樊子便，武希璇，劉勝男，杜 安，賈 瑋*

(1.陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，陜西 西安 710021；2.三門峽海關(guān)，河南 三門峽 472000)

0 引言

食品香精香料是用于改善、增加和模仿食品香味的食品添加劑，具有組成復(fù)雜、易揮發(fā)、不穩(wěn)定等特點[1,2].我國現(xiàn)行的食品安全國家標準《GB 2760-2014食品添加劑使用標準》對巴氏殺菌乳、滅菌乳、發(fā)酵乳、稀奶油及嬰幼兒配方乳粉做了明確規(guī)定，不得添加任何香精香料.針對乳制品，不僅脂肪、蛋白質(zhì)及糖類等非揮發(fā)性成分組成復(fù)雜，其酸類、酯類、醇類、酮類與醛類等揮發(fā)性成分的組成亦十分豐富，且部分易揮發(fā)性成分具有熱敏性與易氧化性[3-6].此外，乳制品中部分風(fēng)味性成分含量較低，卻有較低的嗅閾值濃度因而對風(fēng)味組成有較大貢獻，需要對前處理方法的條件參數(shù)進行優(yōu)化，提高致香成分檢測的準確性與精確性[7-9].

因此，為了真實全面地測定乳及乳制品中致香成分的組成，需要選擇密閉、低溫且高效的前處理方式.凝膠滲透色譜是食品分析領(lǐng)域樣品前處理凈化的有效手段，依據(jù)分子質(zhì)量大小可實現(xiàn)不同化合物的分離，能夠有效去除基質(zhì)中的脂肪、蛋白質(zhì)、色素、多糖等大分子成分[10,11].物質(zhì)的捕集是研究基質(zhì)中揮發(fā)性成分的關(guān)鍵步驟，對研究結(jié)果定量限有關(guān)鍵性影響.

食品中揮發(fā)性成分提取與富集的前處理方式主要有液液萃取法、超臨界流體萃取法、溶劑輔助致香成分蒸餾法、頂空法、動態(tài)頂空法、頂空固相微萃取法等[12-15].其中液液萃取法相較于其他樣品前處理技術(shù)，具有萃取風(fēng)味物質(zhì)數(shù)量多、成分較齊全以及不會污染色譜柱等優(yōu)點,在分離提取研究中被廣泛采用[16].氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)通過整合氣相與質(zhì)譜在分離和檢測方面的優(yōu)勢，具有高分辨率、高靈敏度、操作簡便等特點非常適合復(fù)雜樣品的準確分離鑒定，近年來也逐步應(yīng)用于風(fēng)味分析研究中[17-20].

本研究選擇液液萃取結(jié)合凝膠滲透色譜法作為前處理手段運用氣相色譜-質(zhì)譜分析法對巴氏殺菌乳、超高溫瞬時滅菌乳、發(fā)酵乳、稀奶油以及嬰幼兒配方乳粉與奶味香精、發(fā)酵乳味香精及稀奶油香精中5類致香成分進行分析，進而建立乳制品中香精香料的分析方法.旨在為監(jiān)控乳制品中香精香料提供技術(shù)支持，為食品安全監(jiān)管提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乳制品(當(dāng)?shù)爻?；氯化鈉(GR)(荷蘭Akzo Nobel公司)；0.20μm微孔濾膜(美國Pall公司)；環(huán)己烷(HPLC)(美國Fisher科技公司)；乙酸乙酯(HPLC)(美國Fisher科技公司)；正己烷(HPLC)(美國Fisher科技公司)；甲醇、乙腈、甲苯(AR)(德國Merck公司)；5種致香成分及相關(guān)化學(xué)品標準物質(zhì)(德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司、德國Sigma-Aldrich公司、德國Witega公司).

