余嘉珍，莫 亞

1成都中醫(yī)藥大學(xué)眼科學(xué)院，四川 成都 610072；2成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，四川 成都 610075；3江西省上饒市立醫(yī)院，江西上饒334000

近十幾年來近視呈爆發(fā)性增長，已嚴重影響個人生 活質(zhì)量。預(yù)估到2050年，中國3～19歲兒童和青少年的近視患病率約為84%［1］。尤其是COVID-19流行實行居家隔離以來，學(xué)齡兒童的屈光變化和近視患病率顯著提高［2］。近視進一步發(fā)展導(dǎo)致高度近視，其眼底病變可致永久性視力損害，是青年患者的首要致盲眼?。?］。因此應(yīng)積極探尋延緩近視進展的治療靶點。

近視發(fā)展的特征為鞏膜重塑和眼軸增長，因此鞏膜在眼和屈光發(fā)育研究中得到廣泛關(guān)注［4］。目前已發(fā)現(xiàn)參與近視調(diào)控的重要因子有基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP-2）［5］、轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）［6］、堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）［7］、缺氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）［8］等；主要信號通路有特異性蛋白1信號傳導(dǎo)通路［9］、Wnt/β-連環(huán)蛋白（Wnt/β-catenin）信號通路［10］及Smad3信號通路［11］等。但觸發(fā)這些變化的生理信號仍然是不確定的。關(guān)于如何誘導(dǎo)近視相關(guān)的鞏膜細胞外基質(zhì)（ECM）重塑的關(guān)鍵問題仍然存在。而且以上研究均使用整個鞏膜組織，受限于組織間微環(huán)境影響，無法準確反映細胞之間的特異性。RNA測序（RNA-seq）能夠針對單個細胞進行測序，逐個細胞研究其表達差異，且具有單次樣本量大［12］、耗時短、費用低、通量高等優(yōu)勢［13］。國內(nèi)尚無將單細胞捕獲RNA-seq運用于鞏膜成纖維細胞的研究報道。國外報道將單細胞RNA-seq運用于整個鞏膜組織，揭示具有不同基因表達譜的鞏膜細胞群，解釋了近視發(fā)病過程中細胞表型變化［14］。但是其造模時間短，而且使用整個鞏膜組織，不能反應(yīng)的單個鞏膜成纖維細胞的異質(zhì)性，因此本研究采用單細胞捕獲鞏膜成纖維細胞進行RNA-seq。

因小鼠的基因數(shù)據(jù)庫完善，且為研究近視的常用動物模型［15］，我們對單細胞捕獲形覺剝奪性近視小鼠鞏膜成纖維細胞行RNA-seq，并對差異基因進行GO功能注釋和KEGG通路富集分析，進一步明確近視進展過程中鞏膜成纖維細胞的基因變化以其參與的生物學(xué)過程，探索鞏膜成纖維細胞在近視中的作用機制。

1 材料和方法

1.1 實驗分組

選擇12只健康的C57BL/6J小鼠，將其隨機分為近視模型組和陰性對照組，6只/組。陰性對照組小鼠雙眼無遮擋，近視模型組的小鼠使用半透明的眼罩遮擋右眼進行形覺剝奪，連續(xù)6周。實驗前后均用KN-1800動物A超測量眼軸，每組隨機選取3只小鼠取右眼進行鞏膜成纖維細胞單細胞捕獲RNA-seq。

1.2 實驗方法和步驟

1.2.1 眼軸測量 在實驗開始時以及實驗6周時，用A超（KN-1800）測量小鼠眼軸，每只眼睛測5次，取平均值。由2名實驗員以雙盲的方式獲得。

1.2.2 單細胞捕獲RNA-seq 每組隨機選取3只小鼠頸椎脫臼處死后在手術(shù)顯微鏡下完整摘除右眼眼球用于觀察。每例標本切取覆膜切片（Leica顯微切割載玻片PET 膜，貨號：11505190 PET FrameSlide，RNase-free，steel frames，50pc.）4張，膜厚度0.2 μm，切片厚度8 μm，切片經(jīng)HE染色后，在lecia LMD6500顯微切割系統(tǒng)進行成纖維細胞的分選。按順序打開顯微操作平臺、激光發(fā)射器等設(shè)備電源，進行顯微切割儀器的調(diào)試和預(yù)熱。經(jīng)顯微切割操作軟件（Leica LMD Software）設(shè)置操作參數(shù)，將顯微切割載玻片倒置放于載片架上，將標記好的0.5 mL PCR 管置于持管架上，管蓋內(nèi)加入50 μL RNase-free H2O，用于收集目標細胞。在病理老師的指導(dǎo)下，調(diào)節(jié)顯微鏡的焦距和視野，物鏡為20倍或者40倍，選定目標細胞群，點擊激光束開始切割，附有選定目標細胞群的PET膜在重力的作用下即會落入PCR收集管的管蓋中。

