趙月鳴，韓秀娟，邢德君

(吉林省腫瘤醫(yī)院內(nèi)三科，吉林 長(zhǎng)春 130012)

結(jié)直腸癌(Colorectal cancer，CRC)是當(dāng)代常見(jiàn)消化道惡性腫瘤之一。在我國(guó)，結(jié)直腸癌的發(fā)病率居常見(jiàn)腫瘤的第四位[1-4]，僅次于肺癌、胃癌及肝癌。由于結(jié)直腸癌發(fā)生機(jī)制尚不完全明確，故在結(jié)直腸癌的診治方面仍存在困難，發(fā)病率、死亡率居高不下。目前，手術(shù)治療是結(jié)直腸癌最有效的治療方法，非手術(shù)治療的方法主要有化療、放療、生物治療及分子靶向治療。在我國(guó)，由于大部分患者被確診時(shí)已屬中晚期，術(shù)后超過(guò)1/3的患者出現(xiàn)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量、縮短生存期。因此高效篩查、早期診斷和復(fù)發(fā)的早期檢測(cè)是提高結(jié)直腸癌的療效和預(yù)后的關(guān)鍵。原肌球蛋白(TPM)是細(xì)肌絲中與肌動(dòng)蛋白的結(jié)合蛋白，是一種調(diào)節(jié)蛋白，它在肌肉收縮過(guò)程中起著很重要的作用，哺乳動(dòng)物中的4個(gè)TPM基因已被確認(rèn)，即TPM1、TPM2、TPM3、TPM4。目前對(duì)TPM4的研究較少，主要集中在腫瘤[5-6]、與肌肉相關(guān)疾病[7-9]。腫瘤方面主要局限在與乳腺癌轉(zhuǎn)移的相關(guān)性研究及膀胱癌的相關(guān)性研究。本文通過(guò)以結(jié)直腸腺癌組織、癌旁組織為研究對(duì)象，進(jìn)行雙向電泳和質(zhì)譜分析，篩選結(jié)腸腺癌及癌旁組織之間差異蛋白。對(duì)TPM4蛋白進(jìn)行Western印跡試驗(yàn)，提示TPM4蛋白可能為結(jié)直腸癌的診斷和指導(dǎo)治療以及判斷預(yù)后提供了一個(gè)新的靶點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1一般資料：本試驗(yàn)需使用新鮮的結(jié)直腸癌組織及癌旁正常組織，癌旁正常組織取材需位于癌組織上端，且距離腫瘤邊緣≥5 cm，經(jīng)術(shù)后病理證實(shí)為陰性。結(jié)直腸癌標(biāo)本經(jīng)術(shù)后病理確診斷為腺癌，TNM分期Ⅲ期，術(shù)前均未接受任何治療。依據(jù)上述篩選標(biāo)準(zhǔn)，我院自2018年1月～2019年12月之間收集組織標(biāo)本23例，每例均包括癌組織及配對(duì)的癌旁正常組織。手術(shù)時(shí)即時(shí)取材，清洗干凈，離體后30 min內(nèi)放入液氮速凍，然后放入-80℃冰箱保存。

