沈炳香，王法財(cái)，周 藝，李 婷，何春遠(yuǎn)，趙為陳

1安徽醫(yī)科大學(xué)附屬六安醫(yī)院藥學(xué)部，安徽 六安 237005；2中南大學(xué)湘雅藥學(xué)院藥理學(xué)系，湖南 長(zhǎng)沙410078

糖尿病腎?。―N）是糖尿病嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥之一，占終末期腎?。‥SRD）約30%～47%［1］，其10年死亡率是健康人群的6倍［2］。腎小管間質(zhì)纖維化以及高血糖引起的腎組織細(xì)胞凋亡是DN重要的病理基礎(chǔ)［3,4］。研究證實(shí)，高糖能夠誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致尿蛋白產(chǎn)生、細(xì)胞外基質(zhì)的沉積以及腎小球硬化［5］。因此，探究DN 腎間質(zhì)纖維化以及細(xì)胞凋亡的發(fā)生機(jī)制及其藥物治療，對(duì)于防治DN具有重要意義。人參皂苷Rh2（G-Rh2）是從紅參中分離Rg3并經(jīng)人腸道菌轉(zhuǎn)化而得到的主要代謝產(chǎn)物，其具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤以及抑制纖維化等作用［6-7］。研究表明，在糖尿病大鼠心肌纖維化模型中，G-Rh2能夠通過(guò)調(diào)控PPARδ-STAT3信號(hào)，降低心肌膠原沉積，改善糖尿病心肌纖維化［8］。本實(shí)驗(yàn)前期研究發(fā)現(xiàn)，在DN大鼠模型中，G-Rh2能夠通過(guò)抑制Caspase-1介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡，改善DN腎損傷［9］。以上研究表明G-Rh2在糖尿病血管病變中發(fā)揮重要作用，但是有關(guān)其對(duì)DN腎纖維化和細(xì)胞凋亡的影響及作用機(jī)制尚不清楚。

盤(pán)狀結(jié)構(gòu)域受體1（DDR1）是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種新型酪氨酸蛋白激酶受體，參與包括細(xì)胞凋亡，增殖，遷移以及組織炎癥和纖維化等［10］。以往文獻(xiàn)顯示，DDR1在多種組織和器官中廣泛表達(dá)，尤其是肺、脾、腎和小腸組織［11］。DDR1能夠通過(guò)膠原基質(zhì)調(diào)節(jié)人肺成纖維細(xì)胞遷移，促進(jìn)成纖維細(xì)胞穿越基底膜屏障［12］。在博來(lái)霉素誘導(dǎo)小鼠肺纖維化模型中，組織學(xué)檢測(cè)DDR1表達(dá)上調(diào)［13］。另外，在腎小管上皮細(xì)胞中敲除DDR1基因可以延緩遺傳性Ⅳ膠原疾病腎纖維化［10］。在高糖誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡中DDR1表達(dá)上調(diào)，抑制DDR1能夠降低高糖誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡［14］。以上研究表明DDR1在纖維化和細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用。但是有關(guān)DDR1在糖尿病腎病腎纖維化和細(xì)胞凋亡中作用尚不清楚。因此，本研究擬通過(guò)構(gòu)建DN大鼠模型，探究G-Rh2能否通過(guò)調(diào)控DDR1抑制腎纖維化和細(xì)胞凋亡，以期為DN治療提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性，SPF級(jí)，6～8周齡，體質(zhì)量180～200 g的SD大鼠，購(gòu)買自中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部（許可證：SCXK（湘）2017-0006）。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物與主要試劑 人參皂苷Rh2（上海順勃生物工程技術(shù)有限公司，純度≥98，批號(hào)：112246-15-8）；鏈脲佐菌素（STZ）（Sigma-Aldrich，批號(hào)：V900890）；胰島素測(cè)定試劑盒（上海酶聯(lián)科技生物有限公司，批號(hào)：ml064302）；蘇木素伊紅（HE）染色試劑盒（碧云天生物技術(shù)，批號(hào)：C0105S）；過(guò)碘酸-雪夫（PAS）染色試劑盒（碧云天生物技術(shù)，批號(hào)：C0142S）；馬松（Masson）染色試劑盒（Sigma-Aldrich，批號(hào)：1.00485）；TUNEL染色試劑盒（碧云天生物技術(shù)，批號(hào)：C1098）；兔SP免疫組化試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)公司，批號(hào)：SP-9001）；CollagenI 兔單克隆抗體（Abcam，批號(hào)：ab260043）；CollagenIII 兔多克隆抗體（Abcam，批號(hào)：ab7778）；Caspase-3兔單克隆抗體（Abcam，批號(hào)：ab32351）；Bcl-2兔多克隆抗體（碧云天生物技術(shù)，批號(hào)：AF0060）；DDR1兔單克隆抗體（Cell Signaling Technology，批號(hào)：3917）；β-actin 小鼠單克隆抗體（碧云天生物技術(shù)，批號(hào)：AF5001）；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔（碧云天生物技術(shù)，批號(hào)：A0208）；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠（碧云天生物技術(shù)，批號(hào)：A0216）。