獲得6 個RNA 樣本，經(jīng)Ovation Solo RNA-Seq Systems 放大后得到測序文庫，經(jīng)Qubit 及Agilent Bioanalyzer 2100（Agilent technologies）電泳質(zhì)檢合格后備用。根據(jù)Illumina User Guide準備測序試劑，將攜有cluster的flow cell 上機。選擇paired-end進行雙端測序，此過程由Illumina提供的data collection software控制，同時進行數(shù)據(jù)的實時分析。

1.2.3 差異基因篩選 樣本中的基因表達譜原始數(shù)據(jù)上傳至GCBI 分析平臺（https://www.gcbi.com.cn/gclib/html/index），樣本分為近視模型組、陰性對照組每組3個樣本，兩組樣本進行對比讀取原始數(shù)據(jù)表達譜信號值，對比分析模型組vs對照組之間各基因表達差異情況，差異基因篩選標準為：P＜0.05，Q＜0.05，差異倍數(shù)（FC）＞2。獲得模型組vs對照組表達譜中上調(diào)基因和下調(diào)基因。生成了一個火山圖，以散點圖的形式以圖形方式表示來自大型RNAseq數(shù)據(jù)集的差異表達基因的倍數(shù)變化程度?；鹕綀D和熱圖都是使用R軟件設(shè)計的。

1.2.4 差異基因統(tǒng)計學(xué)方法及功能注釋和信號通路富集應(yīng)用edgeR進行樣本間差異基因分析，得出P值后進行多重假設(shè)檢驗校正，通過控制錯誤發(fā)現(xiàn)率（FDR）來決定P值的閾值，校正后的Pvalue即qvalue。同時，我們根據(jù)轉(zhuǎn)錄本在各個樣本中的表達量值計算差異表達倍數(shù)，即Fold-change。差異基因篩選條件如下：qvalue≤0.05；Fold-change≥2。

用DAVID（https://david.ncifcrf.gov/）對基因共表達網(wǎng)絡(luò)中的差異表達基因（DEG）進行GO 功能分析。用KOBAS3.0（http://kobas.cbi.pku.edu.cn/）對DEG進行KEGG 途徑富集分析形成可以體現(xiàn)DEG 的通路圖。

，

2 結(jié)果

2.1 眼軸結(jié)果

實驗開始時，兩組軸長度沒有相關(guān)性（P＞0.05）；造模6 周后，與對照組相比，模型組眼軸長度相對延長0.32 mm，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01，表1）。

2.2 火山圖顯示差異基因

近視模型對比陰性對照組共鑒定出504個基因，差異基因分析顯示169個基因（P＞0.05，圖1），但其中有112個基因有上調(diào)趨勢，57個基因呈下調(diào)趨勢。

圖1 模型組vs對照組差異基因火山圖Fig.1 Model vs Control differential gene volcano map.

2.3 差異基因的GO功能分析

共檢測出727 個GO 項，GO 共檢測出466 個GO項，其中生物過程中337個GO項；細胞組分中57個GO項；分子功能中71個GO項（P＜0.05，圖2）。

圖2 近視小鼠GO功能分類分析Fig.2 Classification and analysis of GO function in myopic mice.

近視模型組vs陰性對照組中發(fā)現(xiàn)了大量和ATP代謝、結(jié)合，氧化還原過程、氧化應(yīng)激反應(yīng)等與氧化磷酸化相關(guān)的GO，和蛋白質(zhì)代謝、轉(zhuǎn)運相關(guān)的生物學(xué)過程、以及白細胞黏附、白細胞分化等生物過程（圖3）。

圖3 近視小鼠GO富集分析散點圖Fig.3 Scatter plot of GO enrichment analysis in myopic mice.

2.4 差異基因的KEGG富集分析

信號通路富集分析結(jié)果顯示，近視模型組對比陰性對照組中共檢測出175 個通路，其中通路39 個（P＜0.05）。近視小鼠鞏膜成纖維細胞中表達較高的前30的KEGG通路富集中發(fā)現(xiàn)TCA循環(huán)、PPAR信號通路、氧化磷酸化等糖酵解氧化相關(guān)通路，帕金森氏病、阿爾茨海默氏病等神經(jīng)退行性改變相關(guān)通路及蛋白質(zhì)消化吸收被激活（圖4）。

圖4 近視小鼠KEGG富集的前30個通路Fig.4 The top 30 pathways enriched in KEGG analysis in myopic mice.