1.2 儀器與設(shè)備

7890A-5975C氣相色譜-質(zhì)譜儀(美國Agilent Technologies公司)；Vortex.Genie2T型旋渦混合器(美國Scientific Industries公司)；SA31型振蕩器(日本Yamata公司)；超聲波清洗器(江蘇昆山超聲儀器有限公司)；AL204-IC型分析天平(瑞士Mettler Toledo公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮儀(瑞士Buchi公司)；ED-115型恒溫干燥箱(德國Binder公司)；SevenEasy S20K型pH計(瑞士Mettler Toledo公司)；凝膠滲透色譜儀(德國J2 Scientific公司)；20 mm × 210 mm GPC凈化柱(德國J2 Scientific公司)；200μm-400μm S-X3聚苯乙烯微球凝膠填料(美國Bio-Beads公司)；Milli-Q Integral型純水儀(美國Millipore公司).

1.3 實驗方法

1.3.1 溶液的配制

分別稱取香精香料及標準物質(zhì)10 mg(精確至0.1 mg)于10 mL容量瓶內(nèi)，依據(jù)香精香料及相關(guān)化學(xué)品標準物質(zhì)在不同溶劑(甲醇、乙腈和甲苯)中溶解度與檢測需要，選用合適的溶劑溶解并定容至10 mL，配制成1 000 mg·L-1單一化合物標準儲備液，于-20 ℃避光保存.根據(jù)檢測需要，移取單一化合物標準儲備液于100 mL容量瓶中，用甲醇-水溶液(1∶1，v/v)定容至刻度，配制相應(yīng)濃度的混合標準工作溶液.混標工作液置于棕色密閉瓶中-18 ℃避光保存，有效期為一個月.

1.3.2 樣品前處理

對于巴氏殺菌乳、超高溫瞬時滅菌乳、發(fā)酵乳與稀奶油液態(tài)樣品，將其搖勻分裝，-20 ℃保存.對于嬰幼兒配方乳粉呈均勻狀的粉狀樣品，可直接分裝，于室溫下避光密閉保存.

分別稱取混勻試樣2 g(精確到0.01 g)于50 mL具塞離心管中，加入10 mL環(huán)己烷溶解樣品，高速渦旋混合1 min.加入5 mL飽和氯化鈉水溶液，振蕩20 min，以10 000 r·min-1低溫離心5 min，取環(huán)己烷層轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，用環(huán)己烷-乙酸乙酯(1∶1，v/v)定容至10 mL.凝膠滲透色譜凈化，紫外檢測器檢測波長210 nm，洗脫流速3.5 mL·min-1，收集16.6～18.8 min凈化液，25 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，用5 mL正己烷溶解，運用氣相色譜-質(zhì)譜儀分析.

1.3.3 色譜質(zhì)譜條件

色譜柱：DB-5 MS(30 m×0.25 mm，0.25μm)彈性石英毛細管柱，不分流恒流模式，流速1 mL·min-1；柱溫箱升溫程序：40 ℃保持3 min，以3 ℃·min-1升至170 ℃保持3 min，以10 ℃·min-1升至230 ℃保持3 min；載氣：高純氦氣(99.999%).

質(zhì)譜條件：電子轟擊(EI)離子源；電子能量：70 eV；進樣口溫度：250 ℃；傳輸線溫度：250 ℃；離子化方式：離子源溫度：230 ℃；溶劑延遲時間：3 min；掃描時間：3～60 min；采用全掃描方式(SCAN)與選擇離子掃描模式(SIM).

2 結(jié)果與討論

2.1 凝膠滲透色譜凈化條件優(yōu)化

2.1.1 GPC收集時間的優(yōu)化

實驗中樣品經(jīng)凝膠滲透色譜凈化后運用氣相色譜質(zhì)譜檢測，乳制品樣品經(jīng)環(huán)己烷提取后，經(jīng)自動取樣裝置將溶液注入凝膠滲透色譜柱中.環(huán)己烷-乙酸乙酯(1∶1，v/v)通過高壓泵對樣品進行洗脫.對表1中的目標化合物進行分析，具有干擾性的蛋白質(zhì)、脂肪相對分子質(zhì)量較大，沿聚苯乙烯微球凝膠的間隙流出，凝膠滲透色譜系統(tǒng)配有紫外-可見光光度檢測器(檢測波長設(shè)為210 nm)，出峰時間在4.0～10.0 min.目標分析物2-壬酮、十五烷、2,4-二叔丁基苯酚、月桂酸與3-乙基-5-(2-乙基丁基)-十八烷的相對分子質(zhì)量較小，可以進入聚苯乙烯微球凝膠內(nèi)部，保留時間靠后，在16.0～19.0 min出峰.根據(jù)目標分析物與雜質(zhì)的保留時間，可以將相對分子質(zhì)量較大的脂肪與蛋白質(zhì)通過六通閥連通位置的轉(zhuǎn)換切入廢液流路中，將待分析溶液切換至捕集環(huán)流路中，濃縮定容后，運用氣相色譜-質(zhì)譜檢測.

