吳 瑕, 孫潤(rùn)聰, 劉志強(qiáng), 查 健, 龔國(guó)利

(陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院, 陜西 西安 710021)

0 引言

大腸桿菌(Escherichiacoli)是一種常見(jiàn)的革蘭氏陰性致病菌,嚴(yán)重危害人類(lèi)及動(dòng)物健康安全.針對(duì)大腸桿菌感染,常用的治療方法是使用抗生素.由于大腸桿菌對(duì)傳統(tǒng)的抗生素已產(chǎn)生一定程度的耐受性甚至抗性,因此,新型抗菌劑的開(kāi)發(fā)對(duì)于預(yù)防及治療大腸桿菌感染具有重要意義.

目前，研究較多的一類(lèi)新型抗菌劑為細(xì)菌裂解酶(Bacteriolytic enzymes),其特異性地識(shí)別并降解細(xì)菌細(xì)胞壁肽聚糖,引起菌體溶脹破裂及死亡[1,2].然而,革蘭氏陰性菌的細(xì)胞壁外側(cè)包裹著一層細(xì)胞外膜,通透性低,可阻止細(xì)菌裂解酶與肽聚糖接觸[3].因此,細(xì)菌裂解酶對(duì)革蘭氏陰性菌通常缺乏明顯的抗菌效果.

為提高細(xì)菌裂解酶對(duì)革蘭氏陰性菌的抗菌活性,通常使用輔助劑,通過(guò)干擾細(xì)胞外膜的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性以提高其通透性,促進(jìn)細(xì)菌裂解酶跨過(guò)細(xì)胞外膜,從而對(duì)細(xì)胞壁進(jìn)行水解[4].常用的輔助劑包括有機(jī)酸(如EDTA、乳酸、檸檬酸)和富含正電荷的聚合物(如聚賴(lài)氨酸、荷正電抗菌肽、魚(yú)精蛋白)等[3].

另一種方法是直接對(duì)細(xì)菌裂解酶進(jìn)行改造,在保持其抗菌活性的同時(shí),使其具有穿透細(xì)胞外膜的功能.例如,將鼠疫菌素(Pesticin)的FyuA結(jié)合區(qū)域融合于T4溶菌酶的C端,該融合酶可通過(guò)FyuA轉(zhuǎn)運(yùn)體跨過(guò)大腸桿菌細(xì)胞外膜,在2 h內(nèi)對(duì)多種臨床分離菌株可達(dá)到90%以上的殺菌率[5].類(lèi)似的方法也成功用于殺滅銅綠假單胞菌[6].然而,這一方法依賴(lài)于對(duì)目標(biāo)細(xì)菌跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)體的充分了解,不易推廣.

另一種便捷的方法將抗菌肽融合于細(xì)菌裂解酶的一端,可極大提高酶對(duì)銅綠假單胞菌、鮑曼不動(dòng)桿菌等細(xì)菌的跨膜殺菌效果[7-9].然而,在這些研究中,抗菌肽自身具有較強(qiáng)的殺菌效果,且融合酶的殺菌活性與這些抗菌肽相近；表觀(guān)殺菌活性是否主要來(lái)源于抗菌肽,目前尚無(wú)報(bào)道.此外,抗菌肽的特異性低,導(dǎo)致該方法在精準(zhǔn)殺菌領(lǐng)域的用途受限.

為解決這一問(wèn)題,本研究采用新的策略,選取T4溶菌酶(T4 lysozyme,T4L),將細(xì)胞穿透肽(Cell-penetrating peptide,CPP)融合于其N(xiāo)端.T4L是大腸桿菌T4噬菌體產(chǎn)生的一種具有溶菌酶活性的細(xì)菌裂解酶,可特異性地識(shí)別大腸桿菌的細(xì)胞壁肽聚糖，降解N-乙酰胞壁酸和N-乙酰葡糖胺之間的β-1,4-糖苷鍵[10].CPP是一類(lèi)具有穿膜功能的疏水型、陽(yáng)離子型或兩親型短肽,常被用于協(xié)助藥物的跨膜遞送[11,12].本研究所選用的T4L和CPP在單獨(dú)使用時(shí)對(duì)大腸桿菌無(wú)明顯殺菌效果,然而二者的融合體CPP-T4L可在低濃度下快速殺滅大腸桿菌.本研究有望為抗革蘭氏陰性菌的新型抗菌劑開(kāi)發(fā)提供思路.