1.1.3 儀器 血糖儀器（長(zhǎng)沙三諾生物傳感技術(shù)有限公司）；熒光倒置顯微鏡（日本尼康）；組織勻漿儀（武漢微塞爾生物科技有限公司）；酶標(biāo)儀（北京普朗醫(yī)療公司）；高速冷凍離心機(jī)（Beckman-Coulter）；ChemiDoc XRS+成像系統(tǒng)（Bio-Rad）。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物建模與給藥 實(shí)驗(yàn)SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、糖尿病腎病組（DN）、人參皂苷Rh2 藥物干預(yù)組（GRh2），每組各10只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。DN和G-Rh2藥物干預(yù)組大鼠腹腔注射STZ（60 mg/kg）構(gòu)建糖尿病模型，連續(xù)3 d血糖值≥16.7 mmol/L視為造模成功，成功造模7 d后進(jìn)行尿蛋白定性檢測(cè)，尿蛋白為陽(yáng)性為DN模型構(gòu)建成功[9]。對(duì)照組大鼠給予注射等量的檸檬酸緩沖溶液。在DN大鼠造模成功的第2 d，G-Rh2組大鼠灌胃G-Rh2（20 mg·kg-1·d-1），連續(xù)用藥12周，DN組和對(duì)照組灌胃等量的生理鹽水。

1.2.2 大鼠相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)（1）血糖：大鼠尾靜脈取血，血糖儀檢測(cè)血糖值；（2）胰島素：大鼠心臟取血，4 ℃，3000 r/min，離心10 min分離血漿，胰島素試劑盒檢測(cè)其含量；（3）肌酐、尿素氮、尿蛋白：采用全自動(dòng)生化分析儀，并按照南京建成生物公司試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.3 腎臟組織病理取材 G-Rh2藥物灌胃處理12 周，大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉，仰臥位固定大鼠，打開(kāi)胸腔，待心臟取血完成后剪開(kāi)左心耳，4%的多聚甲醛持續(xù)灌流直至心臟、肺呈現(xiàn)乳白色，利用手術(shù)鑷和手術(shù)剪刀剝離周圍結(jié)締組織摘取大鼠左腎并采用生理鹽水清洗血漬，最后放置于液氮罐內(nèi)保存留存。

1.2.4 大鼠腎組織形態(tài)學(xué)觀察 4%的多聚甲醛固定大鼠腎組織，石蠟切片厚度約5 μm，行HE、PAS和Masson染色，于200倍顯微鏡下觀察各組大鼠腎組織形態(tài)學(xué)。Masson染色觀察膠原顯示藍(lán)色。

1.2.5 TUNEL染色 大鼠腎組織經(jīng)石蠟切片、常規(guī)脫水，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)行TUNEL組織熒光染色。光學(xué)顯微鏡下觀察腎組織細(xì)胞凋亡情況，凋亡細(xì)胞呈熒光綠色。于400倍顯微鏡下隨機(jī)性選取6個(gè)視野（視野下需包含腎小球結(jié)構(gòu)）。細(xì)胞凋亡指數(shù)（%）=熒光綠色細(xì)胞凋亡數(shù)目/藍(lán)色細(xì)胞核細(xì)胞總數(shù)目×100%。

1.2.6 免疫組織化學(xué) 大鼠腎組織經(jīng)石蠟切片、常規(guī)脫水，按照兔SP免疫組化試劑盒行免疫組化染色，DAB顯色。于200倍顯微鏡下觀察DDR1表達(dá)與分布，組織中DDR1著色呈棕褐色。