1.1.2試劑:固相pH梯度干膠條 (pH3～10.17 cm；pH5 ～8.17 cm)、碘代乙酰胺(IAM)、蛋白質(zhì)定量試劑盒購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司，尿素、硫脲、碳酸氫鈉、苯甲基磺酰氟、三羥甲基氨基甲烷、二硫蘇糖醇、3-[(3 -膽酰胺丙基)-二乙胺]-丙磺酸、DNA酶、山羊抗鼠IgG、丙烯酰胺、考馬斯亮藍(lán)購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司，RNA酶、TPCK修飾的測(cè)序級(jí)胰酶購(gòu)于美國(guó)Promega公司，蛋白抽提試劑盒購(gòu)自CWBio公司，TPM4鼠抗人單抗購(gòu)自英國(guó)Abcam公司，脫脂奶粉購(gòu)自?xún)?nèi)蒙古伊利集團(tuán)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1樣品總蛋白提取及蛋白濃度測(cè)定:從-80℃冰箱中取出少量組織標(biāo)本，在低溫PBS中將肉眼可見(jiàn)的血洗去，用無(wú)菌剪刀將樣本剪碎，在液氮中將樣本研磨成勻漿。分別稱(chēng)量已研成勻漿的結(jié)直腸癌組織及癌旁正常組織各50 mg，分別加入200 μl組織蛋白抽提試劑，放在冰上20 min。4℃，12 000 r/min離心60 min。考馬斯亮藍(lán)法(Bradford法)測(cè)定上清液中的蛋白質(zhì)濃度：在595 nm處比色，以標(biāo)準(zhǔn)蛋白含量為橫坐標(biāo)，A595 nm為縱坐標(biāo)，為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)定樣品中蛋白質(zhì)含量。分裝樣本，置于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2樣品蛋白水解多肽混合物的制備:將凍存的總蛋白樣品放在室溫條件下，至其完全融化。加入3～5倍體積的50 mmol/L碳酸氫氨將總蛋白樣品完全溶解。加入1 mol/L的二硫蘇糖醇(DTT)以還原蛋白質(zhì)中的二硫鍵，將其調(diào)定至終濃度為20 mmol/L；置于56℃，避光1 h；取出后待其溫度降至室溫，加入等量的1M的碘代乙酰胺(IAM)以防止打開(kāi)的二硫鍵再結(jié)合，混勻后調(diào)定至終濃度為50 mM；避光30 min；按蛋白：胰酶以50∶1的比例向反應(yīng)體系中加入測(cè)序級(jí)胰酶進(jìn)行酶切，置于37℃水浴，過(guò)夜；酶切產(chǎn)物并真空抽干，置于-80℃冰箱中保存。

1.2.3二維色譜與質(zhì)譜聯(lián)用分離并鑒定多肽混合物:用0.1%FA緩沖液溶解樣品，取50 μg上樣，經(jīng)反相色譜洗脫的多肽用 LTQXL離子肼質(zhì)譜儀檢測(cè)，質(zhì)譜數(shù)據(jù)采用Bioworks 3.3.1 SP1軟件，數(shù)據(jù)庫(kù)檢索用SEQUEST法進(jìn)行以鑒定出相關(guān)多肽和蛋白質(zhì)。用SEQUEST進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，以鑒定出相關(guān)多肽和蛋白質(zhì)。

1.2.4Western印跡試驗(yàn):采用Western印跡試驗(yàn)對(duì)選定的目標(biāo)蛋白-TPM4的表達(dá)情況進(jìn)行進(jìn)一步的驗(yàn)證。BCA法定量蛋白，使每個(gè)加樣孔中蛋白量相同。內(nèi)參照為β-actin。

2 結(jié)果

2.1癌組織總蛋白酶解混合物的二維色譜與質(zhì)譜聯(lián)用分析:應(yīng)用二維液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)結(jié)直腸癌組織總蛋白用酶解后所得產(chǎn)物進(jìn)行分析，將全部多肽數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，共鑒定出了846個(gè)蛋白質(zhì)。

2.2癌旁組織總蛋白酶解混合物的二維色譜與質(zhì)譜聯(lián)用分析:應(yīng)用二維液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)癌旁組織總蛋白酶解產(chǎn)物進(jìn)行分析，將全部多肽數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，共鑒定出了535蛋白質(zhì)。

2.3結(jié)直腸癌組織與癌旁組織差異蛋白的鑒定:通過(guò)腫瘤組織與癌旁組織中蛋白質(zhì)的豐度變化來(lái)界定差異表達(dá)的蛋白質(zhì)，每個(gè)蛋白的豐度通過(guò)譜圖數(shù)來(lái)評(píng)價(jià)。筆者對(duì)差異蛋白的譜圖數(shù)變化界定標(biāo)準(zhǔn)如下：①腫瘤組織與癌旁組織中蛋白譜圖數(shù)的比值≥1；②腫瘤組織與癌旁組織中蛋白譜圖數(shù)的差值≥72。

筆者根據(jù)上述標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)比腫瘤組織與癌旁組織的蛋白分析數(shù)據(jù)，共鑒定出了有顯著差異的蛋白共24個(gè)，其中在腫瘤組織中9個(gè)蛋白下調(diào)表達(dá)，15個(gè)蛋白上調(diào)表達(dá)。TPM4蛋白的串聯(lián)質(zhì)譜圖見(jiàn)圖1～5。

