周 安，錢忠亞，石 洪，李愛蘭，王桂蘭，孫素嫻，丁國兵

(泰州市姜堰中醫(yī)院普外科，江蘇 泰州 235500)

金黃色葡萄球菌是一種常見的革蘭陽性球菌，是人類化膿感染中最常見的病原菌之一，可引起局部及全身性化膿感染，經(jīng)久不愈的金黃色葡萄球菌感染甚至?xí)?dǎo)致皮膚疤痕的產(chǎn)生，嚴(yán)重的金黃色葡萄球菌感染在濫用抗生素的情況下，長期的耐藥性可能會(huì)導(dǎo)致超級細(xì)菌的出現(xiàn)，誘發(fā)更嚴(yán)重的并發(fā)癥，如皮下癰、皮下化膿性感染、膿毒血癥等[1-3]?；诂F(xiàn)況參考中醫(yī)中藥書籍，本研究自制銀香解毒膏用于瘡瘍外治，具體方劑如下:金銀花、乳香、蜈蚣、白芷、藿香、苦參、野菊花、黃柏、地膚子。通過建立體表感染小鼠模型即建立瘡瘍模型外用銀香解毒膏，并同時(shí)建立莫匹羅星以及賦形劑空白對照組。采用免疫熒光觀察銀香解毒膏是否可以抑制巨噬細(xì)胞的招募，此外使用實(shí)時(shí)定量PCR探究銀香解毒膏是否可以降低皮膚層炎性水平，初步闡明銀香解毒膏的作用機(jī)制以及對比治療效果，為銀香解毒膏的未來臨床應(yīng)用提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1小鼠實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組：選取8周齡、體重20～25 g、無特定病原的C57小鼠60只雌雄各半，將小鼠隨機(jī)分為銀香解毒膏組、莫匹羅星組、賦形劑組各20只(雌雄各半)；于SPF環(huán)境中以標(biāo)準(zhǔn)條件飼養(yǎng)，南京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心定期對小鼠進(jìn)行致病原檢測以確保小鼠符合實(shí)驗(yàn)要求。小鼠飼養(yǎng)在通風(fēng)潔凈區(qū)，均采用SPF級潔凈鼠糧進(jìn)行飼養(yǎng)，本研究經(jīng)過本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)同意。

1.2方法

1.2.1主要試劑：蘇木精、伊紅、HistoChoice透明劑、牛血清蛋白(BSA)、DEPC水、takara逆轉(zhuǎn)錄試劑盒均購自Gibco 公司，多聚甲醛、抗熒光猝滅劑、DPBS、無水酒精、Triton X-100、氯仿、異丙醇原液等其常規(guī)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2.2標(biāo)本制備：使用“膠帶剝脫法”建立小鼠金黃色葡萄球菌感染模型，具體操作方法：小鼠麻醉后背部皮膚備皮剃毛，生理鹽水擦拭皮膚，無菌棉球擦拭干凈生理鹽水，再以彈性膠帶于背部皮膚上連續(xù)粘扯、撕脫動(dòng)物的皮膚表皮，然后在撕脫表皮部位滴注金黃色葡萄球菌液，作用約4 h 后完成細(xì)菌吸收；當(dāng)背部部位出現(xiàn)明顯紅腫、皮薄光亮、觸及軟化有膿液為造模成功。小鼠感染24 h后使用銀香解毒膏、莫匹羅星膏、賦形劑膏進(jìn)行涂抹感染部位，實(shí)驗(yàn)中統(tǒng)一用量。按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)間，分別在涂抹藥物治療后的第3天和第5天時(shí)皮膚取樣，進(jìn)行OCT冰凍包埋，液氮速凍1 h，-80℃冰箱冷凍48 h，使用萊卡冰凍切片機(jī)制作8 μm厚度的切片，正電荷防脫載玻片吸附冰凍切片，-20℃冰箱中冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3常規(guī)病理染色：皮膚組織切片用經(jīng)典的蘇木素伊紅染色，用中性膠(Gibco，100 ml)固定，然后在麥克奧迪數(shù)字顯微鏡下觀察。