1.2.7 蛋白質(zhì)免疫印跡 提取腎組織總蛋白并測(cè)定其濃度，取40 μg蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，5%的脫脂牛奶封閉非特異性位點(diǎn)2 h；4 ℃條件下，孵育CollagenI兔單克隆抗體（1∶1000），CollagenIII兔多克隆抗體（1∶1000），Caspase-3兔單克隆抗體（1:1000），Bcl-2兔多克隆抗體（1∶1000），DDR1兔單克隆抗體（1∶1000）和β-actin小鼠單克隆抗體（1∶5000）16 h；TBST清洗3次，5 min/次；室溫條件下，孵育辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔（1∶5000）或者辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠（1∶5000）1 h；TBST清洗3次，5 min/次；發(fā)光試劑顯影，ChemiDoc XRS+成像系統(tǒng)拍照并進(jìn)行目的蛋白表達(dá)分析。目的蛋白表達(dá)水平以目的條帶灰度值比β-actin條帶灰度值表示。

1.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行分析，定量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組均數(shù)比較采用方差齊性檢驗(yàn)和單因素方差分析，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 G-Rh2對(duì)DN大鼠生化指標(biāo)的影響

與對(duì)照組相比，DN組大鼠血糖、尿蛋白、肌酐和尿素氮水平明顯升高（P＜0.01），胰島素水平明顯降低（P＜0.01）。與DN組相比，G-Rh2組大鼠血糖、尿蛋白、肌酐和尿素氮水平降低（P＜0.01），胰島素水平升高（P＜0.01，表1）。

表1 各組大鼠血糖、胰島素、肌酐、尿素氮和尿蛋白水平比較Tab.1 Blood glucose,insulin,creatinine,urea nitrogen and urinary proteins levels in each group(n=6,Mean±SD)

2.2 G-Rh2對(duì)DN大鼠腎纖維化的影響

HE染色和PAS染色顯示，對(duì)照組大鼠腎組織腎小球結(jié)構(gòu)完整，清晰、腎小管上皮細(xì)胞排列規(guī)則；DN組大鼠腎組織腎小球體積增大且基底膜增厚，腎小管結(jié)構(gòu)紊亂，且部分空泡變性，有典型的病理學(xué)改變；G-Rh2組大鼠腎組織上述病變減輕。Masson染色顯示，與對(duì)照組相比，DN組和G-Rh2組膠原沉積增多；與DN組相比，G-Rh2組膠原沉積減少（圖1）。Western blot顯示，與對(duì)照組相比，DN 組CollagenI、CollagenIII 表達(dá)上調(diào)（P＜0.01）；與DN組相比，G-Rh2組CollagenI、CollagenIII表達(dá)下調(diào)（P＜0.05或P＜0.01，圖2）。

圖1 各組大鼠腎組織形態(tài)學(xué)變化和纖維化程度Fig.1 Hisotological changes and degree of fibrosis in the kidney tissue of the rats in each group.

圖2 各組大鼠腎組織Collagen I和Collagen III表達(dá)Fig.2 Expression of collagen I and collagen III in the kidney tissue of the rats in each group.**P＜0.01 vs control group;#P＜0.05,##P＜0.01 vs DN group.A:Western blotting of collagen I and collagen III expressions;B:Quantitative analysis of the results.

2.3 G-Rh2對(duì)DN大鼠細(xì)胞凋亡的影響

TUNEL染色顯示，與對(duì)照組相比，DN組細(xì)胞凋亡指數(shù)增加（P＜0.01）；與DN組相比，G-Rh2組細(xì)胞凋亡指數(shù)顯著降低（P＜0.01，圖3）。Western blot檢測(cè)顯示，與對(duì)照組相比，DN組Cleaved-caspase-3表達(dá)上調(diào)，Bcl-2表達(dá)下調(diào)（P＜0.01）；與DN 組相比，人參皂苷Rh2 組Cleaved-caspase-3表達(dá)降低（P＜0.05），Bcl-2表達(dá)升高（P＜0.05，圖4）。

圖3 TUNEL染色觀察大鼠腎組織凋亡情況Fig.3 TUNEL staining for observing renal cell apoptosis of the rats.**P＜0.01 vs control group;##P＜0.01 vs DN group.A:TUNEL staining of the renal tissue.B:Quantitative analysis of the results.