圖1 TPM-4蛋白的質(zhì)譜鑒定：IQLVEEELDRAQER序列肽段的串聯(lián)質(zhì)譜圖

2.4TPM4的Western印跡結(jié)果:見(jiàn)圖6。

圖2 TPM4蛋白中KIQALOOOQDEAEDRAQGLQR序列肽段的串聯(lián)質(zhì)譜圖

圖3 TPM4蛋白中KLVILEGELER序列肽段的串聯(lián)質(zhì)譜圖

圖4 TPM4蛋白中KLVILEGELERAEER序列肽段的串聯(lián)質(zhì)譜圖

圖5 TPM4蛋白中RIQLVEEELDRAQER序列肽段的串聯(lián)質(zhì)譜圖

圖6 TPM4的免疫

3 討論

直腸癌(Colorectal cancer，CRC)是最常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤之一。在我國(guó)，結(jié)直腸癌的發(fā)病率和死亡率逐年上升，目前居于第4位，僅次于肺癌、胃癌及肝癌[10-11]。在結(jié)直腸癌的發(fā)病早期，患者一般無(wú)明顯癥狀，且該病早期的診斷率較低，進(jìn)展較快，當(dāng)發(fā)展到中期、后期，患者才能有明顯或者不明顯的病變特征，喪失了治療的最佳時(shí)期，縮短了生存期。因此高效篩查、早期診斷和復(fù)發(fā)的早期檢測(cè)是提高結(jié)直腸癌的療效和預(yù)后的關(guān)鍵。

如何探尋理想的腫瘤標(biāo)志物，目前最常應(yīng)用的是蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，其檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物的效率較高，且省時(shí)省力。本研究采用了二維色譜與質(zhì)譜聯(lián)用的方法研究了TNMⅢ期結(jié)直腸癌組織與癌旁組織之間蛋白表達(dá)譜的差異。從結(jié)直腸癌組織及癌旁組織差異蛋白水平上探討差異蛋白與腫瘤發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)性，從而有助于醫(yī)務(wù)人員了解結(jié)直腸癌發(fā)生的機(jī)制，尋找早期診斷的新靶點(diǎn)，并為后續(xù)的工作奠定基礎(chǔ)。 結(jié)果發(fā)現(xiàn)有24個(gè)差異蛋白，其中在結(jié)直腸癌組織中有15個(gè)蛋白上調(diào)表達(dá)，有9個(gè)蛋白下調(diào)表達(dá)。這個(gè)結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)室前期所做的試驗(yàn)結(jié)果[12]相一致，但同其他的一些文獻(xiàn)報(bào)道有所不同，分析原因可能有以下幾種可能：①結(jié)直腸癌本身就是一種異質(zhì)性的疾病，每位患者的病例特征均不同，故收集標(biāo)本的標(biāo)準(zhǔn)不同、選取的標(biāo)本類(lèi)型不同、患者自身的因素都可能導(dǎo)致篩選結(jié)果的差異；②研究中所應(yīng)用的方法及實(shí)驗(yàn)手法、試劑、儀器及其他一些干擾因素均存在差異，也會(huì)得出不同的結(jié)果；③蛋白質(zhì)組學(xué)研究本身所包含的信息量就非常大，研究者們所得出的實(shí)驗(yàn)結(jié)果不同是正常的。但不可否認(rèn)的一點(diǎn)就是，不同的研究者得到的都只是眾多數(shù)據(jù)中的一部分，還有大量的結(jié)直腸癌的蛋白組學(xué)信息有待進(jìn)一步發(fā)掘和研究。筆者詳細(xì)檢索文獻(xiàn)后發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)的差異蛋白一部分已經(jīng)得到了驗(yàn)證[1-3]。本課題組從剩余的差異蛋白中選出TPM4蛋白作為研究蛋白，主要是因?yàn)門(mén)PM4有一定的生物學(xué)功能，在結(jié)直癌中沒(méi)有報(bào)道，而且在生物制品公司可以買(mǎi)到TPM4的一抗。通過(guò)Western blot 蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)上調(diào)蛋白TPM4在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)，結(jié)果可見(jiàn)TPM4蛋白在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)明顯高于配對(duì)的癌旁組織，進(jìn)一步證實(shí)了，TPM4在結(jié)直腸癌組織中上周表達(dá)。