王晶波，楊 倬，秦 文，王麗媛，陳 曦，卓 勤，宮照龍，沈 葹

尋找和開發(fā)安全性高、天然、無毒的抗氧化物質(zhì)是近幾十年來功能性食品研究的熱點[1]。選擇恰當準確的評價方法來評價其抗氧化活性至關重要?？寡趸钚栽u價方法主要包括體內(nèi)動物試驗、體外化學評價方法和細胞抗氧化評價方法。體內(nèi)動物試驗[2-3]是評價抗氧化活性較好的方法，然而，其成本高、周期長，不適于大批量樣品的初篩操作；體外化學評價方法包括1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2，2'-聯(lián)氮雙-（3-乙基苯并噻唑林-6-磺酸）二胺鹽（ABTS）和氧化自由基吸收能力（oxygen radical absorbance capacity，ORAC）等[4-8]，具有成本低、檢測快、結果穩(wěn)定等優(yōu)點，然而，化學評價方法僅關注食物的抗氧化值，未考慮抗氧化成分在細胞內(nèi)的生物利用率、吸收和代謝等情況，因此不能反映細胞生理條件和作用機制。

細胞抗氧化評價方法能夠反映抗氧化物質(zhì)在細胞內(nèi)的吸收、代謝和分布等情況，相比于體內(nèi)試驗和體外化學評價方法，具有準確、用時少、成本低的特點[9]，是目前評價抗氧化物質(zhì)的一種相對科學、合理的方法。Wolfe 等[10]建立的細胞抗氧化活性（cellular antioxidant activity，CAA）評價方法是以人體肝癌細胞HepG2 為試驗模型，觀察抗氧化物質(zhì)在細胞中的反應情況，繼其之后，許多研究小組建立了其它細胞模型（如Caco-2、AGS、RBC）[11-13]的抗氧化活性評價方法，豐富和創(chuàng)新了細胞抗氧化評價方法。同時，也有研究者發(fā)現(xiàn)不同的細胞模型適用于不同的抗氧化物質(zhì)的活性檢測[14]，因此，對細胞抗氧化評價方法的細胞模型的篩選是必不可少的。

牛肝菌是一種食藥兼用的大型真菌，富含多酚、多糖、萜類[15-16]等抗氧化活性物質(zhì)。目前評價牛肝菌多酚抗氧化活性的研究多集中在體外化學評價法。本文采用氧化自由基吸收能力和細胞抗氧化評價方法綜合評價牛肝菌多酚的抗氧化活性，比較Caco-2、L02 和HepG2 3 種細胞模型檢測多酚濃度范圍、靈敏度方面的差異，確定能準確評價牛肝菌多酚抗氧化活性的細胞評價模型，為抗氧化物質(zhì)的活性評價方法提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 主要樣品、試劑與儀器

野生牛肝菌干貨樣品（市售）分別購自云南不同產(chǎn)地，將樣品粉碎，過120 目篩后置陰涼干燥處備用。3 種牛肝菌名稱（產(chǎn)地）分別為紅牛肝菌（普洱）、黃牛肝菌（大姚）、黑牛肝菌（師宗），設為樣品1～3 號。

Caco-2 和L02（編號為FH0029 和FH0099），上海富衡生物科技有限公司；HepG2（編號SCSP-510），上海生科院；MEM 和胎牛血清，HyClone 公司；1640 培養(yǎng)液、0.25%胰蛋白酶-EDTA，Gibco 公司；Cell Counting Kit-8 試劑盒（CCK-8 試劑盒），北京索萊寶科技有限公司。

沒食子酸標準品（89.9%），中國食品藥品檢定院；槲皮素標準品（95%）、左旋抗壞血酸（SLBL9227V）、Folin-Ciocalteu 試劑、2’，7’-二氯熒光黃雙乙酸鹽（DCFH-DA）、2，2’-偶氮二異丁基咪二鹽酸鹽（AAPH）、碳酸鈉、熒光素鈉（FL），Sigma Aldrich 公司。

