陳柯貝，黃小妹，莫桂梅，曾詩穎，吳玉強(qiáng),2*

(1.廣西中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，廣西 南寧 530200；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué) 制藥廠，廣西 南寧 530023)

0 引言

慢性盆腔炎癥(Chronic pelvic inflammatory disease，CPID)是婦科常見慢性疾病，以盆腔、子宮內(nèi)膜、腹膜和輸卵管等部位慢性炎癥為特征，臨床主要癥狀是下腹鈍痛，伴隨白帶增多、痛經(jīng)等[1].CPID為頑癥，易復(fù)發(fā)，難根治，不及時(shí)治療可導(dǎo)致不孕、卵巢輸卵管囊腫，甚至增加罹患輸卵管癌、卵巢癌、子宮癌的風(fēng)險(xiǎn)[2].目前，左氧氟沙星(Levofloxacin)是治療盆腔炎常用的有效藥物，但長期使用易產(chǎn)生耐藥性，且CPID多伴隨粘連和增生，西藥治療效果并不理想[3].

復(fù)方小鉆方，由小鉆、千斤拔、救必應(yīng)、雞血藤、飛龍掌血和一匹綢組成，具有活血通絡(luò)、散瘀消腫之功效，是廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院臨床治療CPID的臨床驗(yàn)方，在臨床上應(yīng)用效果顯著[4].已有報(bào)道，小鉆[4]、千斤拔[5]等有治療CPID的作用.本研究采用水提，醇提及醇提后水提等3種不同的提取方法，并制成顆粒，利用大鼠CPID模型，該模型與人類CPID的病理特點(diǎn)相似[6]，觀察3種小鉆顆粒對(duì)CPID大鼠的作用及機(jī)制，為復(fù)方小鉆方的進(jìn)一步制劑工藝研究和臨床應(yīng)用提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)藥物及試劑

3種小鉆顆粒，按提取方式分為顆粒Ⅰ(水提物顆粒，1 g顆粒相當(dāng)于原藥材6.42 g)、顆粒Ⅱ(醇提物顆粒，1 g顆粒相當(dāng)于原藥材9.15 g)和顆粒Ⅲ(醇提后水提混合顆粒，1 g顆粒相當(dāng)于原藥材5.48 g)，由廣西浦北制藥廠提供，批號(hào)分別為202011080003、202011090001和202011100001；花紅片，廣西壯族自治區(qū)花紅藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)20180306；鹽酸左氧氟沙星片，山東魯抗醫(yī)藥集團(tuán)賽特有限責(zé)任公司，批號(hào)191002；水合氯醛，成都市科隆化學(xué)品有限公司，批號(hào)2018041601；白介素1β(IL-1β)、IL-6試劑盒，欣博盛生物有限公司，批號(hào)分別為R200901-007a和R2010001-003a；SOD和MDA試劑盒，南京建成生物工程研究所，批號(hào)分別為20201007、20200716和20200930；4%多聚甲醛，蘭杰柯科技有限公司，批號(hào)70061000；羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)，天津市大茂化學(xué)試劑廠，批號(hào)20171215.

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

JM-A5002型電子天平，諸暨市超澤衡器設(shè)備有限公司；SQP型分析天平，賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司；TGL-16G型離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；M200PRO型酶標(biāo)儀，瑞士Tecan公司；LRH-250-A型生化培養(yǎng)箱，廣東泰宏君科學(xué)儀器股份有限公司；XT-2000i型全自動(dòng)血液分析儀，日本SYSMEX公司；DW-86L630型-80℃冰箱，澳柯瑪股份有限公司等.

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及飼養(yǎng)環(huán)境

SD大鼠，雌性，SPF級(jí)，購自廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK 桂2020-0003，飼養(yǎng)于廣西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，IVC塑料籠盒內(nèi)，飼養(yǎng)環(huán)境符合SPF級(jí)要求，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)為SYXK(桂)2019-0001.

1.4 藥液的配制

(1)水提物藥液的配制：取14.22 g顆粒Ⅰ，加0.5%CMC-Na至100 mL，充分混懸，即得水提物低劑量藥液(0.9 g/mL，藥物濃度及劑量按生藥量計(jì))，同法配制水提物高劑量藥液(1.8 g/mL).

