杜映雪，李 靜，陳孫妮，李 娟，鄧澤元

肥胖作為全球性的健康問題，其發(fā)生會增加糖尿病、高血壓和冠心病等疾病的發(fā)病率[1]。運(yùn)動不足、飲食結(jié)構(gòu)不合理、激素分泌異常、遺傳等許多因素可導(dǎo)致肥胖，而高脂飲食伴隨的過量卡路里攝入是導(dǎo)致肥胖發(fā)生的首要因素。治療肥胖的首選為調(diào)整飲食結(jié)構(gòu)，控制飲食中的脂肪總量[2]。然而，脂肪為機(jī)體提供必需脂肪酸、脂溶性維生素和能量，過分降低膳食中脂肪量不可取。尋找符合營養(yǎng)需求同時具有減重功效的產(chǎn)品，對于改善機(jī)體脂代謝，預(yù)防一系列并發(fā)癥尤其是心血管疾病的發(fā)生以及促進(jìn)人類健康具有重大意義。為此，可從膳食脂肪的結(jié)構(gòu)出發(fā)，尋找膳食脂肪的替代品。中長鏈甘油三酯（medium and long-chain triacylglycerols，MLCT）是一種由天然油脂通過改性或結(jié)構(gòu)重組得到的結(jié)構(gòu)脂質(zhì)（structured lipid，SL），其在一個甘油三酯分子上同時結(jié)合有中鏈脂肪酸（medium chain fatty acid，MCFA） 和長鏈脂肪酸（long chain fatty acid，LCFA）[3]。研究表明，MCFA與LCFA 的生理代謝途徑有著明顯差異：MCFA有較短的碳鏈，在體內(nèi)吸收代謝速率快，可直接通過門靜脈進(jìn)入肝臟氧化供能；而LCFA 的碳鏈較長，在體內(nèi)代謝效率低，極易形成新的甘油三酯并貯藏在脂肪或肝臟等組織中[4]。國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，MLCT 能加快脂質(zhì)在體內(nèi)的代謝速率，降低血脂、弱化脂蛋白代謝，減少脂肪蓄積[5-7]；可快速為機(jī)體供能[8]，有助于提高免疫力，降低炎癥反應(yīng)，預(yù)防2型糖尿病以及降低癌癥發(fā)生風(fēng)險[9-10]。MLCT 既保留了天然油脂的營養(yǎng)價值，又在其基礎(chǔ)上降低油脂的熱量，在食品和醫(yī)藥方面都有著廣泛應(yīng)用[11]。MLCT 有可能代替?zhèn)鹘y(tǒng)食用油脂，成為一種理想的功能型食用油。MLCT 對于機(jī)體的減脂作用已有研究，而MLCT 是否對于肝臟的脂質(zhì)代謝有快速且明顯的改善作用，國內(nèi)鮮有報道。本試驗以SD 大鼠為研究對象，對其給予由高油酸菜籽油（high oleic rapeseed oil，HORO）和中鏈甘油三酯（medium-chain triacylglycerols，MCT）通過酯交換反應(yīng)合成的中長鏈甘油三酯，并通過與HORO 和MCT 的對比，探究短期內(nèi)含有MLCT 的飲食對于動物肝臟脂肪酸組成和脂質(zhì)代謝的影響，從而驗證MLCT 對脂質(zhì)代謝改善和肥胖預(yù)防的功效。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

SPF 級雄性SD 大鼠，初始體重為（100±10）g，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗動物有限公司提供（SCXK（湘）2016-0002）。

中長鏈甘油三酯（MLCT）通過實(shí)驗室方法[12]合成，所得產(chǎn)品油中MLCT 含量為71.1%；高油酸菜籽油（HORO），秦皇島金海特種食用油工業(yè)有限公司；中鏈甘油三酯油（MCT），DUBOIS-NATURAL ESTERS SDN.BHD.公司；3 種油脂的脂肪酸組成見表1?？偟鞍锥繙y定試劑盒、甘油三酯（TG）測定試劑盒、總膽固醇（TC）測定試劑盒、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoproteincholesterol，HDL-C）測定試劑盒、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein-cholesterd，LDLC）測定試劑盒、載脂蛋白A1（apolipoprotein A1，Apo A1）測試盒、載脂蛋白B（apolipoprotein B，Apo B）測試盒、激素敏感脂肪酶（HSL）試劑盒、環(huán)磷酸腺苷（cAMP）測試盒、蛋白激酶A（PKA）試劑盒、脂肪甘油三酯脂酶（ATGL）試劑盒，南京建成生物工程研究所；普通大鼠全價混合飼料，南昌大學(xué)動物科學(xué)部；GLC-463 脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品，美國NU-CHEK-PREP 公司；正己烷（色譜純），德國Meker 公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

