患者的主要臨床表現(xiàn)為不可逆性呼吸氣流受限。進(jìn)行肺功能檢測是臨床上診斷COPD 的主要手段[11]。本研究使用FVC、FEV1、PEF這三種肺功能指標(biāo)評價(jià)COPD 大鼠模型的肺功能及為其使用柚皮素的效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與空白組大鼠相比，模型組大鼠的FVC、FEV1、PEF 均較低，P＜0.05。這與相關(guān)研究的結(jié)果一致[12]。與模型組大鼠相比，柚皮素高劑量組大鼠的FVC、FEV1、PEF 均較高，P＜0.05；柚皮素低劑量組大鼠與模型組大鼠的FVC、FEV1、PEF 相比，P＞0.05。這表明，高劑量的柚皮素能顯著提高COPD 大鼠模型的肺功能，而低劑量的柚皮素對其肺功能的改善效果不明顯。目前，臨床上對COPD 的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。但有研究發(fā)現(xiàn)，在COPD 發(fā)生發(fā)展的過程中，促炎細(xì)胞因子起著重要的作用。這些細(xì)胞因子可對肺臟結(jié)構(gòu)造成破壞，導(dǎo)致肺臟功能喪失[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠的肺臟組織出現(xiàn)大面積壞死，肺泡與支氣管結(jié)構(gòu)被嚴(yán)重破壞，這正是造成其肺功能下降的原因。無論是進(jìn)行病理學(xué)檢查還是肺泡灌洗液細(xì)胞計(jì)數(shù)的結(jié)果都顯示，模型組大鼠的肺臟組織中存在大量的中性粒細(xì)胞與淋巴細(xì)胞，這些炎性細(xì)胞可導(dǎo)致促炎細(xì)胞因子的大量釋放，從而可造成肺臟的結(jié)構(gòu)性損傷。筆者認(rèn)為，高劑量的柚皮素能減少肺臟中中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的數(shù)量，從根本上清除促炎因子產(chǎn)生的源頭，同時(shí)修復(fù)已經(jīng)損壞的支氣管與肺泡結(jié)構(gòu)，為肺功能的恢復(fù)創(chuàng)造有利條件。

綜上所述，高劑量的柚皮素能減少COPD 大鼠模型肺臟中中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的數(shù)量，修復(fù)其被破壞的肺臟結(jié)構(gòu)，改善其肺功能。