(2)醇提物藥液的配制：取9.84 g顆粒Ⅱ，加0.5%CMC-Na至100 mL，充分混懸，即得醇提物低劑量藥液(0.9 g/mL)，同法配制醇提物高劑量藥液(1.8 g/mL).

(3)醇提后水提物藥液的配制：取16.43 g顆粒Ⅲ，加0.5%CMC-Na至100 mL，充分混懸，即得醇提后水提物低劑量藥液(0.9 g/mL)，同法配制醇提后水提物高劑量藥液(1.8 g/mL).

1.5 模型的復(fù)制

取雌性SD大鼠，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，禁食不禁水14～16 h.使用10%水合氯醛麻醉大鼠，打開腹腔，暴露左側(cè)子宮，取10 mL注射器針頭(去針尖)于子宮交匯點(diǎn)分別向左側(cè)子宮進(jìn)針，在子宮腔抽拉2次，并注入細(xì)菌混合液0.1 mL(由廣西中醫(yī)藥大學(xué)微生物免疫學(xué)教研室提供，大腸桿菌∶金黃色葡萄球菌=1∶1，細(xì)菌密度為3×109/mL)[7,8]，假手術(shù)組大鼠8只，僅進(jìn)行開腹找到左側(cè)子宮操作，術(shù)后，逐層縫合切口，碘伏消毒，并每天1次，術(shù)后連續(xù)碘伏7 d.

造模第10天，取模型大鼠72只隨機(jī)分為9組，即顆粒Ⅰ低、高劑量組(9、18 g/kg)，顆粒Ⅱ低、高劑量組(9、18 g/kg)，顆粒Ⅲ低、高劑量組(9、18 g/kg)，花紅片組(870 mg/kg)，左氧氟沙星片組(42 mg/kg)[8]和模型組，每組8只.假手術(shù)組和模型組大鼠，按10 mL/kg灌胃0.5%CMC-Na，其余大鼠按10 mL/kg灌胃對(duì)應(yīng)濃度的顆粒Ⅰ、顆粒Ⅱ、顆粒Ⅲ藥液或花紅片藥液或左氧氟沙星片藥液，每天1次，連續(xù)28 d.記錄給藥前、終末體重及每周體重.

1.6 采血及血常規(guī)檢測(cè)

禁食不禁水14～16 h，末次給藥后1 h，10%水合氯醛麻醉(300 mg/kg)，腹主動(dòng)脈采血，用EDTA-K2抗凝管收集抗凝血，使用全自動(dòng)血液分析儀檢測(cè)白細(xì)胞總數(shù)(WBC)和中性粒細(xì)胞(NEUT)水平[7].

1.7 子宮腫脹度和腫脹率

采血結(jié)束，迅速分離左右側(cè)子宮，計(jì)算子宮腫脹度(g)和腫脹率(%).子宮腫脹度=左側(cè)子宮質(zhì)量-右側(cè)子宮質(zhì)量；子宮腫脹率=100%×子宮腫脹度/右側(cè)子宮質(zhì)量[9].

1.8 血清IL-1β、IL-6、SOD和MDA水平

按試劑盒說明書要求，檢測(cè)血清IL-1β、IL-6、SOD和MDA水平.

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，計(jì)量數(shù)據(jù)以(±s)形式表示.多組間比較進(jìn)行One-Way ANOVA分析，兩組間比較采用LSD法分析(方差齊)或Dunnett's T3法分析(方差不齊).當(dāng)P<0.05則認(rèn)為數(shù)據(jù)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2 結(jié)果與討論

2.1 體質(zhì)量

由表1可見，與假手術(shù)組比較，給藥前及給藥4 w后，模型組大鼠體質(zhì)量及增長均顯著降低(P<0.05或P<0.01)；與模型組比較，給藥4 w后，小鉆顆粒Ⅰ低、高劑量組大鼠體質(zhì)量及增長均增加，其中高劑量組大鼠體質(zhì)量顯著增加(P<0.05)，低、高劑量組大鼠體質(zhì)量增長顯著增加(P<0.05或P<0.01)；顆粒Ⅱ低、高劑量組大鼠體質(zhì)量及增長均顯著增加(P<0.05或P<0.01)；顆粒Ⅲ低、高劑量組大鼠體質(zhì)量及增長均增加，其中高劑量組大鼠體質(zhì)量及增長顯著增加(P<0.05或P<0.01).