1 材料和方法

1.1 試劑與儀器

LB培養(yǎng)基購(gòu)于北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司.分子克隆所用酶制劑及試劑盒均來(lái)自于天根生化科技有限公司.引物合成及質(zhì)粒測(cè)序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成.

恒溫?fù)u床(天津歐諾儀器股份有限公司),Velocity 18R型冷凍離心機(jī)(Dynamica),SCIENTZ-II D型超聲破碎儀(寧波新芝生物科技有限公司),A200型PCR儀(杭州朗基科學(xué)儀器有限公司),Infinite M NANO型酶標(biāo)儀(TECAN),LSM800激光共聚焦顯微鏡(德國(guó)卡爾蔡司).

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 質(zhì)粒及菌株構(gòu)建

以T4L的編碼基因(Addgene 18110)為模板,利用表1中的引物組T4L-F/R進(jìn)行PCR擴(kuò)增,克隆于表達(dá)質(zhì)粒pGS21a(南京金斯瑞生物科技有限公司)的NdeI和XhoI酶切位點(diǎn)之間,形成質(zhì)粒pGS21a-T4L.

將每一種CPP(本研究選取Pc、Pa和Ph三個(gè)CPP)對(duì)應(yīng)的兩條引物(含有GSA連接肽對(duì)應(yīng)基因序列及NdeI酶切位點(diǎn),如表1所示)進(jìn)行退火及延伸,用AseI和XhoI進(jìn)行酶切,連接至載體pGS21a的NdeI和XhoI酶切位點(diǎn)之間,形成質(zhì)粒pGS21a-CPP.將T4L基因或溶葡球菌酶(lysostaphin,Lst)基因[13]克隆至該載體的NdeI和XhoI酶切位點(diǎn)之間,形成質(zhì)粒pGS21a-CPP-T4L或pGS21a-CPP-Lst.

表1 本研究使用的引物列表

將構(gòu)建的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌菌株Top10中,提取質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證,將序列正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌表達(dá)菌株BL21(DE3)pLysS中.

1.2.2 酶的重組表達(dá)

將含有不同質(zhì)粒的表達(dá)菌株BL21(DE3)pLysS在LB培養(yǎng)基中(添加50μg/mL氨芐青霉素、20μg/mL氯霉素)于37 ℃、200 rpm培養(yǎng)12 h,之后取5 mL轉(zhuǎn)移至250 mL 含有氨芐青霉素和氯霉素的LB培養(yǎng)基中,于37 ℃、200 rpm培養(yǎng)至OD600達(dá)到0.5～0.7,加入0.5 mM 異丙基β-D-硫代半乳糖苷(Isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG)誘導(dǎo),在20 ℃、200 rpm對(duì)目的蛋白表達(dá)5 h.對(duì)于CPP-T4L,誘導(dǎo)條件為0.05 mM IPTG,2 h.表達(dá)完成后,于4 000 rpm、4 ℃離心收集細(xì)胞,以NPB緩沖液(50 mM磷酸鈉、500 mM氯化鈉,pH 8)重懸后冷凍于-80 ℃.

1.2.3 酶的純化

上一步冷凍的細(xì)胞在室溫解凍后,加入0.5 mM 苯甲基磺酰氟(Phenylmethylsulfonyl fluoride,PMSF)及5μg/mL DNA酶I,在冰上超聲破碎細(xì)胞,以4 000 rpm、4 ℃離心20 min后,將上清與預(yù)先平衡的Ni-NTA瓊脂糖凝膠在快速純化管中孵育2 h(4 ℃,120 rpm),棄去流出液,用含有20 mM咪唑的NPB緩沖液沖洗后,以含有250 mM咪唑的NPB緩沖液洗脫目的蛋白,在PBS緩沖液(pH 7.4)中透析,過(guò)濾除菌后存于4 ℃.