1.2.4實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng):PCR引物序列參考文獻(xiàn)或在PubMed上設(shè)計(jì)，全長比對并確定序列準(zhǔn)確無誤，由Invitrogen公司合成，用DEPC水稀釋后置于-80℃冰箱保存待用。PCR檢測皮膚白細(xì)胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、IL-1β、IL-1α的 mRNA 的表達(dá)，Trizol法提取皮膚中的總RNA，反轉(zhuǎn)錄為 cDNA 后進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)。內(nèi)參采用小鼠 GAPDH，其引物序列:上游 5'-ATTCAACGGCACAGTCAAGG-3'，下游5'- GCAGAAGGGGCCGGAGATGA-3'。目的片段引物如下：IL-6:上游 5'-AGAGACTTCCATCCAGTTGCC-3'，下游3'-CCGGACTTG TGAAGATGGGAA-5'；TNF-α:上游 5'-ACCGTCAGCCGATTTGCTAT-3'，下游 3'-CCGGACTCCGCAA-AGTCTAA-5'；IL-1β:上游5'-TGGGTTGCCAAGCCTTATCG-3'，下游 3'-TTCAGCTTCTCACCCAGGGA-5'；IL-4：上游5′-GCCATATCGGCTCGCAAATC-3′，下游 5′-AACGAATGCCGA AACCTC CTC-3′。用SYBR Green Master Mix(Qiagen)進(jìn)行反應(yīng)， 在95℃下引發(fā)15 min，然后將樣品分別在94℃進(jìn)行5 s、55℃進(jìn)行30 s和70℃進(jìn)行30 s，分別運(yùn)行40個(gè)循環(huán)。 所有樣品均重復(fù)3次。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：數(shù)據(jù)表示為來自3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值±SEM。用Student's t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，多重比較由ANOVA進(jìn)行評估，P<0.05被認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1三組小鼠治療3 d、5 d時(shí)常規(guī)病理染色的圖像：小鼠皮膚感染金黃色葡萄球菌之后，小鼠皮膚出現(xiàn)水泡紅腫，水泡破損后流出組織液，皮膚出現(xiàn)紅斑并潰爛。采用賦形劑、莫匹星羅、銀香解毒膏進(jìn)行治療，每組治療3 d和5 d時(shí)通過外科手術(shù)獲取皮膚標(biāo)本，采用冰凍切片，進(jìn)行HE染色。對比賦形劑組小鼠，通過莫匹星羅藥膏治療第5天時(shí)小鼠皮膚創(chuàng)面破損修復(fù)，但是皮膚乳頭層出現(xiàn)水腫狀態(tài)；通過銀香解毒膏治療小鼠的表皮層破損較小，在第5天時(shí)皮膚層愈合，皮膚乳頭層沒有出現(xiàn)水腫狀態(tài)，此外原本損傷部位的皮膚乳頭層出現(xiàn)新生毛囊樣結(jié)構(gòu)物。見圖1。

注：三組小鼠治療3 d和5 d的金黃色葡萄球菌感染的皮膚(n=6)，虛線內(nèi)為金黃色葡萄球菌導(dǎo)致的皮膚損傷部位，標(biāo)尺為100μm

注：(A)三組小鼠治療3 d和5 d的炎性因子IL-6的mRNA水平;(B)三組小鼠治療3 d和5 d的炎性因子TNF-α的mRNA水平;(C)三組小鼠治療3 d和5 d的炎性因子IL-1β的mRNA水平;(D)三組小鼠治療3 d和5 d的炎性因子IL-4的mRNA水平;與銀香解毒膏組小鼠治療5 d時(shí)比，①P<0.05圖2 三組感染金黃色葡萄球菌的小鼠皮膚在治療3 d和5 d時(shí)炎性因子的mRNA水平的變化

2.2三組小鼠治療3 d、5 d時(shí)炎性因子的mRNA水平比較：三組小鼠感染24 h后分別使用銀香解毒膏、莫匹羅星膏、賦形劑膏進(jìn)行涂抹感染部位，分別治療3 d和5 d后銀香解毒膏可以很好地抑制金黃色葡萄球菌感染部位皮膚的炎性因子水平，IL-6、TNF-α、IL-1β、IL-1α的 mRNA 的表達(dá)水平顯著降低，且降低水平在一定程度上優(yōu)于莫匹羅星組小鼠，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。以上數(shù)據(jù)說明銀香解毒膏在抑制炎性因子表達(dá)水平上發(fā)揮了重要作用。見圖2。