圖4 各組大鼠腎組織Cleaved-caspase-3和Bcl-2表達(dá)Fig.4 Expression of cleaved caspase-3 and Bcl-2 in the kidney tissue of the rats in each group.**P＜0.01 vs control group;#P＜0.05,##P＜0.01 vs DN group.A:Western blotting of the expressions of cleaved caspase-3 and Bcl-2 proteins.B:Quantitative analysis of the results.

2.4 G-Rh2對(duì)DN大鼠DDR1表達(dá)的影響

Western blot檢測(cè)顯示，與對(duì)照組相比，DN組腎組織DDR1表達(dá)明顯上調(diào)（P＜0.01）；與DN組相比，G-Rh2組DDR1 表達(dá)顯著降低（P＜0.01）。免疫組化檢測(cè)，DDR1在腎小管細(xì)胞中呈現(xiàn)高表達(dá)，與對(duì)照組相比，DN組和G-Rh2 組腎組織DDR1 表達(dá)增加，但G-Rh2 組DDR1表達(dá)低于DN組（圖5）。

圖5 各組大鼠腎組織DDR1表達(dá)Fig.5 DDR1 expression in the kidney tissue of the rats in each group.**P＜0.01 vs control group;##P＜0.01 vs DN group.A:Western blotting for detecting DDR1 expression.B:Quantitative analysis of the results.C:Representative results of immunohistochemical staining for detecting DDR1 expression in the 3 groups.

3 討論

血糖異常升高被認(rèn)為是DN發(fā)病的基礎(chǔ)，高血糖可以通過(guò)多種基質(zhì)損傷腎小管上皮細(xì)胞，主要包括炎癥風(fēng)暴，氧化應(yīng)激，細(xì)胞凋亡以及纖維化等。其中腎細(xì)胞凋亡以及腎間質(zhì)纖維化已經(jīng)成為DN的主要病理特征［15,16］。研究表明，細(xì)胞凋亡能夠?qū)е履I細(xì)胞外基質(zhì)沉積、腎小管上皮細(xì)胞肥大以及腎小球膜擴(kuò)張，進(jìn)而導(dǎo)致腎小管間質(zhì)纖維化和腎小球硬化［17,18］。另外，腎纖維化作為糖尿病腎損傷的重要環(huán)節(jié)，其可以引起ESRD［19,20］。臨床研究證實(shí)，通過(guò)有效控制血糖以及血壓能夠改善DN患者的病癥［21-23］。然而，目前臨床上主要以血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑和血管緊張素受體阻斷劑藥物治療DN，但是單一藥物治療只能針對(duì)DN某個(gè)特定病因，長(zhǎng)期服用具有一定的毒副作用［9］。因此，探尋中藥活性單體對(duì)于治療DN尤為重要。