1.2.4 細(xì)胞壁的提取

將大腸桿菌菌株Top10過(guò)夜培養(yǎng)液以1∶50稀釋率轉(zhuǎn)接至新鮮LB培養(yǎng)基,于37 ℃、200 rpm培養(yǎng)至OD600=0.5～0.7時(shí),以4 000 rpm離心20 min,棄去上清,按照已報(bào)道的方法提取細(xì)胞壁[14].

1.2.5 細(xì)胞壁的降解動(dòng)力學(xué)測(cè)定

在96孔板中,將30μL細(xì)胞壁與200μL酶液(稀釋至100 nM)混合,用酶標(biāo)儀測(cè)試OD600的下降.對(duì)照組將酶液替換為PBS緩沖液.

1.2.6 酶的殺菌活性測(cè)定

將菌株Top10的過(guò)夜培養(yǎng)液以1∶50轉(zhuǎn)接至新鮮LB培養(yǎng)基,在37 ℃,200 rpm條件下培養(yǎng)至OD600達(dá)到0.5～0.7.離心收集細(xì)胞(12 000 rpm,2 min),用無(wú)菌PBS緩沖液潤(rùn)洗兩次,重懸于PBS緩沖液中至菌濃為1×107CFU/mL.在96孔板中,將15μL細(xì)胞、75μL酶液(稀釋至不同濃度)、60μL PBS緩沖液混合均勻,對(duì)照組將酶液替換為PBS緩沖液.每個(gè)樣品做3次生物學(xué)重復(fù).對(duì)于含有EDTA的測(cè)試體系,將反應(yīng)體系中的15μL PBS緩沖液替換為15μL EDTA溶液(3 mM,溶于PBS緩沖液中).將96孔板于22 ℃,120 rpm孵育3 h,對(duì)細(xì)胞進(jìn)行梯度稀釋,將5μL菌液點(diǎn)涂于LB瓊脂平板,于37 ℃孵育16 h,進(jìn)行菌落計(jì)數(shù).

1.2.7 細(xì)胞染色實(shí)驗(yàn)

取500μL菌株Top10的過(guò)夜培養(yǎng)液,轉(zhuǎn)接至25 mL新鮮LB培養(yǎng)基中,在37 ℃,200 rpm條件下培養(yǎng)至OD600達(dá)到0.5～0.7.離心收集細(xì)胞(12 000 rpm,2 min),用無(wú)菌PBS緩沖液潤(rùn)洗兩次,重懸于PBS緩沖液中至OD600為1.2.將400μL細(xì)胞與500μL 酶液(1μM)及100μL PBS混合.對(duì)于含有EDTA的測(cè)試體系,將100μL PBS緩沖液替換為100 μL EDTA溶液(3 mM,溶于PBS緩沖液中).對(duì)照組將酶液換為PBS緩沖液.每個(gè)樣品均設(shè)置三個(gè)生物學(xué)重復(fù).在120 rpm室溫?fù)u床孵育1 h后,加入10μL碘化丙啶溶液(1 mg/mL),孵育15 min,以12 000 rpm離心2 min,用PBS潤(rùn)洗兩次,重懸于250μL PBS中.

取200μL菌液置于96孔板中,分別在600 nm及488/645 nm測(cè)定菌液的濁度及熒光.剩余菌液通過(guò)激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)胞內(nèi)染色狀況.

2 結(jié)果與討論

2.1 融合酶的構(gòu)建

本研究在基因?qū)用鎸PP融合于T4L的N端,并引入柔性的GSA連接肽[15]將二者分隔,以減少CPP對(duì)T4L活性的干擾,如圖1所示.為解析不同CPP對(duì)融合酶穿膜能力及抗菌性能的影響,選取三種典型的CPP[16-18],分別為陽(yáng)離子型TAT48-60肽(cationic peptide,Pc),兩親型MAP模式肽(amphipathic peptide,Pa)及疏水型MPG肽(hydrophobic peptide,Ph)(如圖1所示).對(duì)T4L及各融合酶進(jìn)行重組表達(dá),通過(guò)SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn),所有酶均以可溶性形式表達(dá),通過(guò)鎳柱進(jìn)行親和純化后,可得到純度較高的重組酶,如圖2所示.

