雷書(shū)君，肖中舉

南方醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，廣東 廣州510515

許多哺乳動(dòng)物的聽(tīng)覺(jué)皮層（AC）具有一到三個(gè)初級(jí) 聽(tīng)覺(jué)區(qū)域和不同數(shù)量的高級(jí)聽(tīng)覺(jué)區(qū)域，其中初級(jí)聽(tīng)覺(jué)皮層（A1)被視為初級(jí)聽(tīng)覺(jué)區(qū)域的代表，次級(jí)聽(tīng)皮層（A2）被視為高級(jí)聽(tīng)覺(jué)區(qū)域的代表［1-2］。越來(lái)越多的證據(jù)表明，A2相對(duì)于A1神經(jīng)元，對(duì)簡(jiǎn)單的音調(diào)響應(yīng)不佳，對(duì)復(fù)雜聲音，包括通訊聲的響應(yīng)有一定的偏好［3-5］。通訊聲是生物間進(jìn)行信息交流的聲音，嚙齒類動(dòng)物的幼崽被擠壓時(shí)可以發(fā)出一種蠕動(dòng)呼叫聲（WC），這種聲音可以引起母親的母性反應(yīng)，包括舔幼崽，改變其哺乳位置，重新組織巢穴等行為上的相應(yīng)表現(xiàn)［6-10］。因此，可以用這種聲音來(lái)研究A2神經(jīng)元對(duì)通訊聲識(shí)別響應(yīng)的電生理特性，有助于為動(dòng)物間信息交流的機(jī)制提供電生理依據(jù)。

已有研究表明，聽(tīng)皮層對(duì)聲音信息的加工整合處理離不開(kāi)抑制性中間神經(jīng)元，皮層抑制性中間神經(jīng)元主要是以r氨基丁酸（GABA）為遞質(zhì)的神經(jīng)元，它對(duì)于大腦皮層加工和處理信息的功能至關(guān)重要，而小白蛋白（PV）神經(jīng)元和生長(zhǎng)抑素（SOM）神經(jīng)元的數(shù)量占所有占GABA能神經(jīng)元的百分之九十以上，其中PV神經(jīng)元的占比要SOM神經(jīng)元更高［11-13］。雖然目前普遍認(rèn)為PV抑制性神經(jīng)元是通過(guò)對(duì)興奮性神經(jīng)元的調(diào)諧作用來(lái)發(fā)揮對(duì)簡(jiǎn)單純音信息的加工整合作用［14-16］，但是在通訊聲識(shí)別響應(yīng)過(guò)程中，PV神經(jīng)元作用還未見(jiàn)報(bào)道，并且，當(dāng)前對(duì)通訊聲的研究還停留在分子和動(dòng)物行為學(xué)水平，缺乏對(duì)通訊聲加工處理機(jī)制的研究。

因此，本文通過(guò)使用在體清醒動(dòng)物單細(xì)胞貼附式技術(shù)，在單個(gè)細(xì)胞層面上探求A2神經(jīng)元對(duì)不同類型聲音的識(shí)別選擇機(jī)制，并通過(guò)區(qū)分A2興奮性神經(jīng)元和PV抑制性神經(jīng)元的不同電生理特性來(lái)分辨這兩種神經(jīng)元，進(jìn)而分析不同類型神經(jīng)元在A2加工處理通訊聲中的作用和地位，旨在為A2處理加工復(fù)雜通訊聲的機(jī)制提供細(xì)胞水平的電生理依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物手術(shù)