表1 3 種脂質(zhì)的脂肪酸組成Table 1 Fatty acid compositions of the three lipids

MK3 型多功能酶標(biāo)儀，芬蘭Thermo 公司；6890N 型氣相色譜儀，美國Agilent 公司；AR1140電子分析天平，美國奧豪斯貿(mào)易公司；HH-S11 型電熱恒溫水浴鍋，北京醫(yī)用離心機(jī)廠；TDL-40B 型臺式離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；WH-866 渦旋混合器，太倉市科教器材廠；DSY-III 氮吹儀，北京金科精華苑科技有限公司；LGR-10 型冷凍離心機(jī)，鄭州博科儀器有限公司；F6/10 超細(xì)勻漿機(jī)，廣州深華公司，CNWBOND NH2氨基SPE 小柱，上海安譜實(shí)驗科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 動物飼喂及分組 32 只雄性SD 大鼠飼養(yǎng)于南昌大學(xué)實(shí)驗動物科學(xué)中心標(biāo)準(zhǔn)動物房。大鼠飼養(yǎng)溫度控制在25 ℃左右，光照、黑暗時間為12 h，環(huán)境濕度為60%，所有實(shí)驗大鼠均自由攝食基礎(chǔ)飼料和水?；A(chǔ)飼料的營養(yǎng)組成見表2。適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，稱量大鼠空腹體重，并隨機(jī)分成4組，每組8 只：1）空白對照組（Control 組）：每日以1 g/100 g 體重的劑量灌胃生理鹽水；2） 中長鏈甘油三酯組（MLCT 組）：每日以1 g/100 g 體重的劑量灌胃MLCT；3）中鏈甘油三酯組（MCT 組）：每日以1 g/100 g 體重的劑量灌胃MCT；4）高油酸菜籽油組（HORO 組）：每日以1 g/100 g 體重的劑量灌胃HORO。所有大鼠的喂養(yǎng)時間為2 周。

表2 基礎(chǔ)飼料的營養(yǎng)組成Table 2 Nutritional compositions of the basic diet

1.2.2 樣本處理 喂養(yǎng)結(jié)束后，禁食12 h，稱量各組大鼠體重；乙醚麻醉，眼眶采血于含EDTA 的抗凝管中，室溫下靜止30 min，2 500 r/min 離心10 min，收集上層透明液體即為血漿，-80 ℃保存以備用。大鼠解剖后，取肝臟組織，用生理鹽水清洗后稱重，保存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 血漿中指標(biāo)的測定 按照試劑盒說明書方法測定血漿中TG、TC、HDL-C、LDL-C 含量，并計算HDL-C/LDL-C 比值。

1.2.4 肝臟中脂代謝指標(biāo)的測定 稱取大鼠肝臟，按質(zhì)量（g）∶體積（mL）=1∶9 的比例加入生理鹽水，冰水浴條件下機(jī)械勻漿1 min，2 500 r/min離心10 min，取上清液，按照試劑盒說明書測定TG、TC、總蛋白含量；按照ELISA 試劑盒測定方法測定大鼠肝臟中Apo A1、Apo B 的濃度以及脂質(zhì)代謝相關(guān)酶ATGL、HSL、PKA、cAMP 的表達(dá)水平。

1.2.5 肝臟中甘油三酯、磷脂脂肪酸組成的測定首先對肝臟內(nèi)的總脂肪采用Folch 法進(jìn)行提取[13]，后用丙基硅膠固相萃取小柱分離出總脂肪中的TG、PL，方法如下：取2 mg 脂質(zhì)樣品，將其溶解于0.5 mL 氯仿溶液中。以6 mL 正己烷溶液活化固相萃取小柱，加入樣品，首先以4 mL 氯仿-異丙醇（2∶1，V/V）溶液洗脫，收集洗脫液為中性脂質(zhì)，再以4 mL 乙酸-乙醚（2∶98，V/V）溶液洗脫，除去游離脂肪酸，最后以4 mL 甲醇溶液洗脫，收集洗脫液為磷脂，氮?dú)獯蹈?。中性脂質(zhì)用氮?dú)獯蹈珊?，加?.2 mL 正己烷溶液溶解，另取一根固相萃取小柱，以正己烷溶液活化后，首先以正己烷溶液洗脫，除去膽固醇酯，再以6 mL 乙醚-二氯甲烷-正己烷（1∶10∶89，V/V）溶液洗脫，收集洗脫液為甘油三酯，并用氮?dú)獯蹈伞?/p>