酶標儀SpectraMax i3x，基因有限公司；KQ-600DB 型數(shù)控超聲波清洗器（功率600 W，頻率40 000 Hz），昆山市超聲儀器有限公司；CO2培養(yǎng)箱，Panasonic 公司。

1.2 牛肝菌多酚提取及含量測定

采用超聲波提取法最佳工藝提取3 種牛肝菌多酚[15]。每種樣品稱取1 g 粉末，按照液料比為44∶1，加入85%的乙醇溶液，超聲38 min 后4 500 r/min 離心15 min，吸取上清液并用85%乙醇溶液定容至50 mL，即為牛肝菌多酚提取液，于-20 ℃保存?zhèn)溆?。采用Folin-Ciocalteu 比色法測定多酚含量，在96 孔板上分別加入30 μL 的多酚提取液樣品、150 μL Folin-Ciocalteu 試劑（0.2 N）和120 μL 碳酸鈉溶液（75 g/L），室溫暗處反應2 h 后，在酶標儀于760 nm 下測定吸光度，以沒食子酸（8.75，17.5，35，70，140 和280 μg/mL）為對照品繪制標準曲線，獲取多酚含量以每克食用菌中沒食子酸當量計。

1.3 氧化自由基吸收能力試驗ORAC

本試驗參考Huang 等[17]方法并加以改進。具體操作步驟為：首先向96 孔板中加入不同濃度樣品、抗壞血酸標準品以及PBS（空白孔和陽性對照孔）25 μL，平行操作3 次，再向各孔加入150 μL FL 工作液，振蕩5 s，37 ℃溫育10 min。然后向各孔中迅速加入25 μL AAPH（除空白孔），以激發(fā)波長（485±20）nm、發(fā)射波長（530±20）nm 連續(xù)測定熒光強度，整個體系保持37 ℃，每1 min 測定1次熒光強度，每次測定前中速振動孔板10 s，振蕩幅度4 mm，測定時間設定在熒光衰減呈基線后為止（本試驗設置60 個循環(huán)），測定結果以ORAC 值表示。待測樣品的ORAC 值以μmol/L 表示，即抗壞血酸當量。計算公式為：

式中：AUC樣品——樣品作用下的各微孔熒光衰退曲線下面積；AUC抗壞血酸——抗壞血酸作用下的熒光衰退曲線下面積；AUC對照——僅有AAPH作用下的熒光衰退曲線下面積；C抗壞血酸——標準品的濃度，μmol/L。

1.4 細胞培養(yǎng)

Caco-2 和HepG2 細胞采用MEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)（胎牛血清量分別為15%和10%），L02 細胞采用含10%胎牛血清的1640 培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為37 ℃、5% CO2飽和濕度，當細胞生長至培養(yǎng)瓶底面積80%左右時傳代，培養(yǎng)期間隔天換液，試驗用細胞代數(shù)小于35 代。

1.5 細胞毒性試驗

方法參照CCK-8 檢測試劑盒說明。細胞于96 孔板上按照6×104個/孔接種，每孔加入100 μL 細胞液，37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)24 h，需留有無細胞孔做為空白孔。棄去培養(yǎng)液，用不含血清的培養(yǎng)液洗滌細胞2 次后加入100 μL 不含血清的培養(yǎng)液，再加入10 μL 不同濃度的牛肝菌多酚提取液，孵育24 h 后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1 h。用酶標儀測定在450 nm 處的吸光度。

式中：A樣品——有細胞、CCK-8 溶液和樣品溶液的孔的吸光度值；A空白——沒有細胞、有CCK-8 溶液的孔的吸光度值；A對照——有細胞、CCK-8 溶液而沒有樣品溶液的孔的吸光度值。