本實(shí)驗(yàn)所用的60只SPF級(jí)C57/6J雌性小鼠均由南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，周齡6～8周。手術(shù)前均使用戊巴比妥鈉（60～70 mg/kg，腹腔注射）麻醉雌性小鼠。然后在立體定位儀上對(duì)小鼠進(jìn)行定位，用牙桿固定小鼠嘴部，然后旋轉(zhuǎn)牙桿使老鼠頭背部向左傾斜50°后，固定牙桿。剪開(kāi)并除去小鼠顳區(qū)和頭部皮膚以及部分肌肉，用75%酒精擦拭過(guò)顱骨表面，去除顱骨表面黏膜，暴露A2并用顱骨鉆去除擬記錄區(qū)顳骨，充分暴露記錄區(qū)域腦組織，用凡士林保鮮膜保護(hù)好腦組織。在遠(yuǎn)離擬記錄區(qū)的非聽(tīng)覺(jué)核團(tuán)的顱骨表面轉(zhuǎn)孔并插入一根以AgCl為主要成分的參比電極，并用牙科水泥固定，之后在顱骨正中位置用牙科水泥固定一根金屬頭釘。手術(shù)結(jié)束后，將小鼠放回籠內(nèi)恢復(fù)至少2 d，作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的素材［17］。實(shí)驗(yàn)全過(guò)程均在南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物保護(hù)和使用管理委員會(huì)的批準(zhǔn)和監(jiān)督下進(jìn)行。

1.2 清醒動(dòng)物電生理記錄

在電生理記錄過(guò)程中，用金屬頭釘將老鼠的頭部固定，先在顯微鏡下去除記錄區(qū)域的覆蓋物和雜質(zhì)，再由PC-10垂直拉制儀采用兩步法拉制的玻璃微電極，拉制的電極電阻應(yīng)為6 MΩ左右，在電極內(nèi)灌注含0.3%神經(jīng)生物素的人工腦脊液（ACSF）。將玻璃微電極置于A2正上方，通過(guò)壓力表給電極內(nèi)4個(gè)大氣壓的正壓后，在顯微鏡下觀察并再次調(diào)整電極位置，將電極置于A2表面，并通過(guò)屏蔽室外的微操儀快速推進(jìn)100 μm，此時(shí)電極電阻顯示為6 MΩ左右，說(shuō)明儀器與動(dòng)物已經(jīng)連通，那么就將正壓減半，并保持正壓狀態(tài)，用推進(jìn)器緩慢推進(jìn)玻璃微電極尋找細(xì)胞。與此同時(shí)，通過(guò)觀察Clampex軟件中顯示的電極電阻是否增大來(lái)判斷電極是否碰觸到細(xì)胞。若觀察到電極電阻忽然增大到2 MΩ以上，并且有聲誘發(fā)動(dòng)作電位的發(fā)放時(shí)，把正壓撤掉，當(dāng)電阻穩(wěn)定后給予適當(dāng)負(fù)壓吸引，使電極與細(xì)胞貼附緊密。最后進(jìn)行不同聲音序列掃描，記錄該神經(jīng)元對(duì)不同聲音的相關(guān)數(shù)據(jù)［17］。

1.3 生物素免疫熒光染色

電壓鉗模式記錄結(jié)束后。將膜片鉗切換為電流鉗模式，通過(guò)玻璃電極注入2 nA的脈沖電流，每次1.2 s，持續(xù)30 min，讓電極內(nèi)含有的0.3%神經(jīng)生物素的細(xì)胞外液充分?jǐn)U散至整個(gè)記錄細(xì)胞。將小鼠放回鼠籠恢復(fù)2 h，之后用戊巴比妥鈉麻醉小鼠，采用心臟灌流法，依次用0.9%生理鹽水和4%多聚甲醛灌流，將小鼠斷頭并取出腦組織，用4%多聚甲醛浸泡過(guò)夜。次日沖水洗脫甲醛后，依次用20%蔗糖和30%蔗糖浸泡脫水過(guò)夜。待樣本完全沉底后，選取A2區(qū)域腦組織并切下，用OCT 包埋液包埋，用冰凍切片機(jī)切成150 μm厚度的腦片，用1×PBS 沖洗腦片3 遍，每次5 min，再用0.3%TritonX打孔孵育120 min，之后再用1×PBS沖洗腦片3遍，5 min/次，最后加入CY3（稀釋比例1∶200，稀釋液為1×PBS），常溫避光孵育240 min。孵育結(jié)束后，將腦片移至載玻片上待自然風(fēng)干后用含DAPI的抗熒光淬滅劑封片［18］，放入暗盒中保存，用共聚焦顯微鏡（Nikon,A1R）觀察腦片上神經(jīng)元的熒光表達(dá)情況［19-20］。

