張文剛 張 妤 孫冰清 姜 芹 顧 欣 黃士新* 達列亞·阿合買提

溶菌酶二聚體是以雞蛋清溶菌酶單體為原料，將單體溶菌酶聚合為溶菌酶二聚體，分子質(zhì)量約為28.8 ku。溶菌酶二聚體分子中2 個相鄰分子之間的結(jié)合方式為共價鍵結(jié)構(gòu)，其不但保留了單體溶菌酶的酶活性，而且還產(chǎn)生了新的免疫活性。溶菌酶二聚體通過顯著增強腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬率及其吞噬指數(shù)，提高血液中性細(xì)胞的吞噬率，從而提高斷奶仔豬的非特異性免疫功能。這種特性可用于改善仔豬腸道發(fā)育，促進營養(yǎng)物質(zhì)吸收，提高斷奶仔豬增重。溶菌酶二聚體作為新型的飼料添加劑產(chǎn)品，其二聚體比例控制在大于總含量的30%。目前，溶菌酶二聚體常用的檢測方法有高效液相色譜法和電泳法，與液相方法相比，電泳法具有成本低、操作簡單、重復(fù)性高等特點[1-2]。

1 材料與方法

1.1 試 劑

檸檬酸、檸檬酸三鈉，均購自上海凌峰化學(xué)試劑有限公司；三氯乙酸，購自上海凌峰化學(xué)試劑有限公司；EDTA、氫氧化鈉、丙酮，均購自上海凌峰化學(xué)試劑有限公司；溶菌酶二聚體對照品，純度99.2%，溶菌酶二聚體飼料添加劑（批號為0880、0881、0882、0883），由上海艾魁英生物科技有限公司提供；4-15%Resolving Gel 小型預(yù)制膠、10×Tris/Glycine/SDS 電泳緩沖液、Dual Color Marker，均購自伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司；上樣緩沖液（自制，4×Laemmli Sample Buffer，購自伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司；β-巰基乙醇，購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；考馬斯亮藍(lán)蛋白膠快速染色液，購自北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀 器

離心機，德國Eppendorf 公司；渦旋振蕩儀，美國Talboys 公司；BIO-RAD 電泳儀、BIO-RAD 成像系統(tǒng)，美國BIO-RAD 公司；Mettler Toledo AL104型電子天平，瑞士梅特勒公司。

1.3 試驗方法

1）標(biāo)準(zhǔn)溶液及樣品的制備。①標(biāo)準(zhǔn)溶液制備。精密稱取溶菌酶二聚體標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，移取純化水1 mL 溶解制備成濃度為10 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液，稀釋至2 mg/mL，備用。②樣品制備。取180 mg 樣品溶于30 mL 0.1 mol/L 的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液（pH 6.6），加3 mL 0.5 mol/L EDTA，磁力攪拌至完全溶解，然后加入15 mL 3 mol/L 氯化鈉溶液，繼續(xù)攪拌30 min，用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH 至11.8。離心，棄上清，向沉淀中加入1 mL 檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液（pH 6.6），充分震蕩30 min 至沉淀復(fù)溶。轉(zhuǎn)移至2 mL 離心管，加1 mL 30%三氯乙酸溶液，充分震蕩離心10 min，棄上清，加1 mL 丙酮洗滌，離心棄上清，丙酮重復(fù)洗滌1 次，置于通風(fēng)櫥內(nèi)吹干。取25 μL 上樣緩沖液，加入75 μL 純水，充分吹洗溶解，備用。

2）標(biāo)準(zhǔn)曲線。分別取標(biāo)準(zhǔn)溶液1、2、4、6、10 μL，加入5 μL 上樣緩沖液，純水補足至20 μL，終濃度分別為0.1、0.2、0.4、0.6、1.0 mg/mL，充分混勻，沸水煮1 min，5 000 r/min 離心1 min。

3）上樣。將預(yù)制膠放入電泳槽中，并灌入新配置的電泳緩沖液。用微量進樣器分別加入Marker、溶菌酶二聚體標(biāo)準(zhǔn)溶液和試樣各10 μL，電泳條件為15 mA 恒電流。

4）染色與脫色。將2 塊玻璃板取出，用刀片輕輕插入凹槽玻璃的頂部與另一玻璃板之間的縫隙，輕輕向上撬，上層玻璃輕輕撬開。使用馬斯亮藍(lán)蛋白膠快速染色液進行染色，純水脫色至背景無色后將凝膠平整放置于紫外/白光轉(zhuǎn)換板上，拍照掃描條帶，分析二聚體。

5）精密度試驗。取批號為0880 的溶菌酶二聚體樣品，按本文材料與方法1.3 中②的方法處理后進行電泳分析，連續(xù)測定6 次，連續(xù)檢測3 d，計算方法的日內(nèi)精密度和日間精密度。

6）實樣檢測。分別取上海艾魁英生物科技有限公司生產(chǎn)的批號為0881、0882、0883 3 批次樣品，按本文材料與方法1.3 中②的方法處理后進行電泳分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性方程結(jié)果

試驗結(jié)果表明，溶菌酶二聚體標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1～1.0 mg/mL 范圍內(nèi)具有良好的線性，其線性方程為Y=1.99×10-5X-0.0708，R2=0.9945，結(jié)果見圖1。

圖1 溶菌酶二聚體標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性方程結(jié)果

2.2 精密度實驗結(jié)果

試驗結(jié)果顯示，樣品中溶菌酶二聚體的含量為32.19%～34.91%；日內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.35%～1.73%，日間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.82%，具體試驗結(jié)果見表1。

表1 溶菌酶二聚體含量測定精密度試驗結(jié)果%

2.3 實樣檢測結(jié)果

試驗結(jié)果顯示，批號0881、0882、0883 樣品中溶菌酶二聚體的含量為31.19%～32.89%；相對偏差均低于3%，具體試驗結(jié)果見表2。

表2 實際樣品中溶菌酶二聚體含量測定結(jié)果%

3 結(jié) 論

圖2 溶菌酶二聚體線性試驗電泳圖

本試驗分別對SDS-PAGE 法測定溶菌酶二聚體的電泳條件、染色液選擇、標(biāo)準(zhǔn)曲線以及精密度等因素進行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)采用15 mA 恒電流進行蛋白的濃縮分離、快速考馬斯亮藍(lán)進行蛋白膠染色，試驗時間較短且溶菌酶二聚體條帶較為清晰。線性試驗數(shù)據(jù)表明，溶菌酶二聚體標(biāo)準(zhǔn)溶液在1.0 mg/mL 以下具有較好的線性關(guān)系。精密度實驗以及實樣檢測均表明，SDS-PAGE 方法測定飼料添加劑溶菌酶二聚體含量具有操作簡單、準(zhǔn)確可靠等特點，適用于飼料添加劑溶菌酶二聚體質(zhì)量分析。