將收集到的甘油三酯、磷脂分別溶解于1.5 mL 正己烷溶液后，進(jìn)行堿法甲酯化[14]。氣相色譜法測定兩者的脂肪酸組成。氣相色譜法條件：CPSil 88 熔融石英毛細(xì)管柱（100 m×0.25 mm×0.2 μm，美國Agilent 公司）。載氣為氫氣，燃燒氣為氫氣、氮?dú)夂涂諝?。FID 溫度為250 ℃，進(jìn)樣口溫度為250 ℃。升溫程序：45 ℃保持4 min，以13 ℃/min的速率升至175 ℃，保持27 min，再以4 ℃/min 升至215 ℃，保持35 min；進(jìn)樣量：0.3 μL，不分流。脂肪酸的百分含量采用面積歸一化法確定（以峰面積的百分比表示）。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 攝食不同脂質(zhì)對大鼠體重及肝臟質(zhì)量的影響

大鼠體重及肝臟質(zhì)量見表3。由表3可知，各組大鼠的攝食量、初始體重?zé)o顯著差異（P>0.05）。試驗結(jié)束時，各組間大鼠的最終體重、體重增加量與增長率雖無統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05），但是在4 個組中，對照組大鼠有最小的體重增長率（57.70%），其次為MCT 和MLCT 組，體重增長率分別為（59.35±5.56）%和（62.82±6.25）%，HORO 組有最大的體重增長率（63.55±3.53）%。說明MCT和MLCT 具有降低大鼠體重的趨勢。與對照組相比，只有HORO 組大鼠的肝臟質(zhì)量有顯著性升高（P<0.05），且顯著性高于MLCT 和MCT 組（P<0.05）。

表3 攝食不同脂質(zhì)對SD 大鼠體重及肝臟質(zhì)量的影響（n=8）Table 3 Effects of feeding different lipids on body weight and liver weight of SD rats（n=8）

2.2 攝食不同脂質(zhì)對大鼠血脂的影響

大鼠血脂的變化見表4。由表可知，MLCT 組大鼠血漿中TG、TC 濃度為各試驗組中最低，而HORO 組具有最高的TG、TC 濃度，兩組間有顯著差異（P<0.05）。4 組動物血漿中HDL-C 含量無顯著差異，但HORO 組HDL-C 的濃度最低。與對照組相比，3 個試驗組的大鼠血漿中LDL-C 含量均有一定程度升高，其中，HORO 組LDL-C 含量顯著高于對照組（P<0.05）。3 種脂質(zhì)的攝入均顯著降低了HDL-C/LDL-C 比值（P<0.05），其中，HORO組的HDL-C/LDL-C 比值最低，為2.73±0.85。

表4 攝食不同脂質(zhì)對SD 大鼠血漿中各指標(biāo)的影響（n=8）Table 4 Effects of feeding different lipids on indexes in plasma of SD rats（n=8）

2.3 攝食不同脂質(zhì)對大鼠肝臟中脂代謝指標(biāo)的影響

大鼠肝臟中脂代謝指標(biāo)見表5。由表5可知，與對照組和HORO 組相比，MLCT 和MCT 組SD大鼠肝臟中TC 含量均有顯著性降低（P<0.05）；TG 含量雖有降低的趨勢，但無顯著性差異（P>0.05）。

表5 攝食不同脂質(zhì)對SD 大鼠肝臟中脂代謝指標(biāo)的影響（n=8）Table 5 Effects of feeding different lipids on indexes of lipid metabolism in livers of SD rats（n=8）

MLCT 和MCT 組大鼠肝臟中的Apo A1 含量均顯著性高于HORO 組（P<0.05），但與對照組無顯著差異。MLCT 和MCT 也升高了Apo B 含量，特別是MLCT 組Apo B 含量顯著高于HORO 組和對照組（P<0.05）。計算各組Apo A1/Apo B 比值可以發(fā)現(xiàn)，MLCT 和MCT 組的Apo A1/Apo B 比值顯著高于HORO 組（P<0.05）。

2.4 攝食不同脂質(zhì)對大鼠肝臟甘油三酯、磷脂脂肪酸組成的影響

各組大鼠肝臟中甘油三酯（TG）脂肪酸變化如表6所示。與對照組和MCT 組相比，MLCT 組和HORO 組的6c/9c-C18：1、9c12c-C18：2和C18：3n-3相 對含量都有顯著性升高（P<0.05），導(dǎo)致這兩組的不飽和脂肪酸（unsaturated fatty acid，USFA）含量和單不飽和脂肪酸（monounsaturated fatty acid，MUFA）都顯著升高（P<0.05）。同時，MLCT 組和MCT組C8：0和C10：0相對含量顯著高于對照組和HORO組（P<0.05）。