1.4 雙重免疫螢光

在聽(tīng)力屏蔽室內(nèi)給聲，以避免外界噪聲的干擾，將小鼠放置在飼養(yǎng)籠內(nèi)，并將飼養(yǎng)籠放在距離開(kāi)放場(chǎng)喇叭15 cm 處，給聲前老鼠應(yīng)在屏蔽室內(nèi)隔音、避光適應(yīng)24 h，開(kāi)放場(chǎng)給WC聲90 min（聲強(qiáng)：75 dB，給聲時(shí)長(zhǎng)：50 ms，給聲頻率：1/s）。給聲結(jié)束后，給與戊巴比妥鈉麻醉，隨后立刻采用心臟灌流法，依次用0.9%生理鹽水和4%多聚甲醛灌注，將小鼠斷頭并取出腦組織后，置于4%多聚甲醛過(guò)夜，次日沖水后，依次用20%蔗糖與30%蔗糖浸泡脫水固定，待樣本完全沉底后，進(jìn)行切片，切片厚度為每片50 μm。按照小鼠腦圖譜收集目標(biāo)核團(tuán)區(qū)域的腦片進(jìn)行免疫熒光染色。具體步驟如下：1×PBS漂洗3遍，每遍5 min；用0.03%TritonX孵育120 min；再用1×PBS漂洗3遍；山羊血清封閉2 h；C-FOS一抗4 ℃孵育 過(guò) 夜（C-FOS:SC-52，1∶2000，稀釋液為山羊血清）；復(fù)溫后用1×PBS 漂洗3 遍，每遍5 min；GABA 一抗4 ℃孵育過(guò)夜（Anti-GAD67 Antibody：clone 1G10.2，1∶500，稀釋液為山羊血清）；復(fù)溫后用1×PBS漂洗3遍，每遍5 min，二抗室溫避光孵育120 min[Alexa Fluor 568 goat anti-mouse IgG（H+L），1∶500；Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG（H+L），1∶500，稀釋液為PBS]，1×PBS漂洗8遍；移至干凈的載玻片上，待自然風(fēng)干后封片，使用共聚焦顯微鏡觀察，大腦切片經(jīng)免疫熒光染色后，使用綠色作為激發(fā)光，可檢測(cè)到GABAergric神經(jīng)元的胞膜為紅色熒光；使用藍(lán)光作為激發(fā)光，可檢測(cè)到表達(dá)C-FOS蛋白的神經(jīng)元胞體為綠色熒光，共聚焦顯微鏡觀察腦片神經(jīng)元不同熒光表達(dá)情況［21］。

1.5 聲音刺激

分組的標(biāo)準(zhǔn)及編譯：在記錄過(guò)程中用使用不同聲音刺激小鼠，記錄它的A2神經(jīng)元，使用為純音（Tone）和白噪音（Noise）作為對(duì)照組，是因?yàn)樗鼈兪遣粩y帶通訊信息的兩種經(jīng)典聲音類型；內(nèi)部頻率為4.5、9、13.5 kHz組成的WC錄制音，是因?yàn)閃C聲是攜帶通訊信息的聲音；用這3種頻率聲隨機(jī)組合的模擬WC聲，則是因?yàn)閃C模擬聲雖然并不是直接攜帶通訊信息的聲音，但是它們與WC錄制聲的組成組成成分和形式類似，可以用來(lái)探究，雌鼠是否可以分辨這些聲音。聲音是由TDT系統(tǒng)產(chǎn)生和播放，用RPvdsEx軟件將不同聲音混編成一個(gè)RCO文件用以合成聲音信號(hào)，聲音強(qiáng)度是由程序衰減器（PA5）來(lái)調(diào)節(jié)，并用開(kāi)放場(chǎng)揚(yáng)聲器播放。開(kāi)放場(chǎng)揚(yáng)聲器已用1/4寸麥克風(fēng)（丹麥，Brnel and Kjaer 4135）和聲強(qiáng)校正儀（Bruel and Kjaer 2610）進(jìn)行校正。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中由Brain Ware軟件進(jìn)行聲音參數(shù)的調(diào)整。聲音強(qiáng)度均為10～75 dB SPL，不同頻次刺激使用BrainWare軟件設(shè)置為隨機(jī)給聲的方式，記錄開(kāi)始后給聲，給聲頻率為1/s，重復(fù)20次，給聲時(shí)間均為50 ms，除WC錄制聲外，其他聲音上升、下降時(shí)間均為5 ms，WC聲為錄制乳鼠叫聲，最大聲強(qiáng)為75 dB。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