表1 三種小鉆顆粒對(duì)慢性盆腔炎大鼠體質(zhì)量的影響

2.2 子宮腫脹度和腫脹率

由表2可見，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠左、右側(cè)子宮質(zhì)量，子宮腫脹度及腫脹率均顯著增加(P<0.01)；與模型組比較，小鉆顆粒Ⅰ低、高劑量組大鼠左、右側(cè)子宮質(zhì)量，子宮腫脹度及腫脹率均降低，其中高劑量組大鼠右側(cè)子宮質(zhì)量及腫脹率顯著降低(P<0.05或P<0.01)，低、高劑量組大鼠左側(cè)子宮質(zhì)量及子宮腫脹度顯著降低(P<0.05或P<0.01)；顆粒Ⅱ低、高劑量組大鼠低、高劑量組左、右側(cè)子宮質(zhì)量，子宮腫脹度及腫脹率均顯著(P<0.05或P<0.01)；顆粒Ⅲ低、高劑量組大鼠左、右側(cè)子宮質(zhì)量，子宮腫脹度及腫脹率均降低，其中低、高劑量組大鼠左側(cè)子宮質(zhì)量，子宮腫脹度及腫脹率顯著降低(P<0.05或P<0.01).

表2 三種小鉆顆粒對(duì)慢性盆腔炎大鼠子宮腫脹度和腫脹率的影響

2.3 血常規(guī)

由表3可見，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血液白細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞百分比均顯著增加(P<0.01)；與模型組比較，3種小鉆顆粒低、高劑量組大鼠血液白細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞百分比均顯著降低(P<0.05或P<0.01).

表3 三種小鉆顆粒對(duì)慢性盆腔炎大鼠血常規(guī)的影響

2.4 血清IL-1β、IL-6、SOD和MDA水平

由表4可見，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清IL-1β、IL-6和MDA水平顯著升高(P<0.01)，SOD水平顯著降低(P<0.01)；與模型組比較，除顆粒Ⅰ低劑量組大鼠血清MDA水平差異不具顯著性(P>0.05)外，3種小鉆顆粒各劑量組大鼠血清IL-1β、IL-6和MDA水平均顯著降低(P<0.01)，SOD水平顯著升高(P<0.05或P<0.01).

表4 三種小鉆顆粒對(duì)慢性盆腔炎大鼠血清IL-1β、IL-6、SOD和MDA水平的影響

祖國醫(yī)學(xué)認(rèn)為，CPID屬于“癥瘕”、“帶下”、“積聚”、“腹痛”等范疇，與宋代陳自明《婦人良方》記載的“積聚”、“癥瘕”病癥一致，主要由于經(jīng)期、孕期等體虛不能捍邪，邪從外入，胞宮經(jīng)脈受損，血脈不通，不通則痛，CPID 的病機(jī)為血瘀[10]，治療當(dāng)活血化瘀、行氣止痛.現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，CPID是由于經(jīng)期不潔或流產(chǎn)等多種原因，導(dǎo)致子宮致炎菌感染，久不能愈，炎癥部位大量細(xì)胞壞死，膠原蛋白分泌形成結(jié)締組織增生，屬于病理Ⅱ愈合的范疇.由于結(jié)締組織不是正常的細(xì)胞，不能清除細(xì)菌，只能將其包裹，限制其致炎作用，即形成病灶，但當(dāng)人體抵抗力下降時(shí)，細(xì)菌致炎作用突破病灶，炎癥反應(yīng)刺激腹部神經(jīng)，就會(huì)出現(xiàn)腹部鈍痛.治療的關(guān)鍵，一是抗菌，二是促進(jìn)炎癥部位愈合，最好能根治病灶.西藥抗菌作用強(qiáng)，但對(duì)結(jié)締組織包裹的病灶無作用，故很難根治.中藥，特別是活血化瘀藥，可抑制成纖維細(xì)胞增殖，減少膠原合成，從而減少結(jié)締組織形成，清除病灶，抗炎促愈合[11].