表6 SD 大鼠肝臟中甘油三酯脂肪酸組成（n=8）Table 6 Fatty acid compositions of triacylglycerols in livers of SD rats（n=8）

表7所示為各組大鼠肝臟中磷脂（PL）脂肪酸組成?？梢钥闯觯? 組大鼠肝臟磷脂中均未檢測出C8：0、C10：0。相比對照組，HORO 和MLCT 組6c/9c-C18：1、9c12c-C18：2相對含量均有顯著上升（P<0.05）；而3 個試驗組中C20：4n-6（Arachidonic acid，ARA）和C22：6n-3（Docosahexaenoic acid，DHA）的相對含量顯著高于對照組（P<0.05），且MCT 組的ARA 相對含量明顯高于HORO 組和MLCT 組（P<0.05）。HORO 組和MLCT 組的USFA 和MUFA 相對含量顯著性高于對照組和MCT 組（P<0.05）。且3 個試驗組的多不飽和脂肪酸（polyunsaturated fatty acid，PUFA）相對含量均顯著高于對照組（P<0.05）。

表7 SD 大鼠肝臟中磷脂脂肪酸組成（n=8）Table 7 Fatty acid compositions of phospholipids in livers of SD rats（n=8）

（續(xù)表7）

2.5 攝食不同脂質(zhì)對大鼠肝臟中脂代謝相關(guān)酶的影響

如表8所示，MCT 組大鼠肝臟中脂肪動員相關(guān)酶HSL、PKA 和cAMP 水平均為4 組中最高，而ATGL 水平為各組中最低，且顯著低于HORO 組（P<0.05）。相反，在4 組中，HORO 組大鼠肝臟中HSL、cAMP 和PKA 水平均為最低，ATGL 水平在各組中為最高，且顯著高于MCT 組（P<0.05）。MLCT 組 的HSL、PKA 和cAMP 水 平 均 高 于HORO 組水平，低于MCT 組水平；而MLCT 組的ATGL 水平高于MCT 組，但低于HORO 組。同時，MLCT 組的4 種脂質(zhì)代謝相關(guān)酶水平均高于對照組。

表8 攝食不同脂質(zhì)對SD 大鼠肝臟中脂質(zhì)代謝相關(guān)酶的影響（n=8）Table 8 Effects of feeding different lipids on lipid metabolism related enzymes in livers of SD rats（n=8）

3 討論

本研究結(jié)果顯示，相比HORO 組，MLCT 組的SD 大鼠有著更小的體重增長率，說明MLCT 有抑制動物體重增長的趨勢。以往的研究表明，MCFA比LCFA 更能增加機(jī)體能量消耗，從而更好地抑制體重增長、減少體內(nèi)脂肪聚集[15-16]，與本研究結(jié)果基本一致。

機(jī)體脂代謝紊亂的最直觀表現(xiàn)為血脂代謝指標(biāo)上。本試驗發(fā)現(xiàn)，MLCT 相較于HORO 有效抑制了血漿中TG、TC 及LDL-C 含量的升高，升高了HDL-C/LDL-C 比值。研究表明MCFA 在體內(nèi)的利用效率顯著高于LCFA，且不易在血中聚集，使血液中甘油三酯濃度維持在較低水平[17]。HORO 主要由LCFA 組成，而MLCT 中含有一定比例的辛酸（C8：0）和癸酸（C10：0），這導(dǎo)致了兩者吸收代謝速率的差異。臨床研究發(fā)現(xiàn)，血漿中TC、TG、LDL-C升高、HDL-C 降低會促進(jìn)動脈粥樣硬化的發(fā)生[18]。而MCFA 在防治代謝綜合征方面具有良好的效果[19]。且同為飽和脂肪酸，MCFA 在維持機(jī)體膽固醇穩(wěn)態(tài)方面優(yōu)于LCFA。Xue 等[20]發(fā)現(xiàn)，MLCT 可降低高甘油三酯血癥患者體重以及血清TG、LDLC，升高HDL-C，均表明MLCT 在改善血脂與預(yù)防肥胖相關(guān)疾病方面起到良好的作用。血液中脂代謝指標(biāo)水平的高低也與脂質(zhì)代謝的主要場所——肝臟密切相關(guān)[21]。血漿中脂質(zhì)的變化通常預(yù)示著肝臟脂肪的代謝變化。在肝臟中，Apo A1、Apo B分別是高密度脂蛋白和低密度脂蛋白的主要載脂蛋白。Apo A1 有著調(diào)節(jié)脂代謝酶活性、促進(jìn)脂類和膽固醇運(yùn)輸分解等作用，維持血脂水平正常，是肝硬化的重要指標(biāo)[22-23]；Apo B 則與炎癥反應(yīng)和斑塊形成有關(guān)。Apo A 水平下降、Apo B 水平升高是引發(fā)冠心病、動脈粥樣硬化等疾病的危險因素[24]；一些研究提示，Apo A1/Apo B 比值在預(yù)測疾病風(fēng)險方面比單個血脂指標(biāo)更有價值[25-26]，Apo A1/Apo B 比值升高與心肌梗塞、Ⅱ型糖尿病及代謝綜合征等疾病的發(fā)生均有關(guān)[27-29]。本研究結(jié)果顯示，相比HORO，攝入MLCT 使肝臟中TC 含量顯著減少，ApoA1 表達(dá)量顯著升高，且Apo A1/Apo B 比值顯著高于HORO 組，說明MLCT 不僅改善血脂，還減少了肝臟脂質(zhì)的積累，加快肝臟組織對于多余脂質(zhì)的清除，證明了MLCT 對動物脂代謝紊亂的改善作用穩(wěn)定有效，具有預(yù)防肝臟和心血管損傷的潛力。