將記錄到的聲誘發(fā)電生理數(shù)據(jù)，通過(guò)Matlab、BrainWare、Excel等軟件進(jìn)行原始實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)（神經(jīng)元不同聲誘發(fā)的動(dòng)作電位發(fā)放數(shù)、延時(shí)及閾值等）的讀取，數(shù)據(jù)讀取后的處理、做圖主要通過(guò)Origin、Matlab、Adobe Illustrator軟件完成。采用Origin 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，神經(jīng)元對(duì)不同聲音誘發(fā)的動(dòng)作電位發(fā)放數(shù)、反應(yīng)延時(shí)等數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述。多組比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所有實(shí)驗(yàn)都是獨(dú)立重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 A2神經(jīng)元的電生理記錄模式和形態(tài)學(xué)特征

在電生理記錄過(guò)程中，通過(guò)金屬頭釘將小鼠側(cè)向固定在一鋼性結(jié)構(gòu)的金屬棒M上，防止小鼠的頭部移動(dòng)，掙脫電極，同時(shí)保證小鼠次級(jí)聽(tīng)皮層與試驗(yàn)臺(tái)平行。小鼠身體被放置在轉(zhuǎn)盤(pán)上，且不影響小鼠的行動(dòng)。E為電生理記錄用的玻璃微電極，記錄A2神經(jīng)元時(shí)，使電極與A2表面保持垂直，通過(guò)小鼠正前方15 cm處的一開(kāi)放場(chǎng)揚(yáng)聲器S給聲（圖1A）。在電生理記錄結(jié)束后，通過(guò)電流鉗將Biocytin注入細(xì)胞內(nèi)，用以標(biāo)記記錄神經(jīng)元的位置，以便判斷神經(jīng)元的真實(shí)深度與推進(jìn)器記錄深度的差異，該神經(jīng)元在A2區(qū)域內(nèi)，推進(jìn)器記錄它在腦表面以下623 μm處，細(xì)胞形態(tài)為多級(jí)樹(shù)突和高度分叉的軸突結(jié)構(gòu)（圖1B、C）。

圖1 A2神經(jīng)元的記錄和形態(tài)圖Fig.1 Electrophysiological recording mode and neuron location in the secondary auditory cortex (A2).A: In vivo electrophysiological recording mode chart.B:Neuron localization after recording in A2 (Original magnification:×4).C:Morphology of a cell(Biocytin staining:×20).

2.2 A2神經(jīng)元對(duì)聽(tīng)覺(jué)通訊信息響應(yīng)類型

通過(guò)在體電生理記錄，發(fā)現(xiàn)A2的聲誘發(fā)神經(jīng)元對(duì)各種模擬WC聲和Noise的響應(yīng)，主要表現(xiàn)出3種反應(yīng)類型：在WC聲刺激下的動(dòng)作電位數(shù)發(fā)放數(shù)明顯高于其他聲音刺激下的動(dòng)作電位發(fā)放數(shù)，我們將此反應(yīng)類型神經(jīng)元稱為A型神經(jīng)元（圖2A、D）；在WC聲刺激下的動(dòng)作電位數(shù)發(fā)放數(shù)和其他聲音下的動(dòng)作電位發(fā)放數(shù)沒(méi)有區(qū)別，我們將此反應(yīng)類型神經(jīng)元稱為B 型神經(jīng)元（圖2B、E）；對(duì)WC聲刺激下的動(dòng)作電位數(shù)發(fā)放數(shù)少于其他聲音刺激下的動(dòng)作電位發(fā)放數(shù)，我們將此反應(yīng)類型神經(jīng)元稱為C型神經(jīng)元（圖2C、F）。

圖2 三種對(duì)通訊信息敏感性不同的神經(jīng)元的示例Fig.2 Representative response patterns of 3 types of neurons with different sensitivity to communication sound.A-C:Poststimulus time histogram (PSTH) of different types of neurons.The blue shaded part represents the 50 ms sound stimulation interval.D-F:The number of action potential spikes by different types of neurons to different sound stimulations corresponding to the response patterns above.