表1 5種目標化合物氣相色譜-質(zhì)譜參數(shù)

六通閥連通位置切換程序為凝膠滲透色譜凈化的關(guān)鍵.圖1、圖2、圖3、圖4與圖5分別為巴氏殺菌乳、超高溫瞬時滅菌乳、發(fā)酵乳、嬰幼兒配方乳粉與稀奶油樣品經(jīng)環(huán)己烷提取后上樣的紫外凝膠滲透色譜流出曲線.

圖1 巴氏殺菌乳樣品通過凝膠滲透色譜柱紫外210 nm檢測圖

圖2 超高溫瞬時滅菌乳通過凝膠滲透色譜柱紫外210 nm檢測圖

圖3 發(fā)酵乳通過凝膠滲透色譜柱紫外210 nm檢測圖

圖4 嬰幼兒配方乳粉通過凝膠滲透色譜柱紫外210 nm檢測圖

圖5 稀奶油通過凝膠滲透色譜柱紫外210 nm檢測圖

根據(jù)待分析物中相對分子質(zhì)量最大的3-乙基-5-(2-乙基丁基)-十八烷(相對分子質(zhì)量366.7)和相對分子質(zhì)量最小的2-壬酮(相對分子質(zhì)量142.2)在凝膠滲透色譜柱上的保留時間(分別為16.9 min和17.9 min)，確定凝膠滲透色譜流出液的收集時間優(yōu)化的范圍為16.00～19.00 min(3-乙基-5-(2-乙基丁基)-十八烷起始時間和2-壬酮的結(jié)束時間).實驗中根據(jù)5種目標物質(zhì)的質(zhì)譜響應(yīng)(峰面積)作為評價六通閥切換程序的指標.將凝膠滲透色譜六通閥連通位置由廢液流路切入捕集環(huán)的起始時間初設(shè)為16.00 min，優(yōu)化的步長為0.20 min，縮短洗脫液流入捕集環(huán)時間；固定六通閥連通位置重新切至廢液的時間為19.0 min，0.20 min為間隔，將閥切換的時間逐步提前.圖6為5種化合物流出程序的優(yōu)化結(jié)果.

(a)切入捕集環(huán)時間與GC-MS峰面積的關(guān)系

若運用六通閥將目標分析物切入捕集環(huán)中過遲，或在目標分析化合物還未完全洗脫就將六通閥連通流路切入廢液，待分析目標物質(zhì)就會損失，造成化合物回收率下降；若運用六通閥將脂肪與蛋白質(zhì)等雜質(zhì)切入捕集環(huán)中過早，相對分子質(zhì)量較大的雜質(zhì)會進入捕集環(huán)，若目標化合物經(jīng)洗脫完后，未將連通閥連接流路切入廢液，分子量較小的雜質(zhì)也會進入捕集環(huán).控制凝膠滲透色譜的收集時間為16.60～18.80 min，可以提高凝膠滲透色譜對于樣品的凈化效果，實驗結(jié)果(圖7)表明，凈化效果較好.