3 討論

近視人類和動物模型的共同特征是由于鞏膜結(jié)構(gòu)和組成的變化而導(dǎo)致的鞏膜廣泛的ECM重塑伴隨著眼軸的增長［16］。本研究發(fā)現(xiàn)小鼠造模后眼軸較造模前顯著延長，說明近視模型造模成功。鞏膜成纖維細胞是鞏膜的固有細胞成分，既負責(zé)合成分泌膠原蛋白、彈性蛋白、糖蛋白、膠原纖維［17］，同時也負責(zé)分泌降解鞏膜膠原纖維等ECM的MMP-2［18］。大量的研究已證實在近視過程中伴隨著鞏膜ECM內(nèi)膠原蛋白和蛋白聚糖的降解，生長因子水平的降低［19］。我們在實驗中觀察到主要的ECM基因包括膠原蛋白亞型（CoL12α1、CoL15α1）和蛋白聚糖相關(guān)因子（Ppp1cb、Pik3r1）在近視小鼠中表達下調(diào)。與先前報道的ECM組分在近視豚鼠鞏膜中的發(fā)展中的變化相符［20］，表明在近視形成過程中出現(xiàn)膠原蛋白合成量減少，可能與鞏膜成纖維細胞生長受抑制相關(guān)。

γ-氨基丁酸（GABA）受體存在于近視雛雞鞏膜的纖維層和軟骨層內(nèi)［21］，也存在于人的鞏膜中［22］。早期研究表明，GABA受體激動劑可增加雛雞的近視易感性，而其拮抗劑可抑制近視的發(fā)展［23］。糖胺聚糖（GAG）是鞏膜基質(zhì)主要成分之一。有研究發(fā)現(xiàn)GABA激動劑處理后小雞鞏膜成纖維細胞中GAG 明顯減少，使用GABA 拮抗劑后增加［24］。Srinivasalu 等［25］通過RNAseq研究近視眼與非近視眼之間視神經(jīng)周圍區(qū)域鞏膜的基因表達差異，證明GABA受體信號通路會影響近視鞏膜的發(fā)展。綜上表明GABA受體可能是通過抑制鞏膜成纖維細胞內(nèi)GAG的含量，來影響鞏膜ECM重塑，促進近視進展。本次實驗中觀察到GABA途徑的表達以及其影響基因（Kif5b、scl38a2、Glul呈下調(diào)趨勢）的變化，與先前的研究一致，但如何協(xié)同調(diào)控引起近視的具體機制還有待進一步的深入研究。

本次實驗通過GO分析發(fā)現(xiàn)近視形成過程中出現(xiàn)白細胞聚集、分化以及細胞黏附等GO 項；MAPK、PI3K/AKT等與炎癥相關(guān)信號通路也持續(xù)表達，表明近視形成過程中小鼠鞏膜成纖維細胞中有炎癥產(chǎn)生。與近視的發(fā)生與全身或眼部炎癥具有顯著相關(guān)性的研究相符［26,27］。巨噬細胞是機體重要的免疫炎癥相關(guān)細胞，是研究炎癥調(diào)控和分子免疫的重要對象［28］。李東輝等［29］發(fā)現(xiàn)M2型巨噬細胞通過上調(diào)MMP-2的表達，從而促進膠原蛋白的降解，參與C57BL/6小鼠形覺剝奪性近視的發(fā)生發(fā)展。我們前期研究發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)細胞凋亡蛋白c-Jun，在近視鞏膜中表達上升，誘導(dǎo)鞏膜成纖維細胞凋亡，促進近視的發(fā)展［30］。c-Jun 屬MAPK 超家族的一員。MAPK級聯(lián)整合來自一系列神經(jīng)遞質(zhì)受體的信號，以調(diào)節(jié)復(fù)雜的細胞程序，包括增殖，分化，凋亡，應(yīng)激和炎癥［31］。我們在近視小鼠中觀察到MAPK信號通路激活，兩組途徑同時調(diào)控，一是MEK1磷酸化ERK，進行細胞增殖分化；二是JNK/SAPK(c-Jun氨基末端激酶/應(yīng)激激活性蛋白激酶)級聯(lián)系統(tǒng)被炎癥等刺激而被激活，活化的c-Jun磷酸化了促炎性因子AP-1，參與細胞凋亡過程。證實了在小鼠近視過程中成纖維細胞處于炎癥介導(dǎo)的凋亡過程。