2.3 三類神經(jīng)元在不同聲刺激誘發(fā)下的動(dòng)作電位發(fā)放數(shù)的比較

對(duì)記錄到的A2神經(jīng)元進(jìn)行分類，統(tǒng)計(jì)比較3類神經(jīng)元在不同聲刺激誘發(fā)下的動(dòng)作電位發(fā)放數(shù)（表1），在11例A類神經(jīng)元中，WC聲誘發(fā)的動(dòng)作電位發(fā)放數(shù)明顯高于其他聲音誘發(fā)的動(dòng)作電位發(fā)放數(shù)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。在18例B型神經(jīng)元中，統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)它對(duì)不同聲音誘發(fā)的動(dòng)作電位數(shù)沒(méi)有差異（P＞0.05）。對(duì)記錄到的8例C型神經(jīng)元在不同刺激聲下的動(dòng)作電位發(fā)放數(shù)的分析，發(fā)現(xiàn)C神經(jīng)元對(duì)各類聲音的響應(yīng)也沒(méi)有差異（P＞0.05）。

表1 A、B、C三類神經(jīng)元不同聲誘發(fā)動(dòng)作電位發(fā)放數(shù)Tab.1 Number of different acoustically evoked action potentials(Mean±SD)

2.4 三類神經(jīng)元的聲反應(yīng)特性

通過(guò)比較三類神經(jīng)元對(duì)不同聲音的反應(yīng)延時(shí)、閾值來(lái)分析其對(duì)不同聲音響應(yīng)的反應(yīng)特性［22］，在7例A類神經(jīng)元中，發(fā)現(xiàn)A類神經(jīng)元對(duì)WC聲的反應(yīng)閾值明顯低于對(duì)Tone和Noise的反應(yīng)閾值（P=0.02，圖3A）。10例B類神經(jīng)元對(duì)不同聲音的聲反應(yīng)閾值沒(méi)有明顯差異（P＞0.05，圖3B），6例C類神經(jīng)元對(duì)不同聲音的閾值普遍高于A類和B類神經(jīng)元，但對(duì)WC聲的聲反應(yīng)閾值，與對(duì)Tone和Noise的反應(yīng)閾值無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05，圖3C）。將聲音刺激后產(chǎn)生的大于基線發(fā)放數(shù)波動(dòng)3倍的動(dòng)作電位所需的時(shí)間記做反應(yīng)延時(shí)［23］，其中11例A類神經(jīng)元對(duì)WC聲（33.91±16.80）和Noise（23.09±11.57）的反應(yīng)延時(shí)都比對(duì)Tone（13.82±4.02）的反應(yīng)延時(shí)長(zhǎng)（P=0.002），而對(duì)Noise 和WC 聲的反應(yīng)延時(shí)則無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（圖3D）。18例B類神經(jīng)元對(duì)WC聲（23.05±20.37）、Noise（20.2±20.56）、Tone（18.7±17.31）的反應(yīng)延時(shí)沒(méi)有區(qū)別（P＞0.05，圖3E）。8 例C 類神經(jīng)元對(duì)WC 聲（33.63±14.93）和Noise（22.88±11.74）的反應(yīng)延時(shí)較Tone（9.88±4.82）的反應(yīng)延時(shí)長(zhǎng)（P=0.002），而對(duì)Noise和WC聲的反應(yīng)延時(shí)無(wú)區(qū)別（圖3F）。

圖3 不同類型的神經(jīng)元的聲反應(yīng)特性Fig.3 Acoustic response characteristics of different types of neurons.A-C:Thresholds of type A,B,and C neurons for different types of sound stimulations at different depths of the secondary auditory cortex,respectively.D-F:Latency of type A,B,and C neurons to different types of sounds,respectively.*P＜0.05.