圖7 巴氏殺菌乳中目標分析物的GPC凈化色譜圖

2.1.2 洗脫速度的優(yōu)化

實驗中研究了洗脫速度對目標化合物的分離效果的影響，設(shè)置了1.0 mL·min-1、1.5 mL·min-1、2.0 mL·min-1、2.5 mL·min-1、3.0 mL·min-1、3.5 mL·min-1、4.0 mL·min-1、4.5 mL·min-1、5.0 mL·min-1，當(dāng)流速大于4.0 mL·min-1時，快流速使目標物與脂肪、蛋白質(zhì)分離效果不佳，當(dāng)流速小于3.0 mL·min-1時，流速過慢使得樣品的保留時間區(qū)帶變寬，擴散加劇使得實驗時間延長，故洗脫速度采用3.5 mL·min-1.

2.2 方法學(xué)驗證

由于致香成分為乳制品的內(nèi)源性物質(zhì)，無法得到基質(zhì)空白，因此以超純水作為樣品取代基質(zhì)，進行方法學(xué)參數(shù)考察.采用自動進樣器直接進樣法，將香精香料及相關(guān)化學(xué)品系列混合標準物質(zhì)溶液加入10 g超純水樣品取代基質(zhì)，進行方法學(xué)參數(shù)考察.

2.2.1 方法的標準曲線、線性范圍及相關(guān)系數(shù)

配制5種香精香料的系列混合標準物質(zhì)溶液，質(zhì)量濃度分別為0.1μg·L-1、0.5μg·L-1、1.0μg·L-1、5.0μg·L-1、10μg·L-1、20μg·L-1、50μg·L-1、100μg·L-1、200μg·L-1、500μg·L-1、1000μg·L-1、2000μg·L-1、2500μg·L-1、5000μg·L-1.以目標組分定量離子色譜峰峰面積(Y)為縱坐標，各被測組分的質(zhì)量濃度(X,μg·L-1)為橫坐標繪制基質(zhì)標準曲線.表2所示的結(jié)果表明，5種香精香料化合物在0.1μg·L-1～200μg·L-1范圍內(nèi)具有較好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)(r2)均大于0.99.

2.2.2 方法的確定限、加標回收率與精密度

在純水取代基質(zhì)中分別添加濃度為CCβ，2倍CCβ和4倍CCβ，三個水平的香精香料系列混合標準物質(zhì)溶液，計算平均回收率與相對標準偏差.目標分析物的校正方程、線性范圍、確定限(CCα)和檢測容量(CCβ)見表2所示.結(jié)果表明，方法的確定限為0.02～0.31μg·kg-1；檢測容量為0.06～0.51μg·kg-1；回收率為83%～91%，相對標準偏差為1.3%～5.6%.表明所建立的方法準確性和精密度良好.

2.3 實際樣品分析

應(yīng)用已建立的凝膠滲透色譜-氣相色譜-質(zhì)譜方法對市售的乳制品：巴氏殺菌乳(十八個品牌的各十二個批次產(chǎn)品)、超高溫瞬時滅菌乳(二十個品牌的各十二個批次產(chǎn)品)、發(fā)酵乳(十三個品牌的各十六個批次產(chǎn)品)、稀奶油(十個品牌的各十六個批次產(chǎn)品)與嬰幼兒配方乳粉(十六個品牌的各十二個批次產(chǎn)品)；市售香精樣品：奶味香精(二十三個品牌的三十一種)、發(fā)酵乳味香精(二十四個品牌的二十五種)與稀奶油味香精(十七個品牌的十九種)進行分析檢測，結(jié)果如表3所示.

表3 典型乳及乳制品與香精樣品成分測定結(jié)果

乳制品與香精樣品中共有且含量均較高的成分有2-壬酮，十五烷，月桂酸.香精樣品中均有而乳制品中沒有的成分有：2,4-二叔丁基苯酚，3-乙基-5-(2-乙基丁基)-十八烷.故可對乳制品中是否含有以上成分，來判定乳制品中是否違禁添加香精.

3 結(jié)論

本文建立了基于凝膠滲透色譜-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用快速分析測定乳制品中5種致香成分的方法.采用液液萃取法結(jié)合優(yōu)化條件后的凝膠滲透色譜技術(shù)對樣品進行前處理并對實驗的標準曲線、準確度、精密度方面進行了驗證，結(jié)果均滿足對以上5類致香成分定量分析的要求，為乳制品中香精香料的篩查分析提供了新的思路.