細胞活力在90%以上為樣品溶液無細胞毒性，樣品濃度安全。

1.6 細胞抗氧化活性試驗

細胞抗氧化活性試驗過程和CAA 值計算方法參考文獻[10、18]，并略有調(diào)整。細胞培養(yǎng)至足夠數(shù)量，將對數(shù)生長期的細胞接種到96 孔板，每孔100 μL，每孔細胞數(shù)約為6×104個，于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h 后，移去培養(yǎng)液，用PBS 清洗1 次后每孔加入100 μL 樣品處理液（含DCFHDA，終濃度為 25 μmol/L）以及標準品槲皮素（終質(zhì)量濃度為0，0.5，2.5，5，10，12，15，20，30，50 mg/L），平行3 孔，96 孔板周圍孔棄用。37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)1 h 后，棄去培養(yǎng)液，每孔加入100 μL 的600 μmol/L AAPH，用熒光酶標儀（激發(fā)波長538 nm、發(fā)射波長485 nm，恒溫37 ℃）每5 min測定1 次熒光值，持續(xù)測定1 h。兩步操作中，空白組用培養(yǎng)液處理，對照組用DCFH-DA 和AAPH處理，操作中使用的試劑均用無血清細胞培養(yǎng)液配制。

CAA 值計算：空白孔調(diào)零后，譜出熒光值隨時間的變化曲線，由曲線下面積計算抗氧化物質(zhì)的CAA 值。

式中：∫SA——樣品時間-熒光值曲線下的積分面積；∫CA——對照時間-熒光值曲線下的積分面積。

樣品的半數(shù)有效濃度（EC50）根據(jù)lg（fa/fu）對lg（樣品濃度）的中效原理來計算，fa 表示樣品作用效應（CAA unit），fu 表示100-CAA unit，EC50值以3 次平行試驗計算得出。以每個96 孔板中測量的槲皮素作為標準，將牛肝菌多酚的CAA 計算為每100 g 牛肝菌的槲皮素（QE）微摩爾當量。使用Excel 處理數(shù)據(jù)，SPSS 軟件分析EC50值，Origin 軟件作圖。

1.7 細胞抗氧化活性試驗細胞種類的確定

采用1.6 節(jié)的方法，基于Caco-2、L02 和HepG2 3 種細胞來測定黃牛肝菌多酚的細胞抗氧化活性，比較三者在檢測多酚濃度范圍、靈敏度方面的差異，確定適宜牛肝菌多酚細胞抗氧化活性測定的細胞種類。采用適宜細胞測定紅牛肝菌、黃牛肝菌和黑牛肝菌3 種牛肝菌多酚的細胞抗氧化活性，并與牛肝菌的多酚提取率、ORAC 進行相關性分析，驗證方法的有效性和準確性。

2 結果與討論

2.1 多酚含量和ORAC 測定結果

采用超聲波提取法提取3 種牛肝菌多酚，并測定多酚提取率，結果見表1，標準曲線為y=0.0071x+0.0569，R2=0.9972。3 種牛肝菌之間多酚提取率差異不大，從高到低依次為黃牛肝菌、紅牛肝菌和黑牛肝菌。牛肝菌氧化自由基吸收能力試驗檢測，以時間（min）為橫坐標，熒光單位為縱坐標，繪制抗壞血酸標準溶液和不同種類牛肝菌多酚的熒光強度隨時間衰減曲線，如圖1所示。物質(zhì)的抗氧化活性高者，熒光強度隨時間衰減速度緩慢，從圖1b 中可以看出黃牛肝菌多酚抗氧化活性最高，紅牛肝菌和黑牛肝菌多酚次之，這與牛肝菌多酚提取率高低順序一致。

圖1 抗壞血酸標準品和不同種類牛肝菌多酚熒光強度隨時間衰減曲線Fig.1 The decay curve of fluorescence intensity of ascorbic acid standard and boletus polyphenols with time

表1 3 種牛肝菌多酚提取率和ORAC 值測定結果Table 1 Results of the extraction rates of polyphenol and ORAC value of three varieties of boletus