本研究在近視小鼠成纖維細胞中發(fā)現(xiàn)ATP代謝、結(jié)合，氧化還原過程、氧化應(yīng)激反應(yīng)等與氧化相關(guān)的GO項；在KEGG富集分析中發(fā)現(xiàn)了TCA循環(huán)、氧化磷酸化以及HIF-1信號通路等與氧化相關(guān)的通路被激活，提示近視時小鼠鞏膜成纖維細胞內(nèi)處于缺氧與氧化應(yīng)激狀態(tài)。近視過程中脈絡(luò)膜毛細血管通透性和血流減少，降低向鄰近的無血管鞏膜的氧氣和營養(yǎng)供應(yīng)水平，隨之而來的鞏膜缺氧導(dǎo)致鞏膜成纖維細胞功能受限［32］。HIF-1α是缺氧相關(guān)病理變化的關(guān)鍵分子，參與氧化應(yīng)激及炎癥、誘導(dǎo)細胞凋亡［33］。缺氧條件通常會激活HIF-1α信號通路，影響代謝水平，如：線粒體ATP的產(chǎn)生，葡萄糖的攝取和糖酵解［34］。我們實驗中發(fā)現(xiàn)近視過程中成纖維細胞處于缺氧環(huán)境，HIF-1信號通路被激活，p300/cbp活化，大量增加氧氣輸送并介導(dǎo)對氧氣缺乏的適應(yīng)性反應(yīng)的蛋白質(zhì)表達，刺激肌動蛋白細胞骨架途徑促進成纖維細胞向成肌纖維細胞轉(zhuǎn)分化，加速膠原蛋白生成的降解。Wu等［35］通過實驗證明鞏膜缺氧激活了HIF-1α信號傳導(dǎo)途徑，進而誘導(dǎo)了近視發(fā)展。於亭等［36］發(fā)現(xiàn)電針干預(yù)可以通過抑制HIF-1α表達,從而改善鞏膜缺氧以延緩近視發(fā)生發(fā)展。這與我們的研究一致，表明近視過程中鞏膜成纖維細胞功能障礙與缺氧密切相關(guān)。

此外研究中還發(fā)現(xiàn)近視小鼠鞏膜成纖維細胞中大量與蛋白質(zhì)相關(guān)GO包括蛋白質(zhì)折疊、調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)結(jié)合、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運以及蛋白質(zhì)代謝過程的負調(diào)控等，在KEGG途徑分析中發(fā)現(xiàn)了帕金森氏病、阿爾茨海默氏病、亨廷頓氏病以及蛋白質(zhì)消化吸收等信號通路。提示了近視小鼠成纖維細胞處于蛋白質(zhì)代謝失調(diào)以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激過程中。當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài)功能平衡被破環(huán)，蛋白質(zhì)加工運輸受阻，非折疊或錯誤折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上積累，產(chǎn)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激［37］。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激過強會引起細胞代謝紊亂，并損害自噬功能，增加神經(jīng)元死亡易感性［38］。研究發(fā)現(xiàn)在形覺剝奪性近視的鞏膜重塑過程中觸發(fā)了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，還在鞏膜成纖維細胞中證明了延長的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激最終導(dǎo)致膠原蛋白減少和近視發(fā)展［39］。

在KEGG分析還發(fā)現(xiàn)環(huán)狀單磷酸腺苷（CAMP）信號通路以及PPAR 信號通路等經(jīng)典通路的表達。CAMP途徑其通過調(diào)節(jié)膠原蛋白合成影響近視發(fā)展，是近視發(fā)展的常見機制［40］。腺苷酸環(huán)化酶活化會增加鞏膜內(nèi)CAMP的含量，進而降低豚鼠鞏膜膠原合成、抑制ECM纖維化，促進近視發(fā)展［41］。PPAR家族包括3種亞型：PPARα，PPARβ和PPARγ。PPARγ被廣泛認為是脂質(zhì)代謝過程的重要調(diào)節(jié)劑［42］，也可能導(dǎo)致近視［43］。Pan等［44］發(fā)現(xiàn)在豚鼠鞏膜中，PPARα激動劑具有抑制近視進展的促纖維化作用，而PPARα拮抗劑則抑制了纖維化并促進了近視；PPARγ激動劑逆轉(zhuǎn)了形覺剝奪誘導(dǎo)鞏膜HIF-1α表達水平增加，鈍化了COL1表達水平的下降，相反，PPARγ拮抗劑增加HIF-1α表達，鞏膜COL1表達的下降促進了近視的發(fā)展［45］。本次實驗中觀察到CAMP和PPAR信號通路的表達，再一次證明了這兩條經(jīng)典通路對近視鞏膜成纖維細胞功能的調(diào)控作用。

綜上所述，本研究通過應(yīng)用單細胞RNA-seq技術(shù)對鞏膜成纖維細胞與近視的相互關(guān)系進行了更進一步的探索，發(fā)現(xiàn)近視進展過程中出現(xiàn)了成纖維細胞功能障礙，與炎癥反應(yīng)、缺氧、蛋白質(zhì)的調(diào)節(jié)及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的相關(guān)基因表達和通路的調(diào)節(jié)有一定關(guān)系。解析了鞏膜成纖維細胞在近視進展中的作用機制，為臨床上近視的早期防控提供了一些新的研究靶點。