2.5 A2中興奮性神經(jīng)元和PV抑制性神經(jīng)元的電生理特性比較

為了進(jìn)一步區(qū)分這三類神經(jīng)元，探究對(duì)通訊聲敏感程度不同神經(jīng)元是否與細(xì)胞類型的不同有關(guān)。通過(guò)典型的神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢徊ㄐ魏桶l(fā)放模式的不同，把興奮性神經(jīng)元與PV抑制性神經(jīng)元區(qū)分開(kāi)。對(duì)記錄到的特征明顯的神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢徊ㄐ魏桶l(fā)放方式進(jìn)行比較（圖4A），其中14例興奮性神經(jīng)元的P0/P1 比值（0.85±0.34），P-P 間距（0.36±0.09）與9例抑制性神經(jīng)元的的P0/P1比值（0.20±0.03），P-P間距（0.88±0.14），兩者差異明顯（圖4B）。通過(guò)一例興奮性神經(jīng)元和PV抑制性神經(jīng)元的PSTH圖以及通過(guò)對(duì)純音進(jìn)行強(qiáng)度和頻率掃描而確定的神經(jīng)元的感受野（TRF）進(jìn)行分析比較［24-25］（圖4C～F），發(fā)現(xiàn)在純音給聲區(qū)間的興奮性神經(jīng)元的動(dòng)作電位發(fā)放較PV抑制性神經(jīng)元的動(dòng)作電位發(fā)放更為集中，PSTH圖右上角為該神經(jīng)元的動(dòng)作電位波形（圖C、E）。興奮性神經(jīng)元在最大的聲音強(qiáng)度下的TRF偽彩圖帶寬比PV抑制性神經(jīng)元窄，右側(cè)的彩色標(biāo)尺表示顏色越紅動(dòng)作電位發(fā)放數(shù)越多（圖4D、F）。其中A類神經(jīng)元中興奮性神經(jīng)元有3例，PV抑制性神經(jīng)元有7例。B類神經(jīng)元中興奮性神經(jīng)元有12例，PV抑制性神經(jīng)元有1例。C類神經(jīng)元中興奮性神經(jīng)元有4例，PV抑制性神經(jīng)元有1例。

圖4 興奮性神經(jīng)元和PV抑制性神經(jīng)元電生理特性Fig.4 Electrophysiological characteristics of the excitatory neurons and PV inhibitory neurons.A:Action potential waveforms and firing patterns of the excitatory neurons and PV inhibitory neurons.B:Relationship between P1/P0 ratio and P-P interval of two types of neuron action potential waveforms.C:Post-stimulus time histograms of inhibitory PV neurons.the blue shaded part represents the sound stimulation duration of 50 ms.D:Pseudo-color picture of the receptive field obtained by the inhibitory PV neuron stimulated with the pure tones of different frequencies and intensities.E:Post-stimulus time histograms of excitatory neuron.The blue shaded part represents the sound stimulation duration of 50 ms.F:Pseudo-color image of the receptive field obtained by excitatory neurons stimulated with the pure tones of different frequencies and intensities.

2.6 免疫熒光雙染的特點(diǎn)

雙重免疫熒光染色提示：A2中具有聲誘發(fā)反應(yīng)的GABA能中間神經(jīng)元的比例較少（圖5A），箭頭所指的神經(jīng)元代表同時(shí)表達(dá)CFOS蛋白和GABAergic神經(jīng)元（圖5B），但是從嘴端到尾端的腦片染色情況分析（圖5C），發(fā)現(xiàn)對(duì)聲音響應(yīng)的表達(dá)CFOS 蛋白的神經(jīng)元（37.70±7.41）的數(shù)量遠(yuǎn)高于同時(shí)表達(dá)CFOS 蛋白的GABAergic神經(jīng)元數(shù)目（6.30±1.83）（圖5C），且兩者之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.001，圖5D）。