圖1 融合酶的設(shè)計(jì)

圖2 酶表達(dá)及純化的SDS-PAGE分析(L：蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品；-：誘導(dǎo)前；+：誘導(dǎo)后；T：總蛋白；S：可溶性蛋白；U：未與鎳柱結(jié)合的蛋白；W：鎳柱沖洗液；E：洗脫液)

2.2 融合酶對(duì)細(xì)胞壁的降解活性

提取大腸桿菌Top10菌株的細(xì)胞壁,以T4L及各融合酶對(duì)其進(jìn)行酶解動(dòng)力學(xué)測(cè)試,以此反映CPP的融合對(duì)T4L酶活的影響.結(jié)果顯示,在PBS緩沖液中(不含酶),細(xì)胞壁的濁度略有下降,主要由細(xì)胞壁自由沉降引起(如圖3所示).T4L可將不溶性的細(xì)胞壁肽聚糖降解為可溶性寡糖片段,引起細(xì)胞壁懸濁液的濁度下降,在2 min時(shí)達(dá)到平衡.Pc-T4L和Ph-T4L對(duì)細(xì)胞壁的降解曲線(xiàn)及初始降解速率(如表2所示)與T4L近似,表明這兩種CPP的融合對(duì)T4L的酶活無(wú)明顯影響.然而,Pa的融合顯著降低了T4L的酶活,初始反應(yīng)速率相比T4L下降了90.7%.

圖3 T4L及CPP-T4L對(duì)大腸桿菌Top10菌株細(xì)胞壁的降解特性

表2 T4L及CPP-T4L降解大腸桿菌Top10菌株細(xì)胞壁的初始速率

2.3 融合酶對(duì)大腸桿菌的穿膜效果研究

本研究使用融合酶對(duì)大腸桿菌進(jìn)行孵育處理,采用碘化丙啶染色測(cè)試融合酶的穿膜效果.然而,T4L的活性導(dǎo)致嚴(yán)重的細(xì)胞裂解及死亡,不利于染色結(jié)果的觀(guān)測(cè).為此,本研究選取對(duì)大腸桿菌無(wú)殺菌效果的溶葡球菌酶(lysostaphin,Lst)[15],構(gòu)建CPP-Lst融合體(融合方式同圖1),測(cè)試其對(duì)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的穿透效果，結(jié)果如圖4所示.

圖4 不同CPP對(duì)大腸桿菌Top10菌株的穿膜效果差異

僅用Lst處理細(xì)胞后,極少量的碘化丙啶可進(jìn)入細(xì)胞并將其染為紅色；通過(guò)添加0.3 mM EDTA破壞細(xì)胞外膜的穩(wěn)定性,可增強(qiáng)細(xì)胞染色,但染色程度不高.相比之下,經(jīng)CPP-Lst處理的細(xì)胞可被成功染色,且添加EDTA對(duì)染色無(wú)明顯增強(qiáng)作用,表明CPP的融合足以增強(qiáng)細(xì)胞外膜及細(xì)胞內(nèi)膜對(duì)碘化丙啶的通透性.通過(guò)對(duì)細(xì)胞的熒光強(qiáng)度定量分析(如圖5所示)發(fā)現(xiàn),Pc和Pa兩種CPP的穿膜效果接近,Ph的穿膜效果較差.另外,使用CPP的穿膜效果優(yōu)于單獨(dú)使用EDTA.這些結(jié)果證明,本研究所選用的CPP可有效穿透大腸桿菌的細(xì)胞外膜及細(xì)胞內(nèi)膜.