肝臟作為機(jī)體能量代謝與轉(zhuǎn)換的重要器官，肝臟脂質(zhì)的過量沉積會引起肝細(xì)胞功能紊亂，進(jìn)而促進(jìn)脂肪肝的形成，危害機(jī)體健康。因此，檢測了肝臟中脂肪酸的組成變化。結(jié)果顯示，相比對照組，MLCT 組大鼠的肝臟質(zhì)量無明顯增加，且MLCT 使肝臟中不飽和脂肪酸相對含量顯著增加，有利于為機(jī)體提供必需脂肪酸，維持正常的生理代謝。必需脂肪酸是磷脂的重要組成部分[30]，也是合成多種類二十烷酸的前體物質(zhì)[31]。Carlson 等[32]研究發(fā)現(xiàn)，在食用油中添加一定比例的MCT 在改善機(jī)體炎癥反應(yīng)的同時，不會降低肝臟中必需脂肪酸的含量。肝臟中脂質(zhì)的積累與組成的改變也與脂質(zhì)代謝相關(guān)酶水平息息相關(guān)。本研究證實(shí)MLCT 可上調(diào)大鼠肝臟中cAMP、PKA、ATGL 和HSL 水平。MLCT 組大鼠肝臟中TG、TC 含量的降低，可能與這些脂質(zhì)動員相關(guān)酶的大量表達(dá)有關(guān)。HSL 廣泛存在于動物體內(nèi)的各個組織，其通過水解甘油三酯、產(chǎn)生游離脂肪酸為機(jī)體提供能量，在脂肪代謝過程中發(fā)揮著重要作用，與預(yù)防肥胖及胰島素抵抗等有密切關(guān)聯(lián)[33-34]。研究發(fā)現(xiàn)，ATGL也是甘油三酯水解第一步的關(guān)鍵限速酶。體外試驗顯示，當(dāng)ATGL 的表達(dá)受到抑制時，機(jī)體組織中甘油三酯的分解顯著減少，證明該酶在脂質(zhì)代謝中的重要作用[35]。HSL 需要通過依賴cAMP 激活的PKA 磷酸化來獲得更強(qiáng)的分解甘油三酯的能力，而ATGL 不依賴于激活的PKA[36]。試驗結(jié)果表明，相較于HORO，含MCFA 的MLCT 可能主要通過cAMP-PKA 途徑發(fā)揮作用。MLCT 在小腸中消化后，水解產(chǎn)生的MCFA 促進(jìn)cAMP 的合成，刺激PKA 的表達(dá)量增加，從而促進(jìn)HSL 的磷酸化。MLCT 可能在HSL 與ATGL 的雙重作用下促進(jìn)肝臟內(nèi)脂肪水解。因此，本研究推測MLCT 促進(jìn)脂質(zhì)代謝的機(jī)制之一可能為MLCT 通過升高肝臟組織中脂肪動員相關(guān)酶水平來增加脂肪分解。

綜上所述，含有MLCT 的飲食對預(yù)防動物肥胖、降低體脂與血脂具有積極作用。同時，MLCT還有助于控制肝臟脂肪增加，改善肝臟脂質(zhì)代謝的作用。MLCT 有望作為新型的功能性食用油，用于預(yù)防肥胖和代謝紊亂。