G-Rh2 在腫瘤，心血管，神經(jīng)系統(tǒng)中均被廣泛研究。研究表明G-Rh2能夠調(diào)控氧化應(yīng)激，細(xì)胞凋亡以及纖維化等途徑發(fā)揮心血管疾病的治療作用［7-9］。本研究首先探究G-Rh2對(duì)DN大鼠的治療作用。結(jié)果顯示，與DN組相比，G-Rh2能夠有效降低DN大鼠血糖、尿蛋白、肌酐和尿素氮。初步表明G-Rh2對(duì)DN具有治療作用。既往研究證實(shí)，在DN大鼠模型中，G-Rh2能夠通過(guò)調(diào)控基質(zhì)金屬蛋白酶表達(dá)，緩解DN腎損傷［24］。另外，在70%胰腺部分切除型成年C57BL/6J小鼠中，G-Rh2能夠通過(guò)調(diào)控Akt/Foxo1/PDX-1信號(hào)，抑制胰島β細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞增殖，進(jìn)而降低血糖，改善小鼠葡萄糖耐受量［25］。以上研究均表明G-Rh2在糖尿病中具有一定的治療潛力。本研究通過(guò)DN大鼠給予G-Rh2灌胃處理12周，探究G-Rh2能否通過(guò)抑制DN腎纖維化和細(xì)胞凋亡，改善DN 腎損傷。結(jié)果顯示，與DN 組相比，GRh2組大鼠腎病理?yè)p傷減輕，膠原沉積減少，腎組織細(xì)胞凋亡降低。進(jìn)一步Western blot檢測(cè)顯示，與DN腎病組相比，G-Rh2組大鼠腎組織CollagenI、CollagenIII以及Cleaved-caspase-3均表達(dá)下調(diào)，Bcl-2表達(dá)上調(diào)。以上研究結(jié)果表明G-Rh2能夠通過(guò)抑制腎組織細(xì)胞凋亡和纖維化進(jìn)而改善DN腎損傷。那么有關(guān)G-Rh2對(duì)DN 腎纖維化和細(xì)胞凋亡的調(diào)控機(jī)制又是如何呢？DDR1是與細(xì)胞凋亡和纖維化密切相關(guān)的受體酪氨酸蛋白激酶家族蛋白成員之一［26］。既往研究發(fā)現(xiàn)在單側(cè)輸尿管梗阻的大鼠腎纖維化模型中，抑制DDR1能夠降低炎癥細(xì)胞遷移進(jìn)而阻止纖維化進(jìn)程［27］。另外，DDR1基因缺失小鼠能夠免受血管緊張素II介導(dǎo)的蛋白尿和腎小球纖維化［28］。新近研究也證實(shí)抑制DDR1能夠降低高糖誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡［14］。以往研究表明抑制DDR1可能成為防治纖維化和細(xì)胞凋亡的重要途徑［10,11］。因此，本研究進(jìn)一步檢測(cè)G-Rh2對(duì)DN腎組織DDR1表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，DN組DDR1表達(dá)上調(diào)；與DN組相比，G-Rh2組DDR1表達(dá)下調(diào)。本研究結(jié)果表明G-Rh2抗DN腎纖維化和細(xì)胞凋亡可能與下調(diào)DDR1表達(dá)相關(guān)。以往文獻(xiàn)研究證實(shí)DDR1可以通過(guò)PI3K、Rac1和c-Jun等信號(hào)促進(jìn)膠原蛋白合成，誘導(dǎo)纖維化［28］。另外，DDR1亦可以通過(guò)Notch1、Hes、Jak2信號(hào)調(diào)控細(xì)胞凋亡和增殖［29-30］。但是本研究?jī)H僅從動(dòng)物實(shí)驗(yàn)上初步揭示G-Rh2可能通過(guò)下調(diào)DDR1，抑制DN腎纖維化和細(xì)胞凋亡，緩解DN腎損傷。因此，在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究中擬從細(xì)胞水平探究G-Rh2調(diào)控DDR1抑制腎纖維化和細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制。既往研究顯示在低氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷模型中，HMGB1能夠通過(guò)調(diào)控DDR1，抑制mTOR磷酸化，促進(jìn)Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ，降低p62的表達(dá)，誘導(dǎo)自噬［31］。另外，體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)也證實(shí)抑制DDR1表達(dá)能夠增強(qiáng)自噬水平進(jìn)而減輕骨關(guān)節(jié)炎［32］。而自噬是細(xì)胞將自身受損的細(xì)胞器或錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)包裹、吞噬、并運(yùn)輸?shù)饺苊阁w進(jìn)行降解，實(shí)現(xiàn)自身物質(zhì)代謝更新，能量再循環(huán)利用的生物學(xué)過(guò)程。因此，在激活自噬的同時(shí)也會(huì)增強(qiáng)溶酶體功能，這與本課題組前期研究證實(shí)G-Rh2 可以通過(guò)增強(qiáng)cathepsin B 和cathepsin L活性，改善溶酶體功能，從而發(fā)揮DN保護(hù)作用一致［9］。上述研究提示：G-Rh2極有可能通過(guò)調(diào)控DDR1，改善溶酶體功能，并最終抑制DN腎纖維化和細(xì)胞凋亡。

綜上所述，本研究通過(guò)構(gòu)建DN模型探究G-Rh2對(duì)腎纖維化和細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果顯示G-Rh2能夠通過(guò)下調(diào)DDR1，抑制腎纖維化和細(xì)胞凋亡，緩解DN腎損傷。以上研究結(jié)果初步證實(shí)了G-Rh2在DN中的治療作用，為后期臨床應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。