圖5 經(jīng)CPP-Lst處理及碘化丙啶染色后,大腸桿菌菌株Top10細(xì)胞的熒光強(qiáng)度分析

2.4 CPP-T4L對(duì)大腸桿菌的殺菌活性

以106CFU/mL指數(shù)中期大腸桿菌細(xì)胞為底物,對(duì)CPP-T4L在3 h內(nèi)的殺菌活性進(jìn)行測(cè)試.結(jié)果表明(如圖6所示),相比于T4L,融合酶Pc-T4L和Pa-T4L對(duì)菌體表現(xiàn)出依賴(lài)于酶濃度的殺菌能力,在1.75μM(約35μg/mL)時(shí)可殺滅約70%的菌體,這一結(jié)果與細(xì)胞染色結(jié)果一致.在測(cè)試體系中加入0.3 mM EDTA可明顯增強(qiáng)殺菌效果,其中1.75μM的 Pa-T4L可殺滅94%的菌體,這與細(xì)胞染色結(jié)果不一致,表明Pc和Pa兩種CPP雖可穿透細(xì)胞外膜,但其在細(xì)胞外膜上形成的孔道尺寸不足以使T4L這一大分子完全通過(guò),需借助EDTA的作用進(jìn)一步提高細(xì)胞外膜的通透性,從而提高融合酶的殺菌能力.相比于Pc及Pa兩種CPP,盡管Ph-Lst展現(xiàn)出較好的穿膜特性(如圖4及圖5所示),但Ph-T4L并無(wú)殺菌活性(如圖6所示),可能的原因在于Ph在細(xì)胞外膜上形成的孔道尺寸遠(yuǎn)小于T4L的尺寸,且EDTA的協(xié)助不足以使T4L穿透細(xì)胞外膜.另外,值得注意的是,在細(xì)胞壁降解實(shí)驗(yàn)中,Pa-T4L的酶活僅為Pc-T4L的9.3%,然而在殺菌實(shí)驗(yàn)中,Pa-T4L的活性高于Pc-T4L.這一結(jié)果表明,在該殺菌體系中,T4L具有過(guò)量酶活,殺菌過(guò)程的限制步驟為融合酶對(duì)細(xì)胞外膜的穿透.

(a)1 μM

為衡量CPP-T4L的殺菌活性是否由CPP自身引起,本研究對(duì)CPP-Lst的殺菌效果進(jìn)行測(cè)定.如圖7所示,Lst及CPP-Lst對(duì)大腸桿菌無(wú)明顯殺菌活性；在0.3 mM EDTA存在條件下,CPP-Lst展示出較低的、依賴(lài)于酶濃度的殺菌活性,在3 h內(nèi)殺菌率低于40%.該活性由CPP導(dǎo)致的菌體膜結(jié)構(gòu)損傷引起,遠(yuǎn)低于Pc-T4L及Pa-T4L在對(duì)應(yīng)條件下的殺菌率.因此,Pc-T4L及Pa-T4L相比于T4L的優(yōu)異殺菌性能來(lái)源于兩方面：一方面,Pc及Pa自身引起膜損傷從而導(dǎo)致少量菌體死亡；另一方面,Pc及Pa與T4L的融合可促進(jìn)T4L跨過(guò)細(xì)胞外膜,從而與其底物細(xì)胞壁肽聚糖充分接觸,通過(guò)降解肽聚糖實(shí)現(xiàn)快速殺菌.

(a)1 μM

3 結(jié)論

本研究針對(duì)大腸桿菌細(xì)胞外膜通透性差、傳統(tǒng)細(xì)菌裂解酶無(wú)法發(fā)揮抗菌作用這一問(wèn)題,取T4L為研究對(duì)象,通過(guò)在其N(xiāo)端融合不同類(lèi)型的CPP,極大提高了酶對(duì)大腸桿菌的跨膜殺菌能力.其中Pa這一兩親型CPP與T4L的融合體Pa-T4L在單獨(dú)使用或與0.3 mM EDTA聯(lián)合使用時(shí),可在3 h內(nèi)分別達(dá)到70%或94%的殺菌率.本研究為革蘭氏陰性菌抗菌酶的開(kāi)發(fā)提供了參考.后續(xù)研究可圍繞兩親型CPP的序列優(yōu)化展開(kāi),以期進(jìn)一步提高CPP-T4L對(duì)大腸桿菌的殺菌活性.