2.2 細胞抗氧化活性試驗的細胞篩選結果

細胞毒性試驗證明牛肝菌多酚無細胞毒性。采用Caco-2、L02 和HepG2 3 種不同細胞模型來測定黃牛肝菌多酚的細胞抗氧化活性，計算得出QE 當量值分別為23.681，9.367，8.118 μmol QE·（100g）-1。如圖2所示，3 種細胞都可以作為多酚細胞抗氧化活性測定模型的細胞基礎，抗氧化活性均隨著多酚濃度增大而升高，但不同細胞模型的抗氧化活性的檢出限不同，Caco-2、L02 和HepG2 分別為0.025，0.1，0.2 g 黃牛肝菌提取的多酚，Caco-2 曲線的R2值（R2=0.9653）更接近1，Caco-2 細胞模型明顯優(yōu)于L02 和HepG2 模型，采用Caco-2 來測定牛肝菌多酚的細胞抗氧化活性，結果更靈敏與準確。

圖2 基于3 種細胞模型的黃牛肝菌多酚的細胞抗氧化活性比較Fig.2 Comparison of cellular antioxidant activity of polyphenols from Boletus auripes based on 3 cell models

2.3 基于Caco-2 細胞的牛肝菌多酚細胞抗氧化能力試驗結果

采用Caco-2 細胞模型測定3 種牛肝菌多酚的抗氧化能力，選取0.025，0.05，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 g 牛肝菌提取的多酚，由圖3可知，牛肝菌多酚能有效抑制Caco-2 細胞中DCFH 向DCF 轉(zhuǎn)化，隨著多酚濃度的升高，細胞內(nèi)熒光物質(zhì)的生成減少，當多酚為0.5 g 牛肝菌提取時，細胞內(nèi)熒光強度最低，即此時樣品的細胞抗氧化能力最強。計算得出3 種牛肝菌多酚QE 當量的高低順序與多酚含量和ORAC 值順序一致，均為黃牛肝菌、紅牛肝菌和黑牛肝菌，相關系數(shù)分別為0.9662 和0.9156，呈顯著正相關，即多酚含量高的牛肝菌，其體外抗氧化能力和細胞抗氧化能力均較高（表2、表3）。

圖3 牛肝菌多酚（b，c，d）和標準品槲皮素（a）抑制Caco-2 細胞中DCFH 向DCF 轉(zhuǎn)化的動力學曲線（±s，n=3）Fig.3 The kinetic curve of the inhibition of the conversion of DCFH to DCF in Caco-2 cells by boletus polyphenols（b，c，d）and standard quercetin（a）（±s，n=3）

表2 牛肝菌多酚提取率、ORAC 值和CAA 值的檢測結果Table 2 Results of the extraction rates of polyphenol and ORAC value and CAA value of boletus

表3 牛肝菌多酚提取率與細胞抗氧化活性相關性分析Table 3 Correlation analysis of polyphenol extraction rate and cellular antioxidant capacity from boletus

3 結論

抗氧化活性評價方法多種多樣，采用細胞抗氧化評價方法具有準確、用時少、成本低的特點，同時也能滿足樣品高通量測定要求，研究者需根據(jù)研究樣品來確定不同的細胞抗氧化研究模型，Caco-2、L02 和HepG2 3 種細胞相比較，Caco-2細胞模型更適用于牛肝菌多酚細胞抗氧化活性檢測，并且可以與ORAC 等體外化學評價方法聯(lián)合評價牛肝菌多酚的抗氧化活性。

牛肝菌多酚抗氧化活性強，黃牛肝菌ORAC值高達223.68 μmol AEAC/g，CAA 值達到23.68 μmol QE/100 g，不同種類牛肝菌多酚抗氧化活性高低不同，這為食品加工原料時選擇適宜品種提供參考，也為牛肝菌作為營養(yǎng)性、功能性的菌類食品的研發(fā)提供了理論依據(jù)。