3 討論

金色葡萄球菌正確名稱為金黃色葡萄球菌，是葡萄球菌的一種，屬于革蘭陽性菌，培養(yǎng)以后顯微鏡下看到像葡萄串一樣，所以稱之為葡萄球菌。葡萄球菌主要存在于外界環(huán)境當(dāng)中，很容易造成人的感染，尤其有免疫缺陷、皮膚損傷、燒傷的人，特別容易出現(xiàn)感染，嚴(yán)重的出現(xiàn)敗血癥、膿毒血癥等[4]。一般消毒劑，如醫(yī)用酒精大概幾分鐘可以滅活，所以酒精、碘伏類中效消毒劑可以很快把它滅活。但是對于皮膚深層的金黃色葡萄球菌或者已經(jīng)形成生物素膜的金葡菌，一般消毒劑很難殺滅處理金葡菌，而是需要抗生素進(jìn)行金葡菌的處理，但是長期使用抗生素或者反復(fù)使用同一種抗生素會(huì)促進(jìn)金葡菌耐藥性的發(fā)生，使得金黃色葡萄球菌感染性疾病治療變得棘手[5-6]。這就需要一些滲透性較好的外用中藥制劑來進(jìn)行治療，來抵抗濫用抗生素所導(dǎo)致的金黃色葡萄球菌的耐藥性。

目前我院院內(nèi)自制中藥藥劑并不多，外科臨床外用中藥藥物頗少，應(yīng)用最多仍屬金黃散。如意金黃散由明代陳實(shí)功所創(chuàng)，首載于《外科正宗》一書，后多簡稱金黃散。藥物組成：大黃、黃柏、姜黃、白芷、南星、陳皮、蒼術(shù)、厚樸、甘草、天花粉，其運(yùn)用廣泛，可運(yùn)用于外科疾病初起、成膿、潰后三個(gè)時(shí)期?；诂F(xiàn)況參考中醫(yī)中藥書籍,我院自制銀香解毒膏用于瘡瘍外治,具體方劑如下:金銀花、乳香、蜈蚣、白芷、藿香、苦參、野菊花、黃柏、地膚子。其中金銀花與野菊花成分具有很好的清熱解毒的功效，且主治癰疽疔癤等皮膚感染性疾病，此外地膚子等成分可以起到解毒祛濕、消腫止癢的功效。炎性反應(yīng)的主要表現(xiàn)為紅腫熱痛，而在蛋白分子層面炎性細(xì)胞因子反應(yīng)了炎性反應(yīng)水平。在本研究中，銀香解毒膏很好地抑制了 IL-6、TNF-α、IL-1β、IL-4的mRNA的表達(dá)水平，從而控制了皮損程度。這些炎性細(xì)胞因子大多數(shù)由炎性細(xì)胞分泌，因此從細(xì)胞層面上來分析銀香解毒膏很大程度上抑制了炎性細(xì)胞的招募。研究報(bào)道金黃色葡萄球菌感染皮膚后對皮膚造成直接的損傷，而中性粒細(xì)胞等炎細(xì)胞招募會(huì)誘發(fā)損傷部位的“二次打擊”[7-8]，炎性細(xì)胞的圍攻將會(huì)加重皮損損傷程度，甚至損傷毛囊的正常結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致毛囊壞死、毛干脫落，讓壞死的毛囊無法再發(fā)揮毛囊干細(xì)胞的修復(fù)功能，從而形成皮膚瘢痕，嚴(yán)重影響了患者的外表美觀，甚至影響患者的心理健康。

本研究結(jié)果顯示，銀香解毒膏可以很好地緩解金黃色葡萄球菌導(dǎo)致的皮膚炎性反應(yīng)，對于金黃色葡萄球菌的感染具有很好的治療效果，維護(hù)皮膚正常功能。然而對于銀香解毒膏殺滅金黃色葡萄球菌的具體機(jī)制還需進(jìn)一步探究，后期闡明銀香解毒膏藥物滲透動(dòng)力以及對金黃色葡萄球菌生物素膜的抑制機(jī)制，對于未來臨床藥物的推廣應(yīng)用具有一定的指導(dǎo)意義。