復(fù)方小鉆方，以小鉆為君藥，祛風(fēng)活血、行氣止痛、散瘀消腫，有報(bào)道其有抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎[12]、抗炎鎮(zhèn)痛[13]、抗腫瘤[14]等作用；以千斤拔、救必應(yīng)和雞血藤為臣藥，千斤拔祛風(fēng)除濕、舒筋壯骨、活絡(luò)散瘀、解毒，有報(bào)道其有抗炎[15]、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫[16]等作用，救必應(yīng)瀉火解毒、清熱利濕、行氣止痛、涼血止血，有報(bào)道其有抗菌[17]、鎮(zhèn)痛抗炎[18]等作用，雞血藤行血補(bǔ)血，調(diào)經(jīng)，舒筋活絡(luò)，有報(bào)道其有活血、補(bǔ)血、抗氧化等[19]作用；佐以飛龍掌血和一匹綢，飛龍掌血散瘀止血，祛風(fēng)除濕，消腫解毒，有報(bào)道其抗炎鎮(zhèn)痛、活血、抗菌、和抗腫瘤等[20]作用，一匹綢蠲痹利水，散瘀止血，拔毒生肌，有報(bào)道其抗炎鎮(zhèn)痛等[21]作用.針對(duì)CPID的病理特點(diǎn)，復(fù)方小鉆方諸藥合功可活血化瘀、行氣止痛，同時(shí)又可清熱解毒以抗炎消腫，補(bǔ)血增強(qiáng)免疫力以達(dá)祛邪而不傷正的目的.

有研究表明，CPID主要病原菌為沙眼衣原體、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌等[22]，故本研究采用機(jī)械損傷子宮內(nèi)膜，同時(shí)注射大腸桿菌加金黃色葡萄球菌，使子宮內(nèi)膜感染病原菌，10 d的炎癥反應(yīng)，大量子宮內(nèi)膜細(xì)胞壞死甚至子宮穿孔，膠原蛋白分泌增加，形成了結(jié)締組織，模型組腹部可見廣泛粘連，大鼠體重減輕，子宮腫脹度及腫脹率顯著增加，血液白細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞百分比顯著增加，血清致炎細(xì)胞因子IL-1β和IL-6水平顯著升高，血清氧化自由基MDA水平顯著升高，抗氧化指標(biāo)SOD水平顯著降低，說明機(jī)械損傷加注射大腸桿菌加金黃色葡萄球菌復(fù)制的大鼠慢性CPID模型成功.

本研究結(jié)果表明，復(fù)方小鉆方3種顆粒劑均能使CPID模型大鼠體重增加，降低子宮腫脹度及腫脹率，降低血液白細(xì)胞總數(shù)和中性粒細(xì)胞百分比，降低血清致炎細(xì)胞因子IL-1β和IL-6水平，降低血清氧化自由基MDA水平，升高血清抗氧化指標(biāo)SOD水平.說明復(fù)方小鉆方3種顆粒劑對(duì)大鼠慢性CPID具有良好的治療作用，其機(jī)制可能與抑制促炎因子表達(dá)，增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力有關(guān).

3 結(jié)論

本研究按提取方式對(duì)復(fù)方小鉆方3種顆粒進(jìn)行拮抗大鼠慢性CPID，其等效劑量9 g原藥材/kg均有效，說明復(fù)方小鉆方對(duì)大鼠慢性CPID具有良好的治療作用，在本實(shí)驗(yàn)中，小劑量(臨床劑量)組顆粒Ⅰ對(duì)CPID大鼠血清MDA水平、子宮腫脹率影響作用不顯著(P>0.05)，顆粒Ⅲ低劑量組體質(zhì)量增長作用不顯著(P>0.05)此外，顆粒Ⅰ臨床服用量為13.14 g，顆粒Ⅱ臨床服用量為9.29 g，顆粒Ⅲ臨床服用量為15.51 g，顆粒Ⅱ服用劑量少，此外，顆粒Ⅱ提取工藝較顆粒Ⅲ簡單，結(jié)合制劑工藝、藥效學(xué)研究數(shù)據(jù)和病人的順應(yīng)性考慮，故認(rèn)為顆粒Ⅱ更適合大工業(yè)化生產(chǎn).

綜上認(rèn)為，復(fù)方小鉆方制成顆粒劑，適合用于臨床治療慢性盆腔炎，但制劑工藝及藥效機(jī)制尚有待進(jìn)一步研究.