3 討論

已有文獻(xiàn)報(bào)道，母鼠在行為測(cè)試中對(duì)不同蠕動(dòng)呼喚模型表現(xiàn)出行為上的差異。根據(jù)CFOS染色結(jié)果提示，這種行為上的差異在A2中同樣存在，在A2，WC聲引起的CFOS 蛋白陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量要多于其他聲音引起的CFOS蛋白陽(yáng)性數(shù)，而在A1則不體現(xiàn)這種差異性［5,7,26］，同時(shí)，低位聽(tīng)覺(jué)中樞可以對(duì)WC聲響應(yīng)，但是沒(méi)有特異性［27,28］。本實(shí)驗(yàn)中，我們運(yùn)用在體清醒動(dòng)物細(xì)胞貼附式技術(shù)，發(fā)現(xiàn)高級(jí)聽(tīng)覺(jué)中樞A2中存在一定比例的對(duì)復(fù)雜通訊聲敏感的神經(jīng)元，這與之前文獻(xiàn)報(bào)道，A2是處理復(fù)雜聲的重要核團(tuán)的結(jié)果相似，我們的結(jié)果進(jìn)一步從細(xì)胞電生理水平證明了A2是聽(tīng)皮層處理復(fù)雜聲的重要核團(tuán)［29］。

現(xiàn)有研究結(jié)果表明，聽(tīng)皮層對(duì)簡(jiǎn)單音調(diào)信息的加工整合處理離不開(kāi)抑制性中間神經(jīng)元［30］，其中PV中間抑制性神經(jīng)元在皮層加工處理信息中發(fā)揮重要作用，SOM中間抑制性神經(jīng)元?jiǎng)t是在下丘加工處理信息時(shí)發(fā)揮作用［31］。本實(shí)驗(yàn)首次在細(xì)胞水平上研究A2對(duì)WC聲的識(shí)別響應(yīng)，并通過(guò)比較A2中興奮性神經(jīng)元和PV抑制性神經(jīng)元的不同電生理特性以及不同的細(xì)胞形態(tài)特征，將A2中對(duì)通訊聲敏感的神經(jīng)元進(jìn)行區(qū)分，發(fā)現(xiàn)對(duì)通訊聲敏感的A類神經(jīng)元中存在很大比例的PV抑制性神經(jīng)元。免疫熒光雙染的結(jié)果也顯示，A2中對(duì)WC聲響應(yīng)的神經(jīng)元中存在GABA能抑制性中間神經(jīng)元，而PV抑制性中間神經(jīng)元是GABA能中間神經(jīng)元的主要組成部分，我們的結(jié)果也從免疫熒光染色及單細(xì)胞水平證明了A2對(duì)復(fù)雜聲音的加工整合也離不開(kāi)PV抑制性神經(jīng)元的作用。因此，我們認(rèn)為A2對(duì)復(fù)雜聲音的機(jī)制應(yīng)該為：A2存在對(duì)聲音響應(yīng)模式不同的興奮性神經(jīng)元和PV抑制性神經(jīng)元，PV神經(jīng)元通過(guò)高頻率的動(dòng)作電位的發(fā)放模式，表現(xiàn)出對(duì)復(fù)雜通訊信息的特異性響應(yīng)，并通過(guò)降低閾值、增加反應(yīng)延時(shí)來(lái)提高對(duì)復(fù)雜通訊聲的識(shí)別能力，然后A2神經(jīng)元再將這些信息進(jìn)行整合匯總，傳遞至下一神經(jīng)元，最終機(jī)體對(duì)這個(gè)聲音做出相應(yīng)的行為表現(xiàn)。

我們的發(fā)現(xiàn)補(bǔ)充并擴(kuò)展了先前的研究，以往的研究表明，抑制性神經(jīng)元通過(guò)增強(qiáng)或抑制皮層感覺(jué)神經(jīng)元的感受野對(duì)聽(tīng)覺(jué)加工敏銳度具有直接的影響［32］。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用在體電生理技術(shù)，發(fā)現(xiàn)了A2對(duì)復(fù)雜通訊聲及無(wú)意義的通訊模擬聲的電生理響應(yīng)特性的不同，這種電生理響應(yīng)特性的不同與PV神經(jīng)元直接相關(guān)，同時(shí)電生理特性的變化改善了對(duì)通訊聲的辨別力，也增加了對(duì)通訊聲的響應(yīng)，有助于進(jìn)一步理解通訊信息的識(shí)別在機(jī)體做出相應(yīng)反應(yīng)中發(fā)揮的作用。