陳玲芳 邵敬寶 印曉紅 沈煒 普俊勇 姚建標(biāo) 陳燁 張利竣 石楠 石森林

三七藥酒是云南希陶綠色藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)（國(guó)藥準(zhǔn)字Z53021182），由三七、紅花、大血藤、乳香、沒藥、醋延胡索、醋香附、四塊瓦和蘇木等藥物組成，具有舒筋活絡(luò)、散瘀鎮(zhèn)痛、祛風(fēng)除濕、強(qiáng)筋壯骨等功效，臨床用于治療跌打損傷，風(fēng)濕骨痛，四肢麻木等癥。本研究選擇佐劑性類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠模型綜合評(píng)價(jià)三七藥酒治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的藥效作用，為三七藥酒治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）的臨床研究提供藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 Wistar雄性大鼠60只，體質(zhì)量（180±20）g，浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心代購(gòu)，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SYXK（浙）2013-0184。飼養(yǎng)環(huán)境：12 h光照，12 h黑暗，溫度20～22℃，濕度45%～65%。

1.2 藥物與試劑 基酒（批號(hào)20170305）由浙江康恩貝制藥股份有限公司提供，三七藥酒（批號(hào)171018）由云南希陶綠色藥業(yè)股份有限公司提供，雷公藤多苷片（批號(hào)1607102B）購(gòu)自浙江得恩德制藥有限公司，完全弗氏佐劑（10 mg/ml BCG）購(gòu)自sigma公司。

1.3 儀器 足趾容積測(cè)量?jī)x（山東醫(yī)學(xué)科學(xué)院設(shè)備站），自動(dòng)染色機(jī)（Leica），RM2245切片機(jī)（Leica）。

1.4 造模與給藥 60只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，稱重，剔除體質(zhì)量＞220 g或＜160 g的大鼠，剩余的按照隨機(jī)數(shù)字法分為七組，即空白組、模型組、基酒組、雷公藤多苷組、三七藥酒低劑量組、三七藥酒中劑量組、三七藥酒高劑量組，每組各8只?？瞻捉M大鼠右后足底皮內(nèi)注射0.1 ml氯化鈉注射液，其余大鼠右后足底皮內(nèi)注射0.1 ml完全弗氏佐劑，注射后用手指按壓針孔20 s［1］。于造模當(dāng)天開始，分組灌胃給藥，記錄為D1，給藥期間正常飲食。空白組、模型組灌胃純化水，基酒組灌胃基酒，雷公藤多苷組灌胃雷公藤多苷混懸液（1.5 mg/kg），三七藥酒低劑量組灌胃基酒稀釋的三七藥酒（3 ml/kg），三七藥酒中劑量組灌胃基酒稀釋的三七藥酒（6 ml/kg），三七藥酒高劑量組灌胃三七藥酒原液（9 ml/kg）。灌胃劑量按大鼠體重0.4 ml/100 g，1次/d。

1.5 觀察指標(biāo) （1）大鼠體重：分別于造模前1天（D0）、造模后每2天的給藥前、末次給藥后（D21）以及禁食不禁水＞12 h后的D22進(jìn)行稱重。（2）大鼠足跖容積測(cè)定：采用大鼠足跖容積測(cè)量?jī)x，測(cè)量深度以踝關(guān)節(jié)毛際線處為標(biāo)準(zhǔn)，分別于造模D1的造模前、之后每?jī)商斓慕o藥前進(jìn)行，D21末次給藥前為最后一次測(cè)定。（3）大鼠痛閾測(cè)定：分別于造模D1、以后每2天的給藥前，D21末次給藥前為最后一次，取大鼠右后足趾中部，采用大鼠電子壓痛測(cè)量?jī)x進(jìn)行足趾壓痛值測(cè)定。（4）大鼠足踝周長(zhǎng)測(cè)定：于造模第13 d開始，之后每?jī)商旖o藥前，D21末次給藥前為最后一次，用軟尺測(cè)定大鼠右后足踝最腫部位的周長(zhǎng)。（5）大鼠踝關(guān)節(jié)HE染色：大鼠處死后，截取患側(cè)踝關(guān)節(jié)，除去足部皮膚，以及多余筋膜和肌肉，浸泡于10% EDTA液中脫鈣，行HE染色，電鏡下觀察踝關(guān)節(jié)的病理變化。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPASS 17.2統(tǒng)計(jì)軟件。各個(gè)檢測(cè)指標(biāo)的樣本均數(shù)以（）表示，采用多個(gè)樣本均數(shù)的方差分析，進(jìn)行q檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠體質(zhì)量比較 見表1。

表1 各組大鼠體質(zhì)量比較［g，（）］

表1 各組大鼠體質(zhì)量比較［g，（）］

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，＃P＜0.05；與基酒組比較，×P＜0.05；與雷公藤多苷組比較，●P＜0.05

組別 空白組 模型組 基酒組 雷公藤多苷組 三七藥酒低劑量組 三七藥酒中劑量組 三七藥酒高劑量組D0 177.06±6.56 174.01±8.47 176.55±6.41 171.50±6.51 178.36±6.07 171.93±5.61 171.43±7.00 D2 183.43±9.13 168.54±7.69* 172.15±6.85* 171.14±6.23* 177.21±7.27 ＃ 168.04±11.55* 166.74±6.59*D4 187.38±10.81 170.02±6.16* 168.55±7.09* 175.13±7.27* 178.00±13.45*× 166.61±10.45* 166.04±6.92* ●D6 194.44±10.13 169.54±7.48* 161.51±5.91* 172.20±5.17*× 175.29±10.58*× 162.03±16.33*● 160.83±8.88*●D8 204.14±11.92 170.01±6.49* 163.64±5.26* 173.31±4.79*× 172.05±15.09* 165.69±14.21* 163.63±6.81* ●D10 209.88±12.24 173.73±5.78* 163.19±9.17*＃ 177.68±5.20*× 177.18±13.65*× 169.70±12.97* 167.49±6.12*●D12 217.06±10.94 175.88±6.13* 167.33±7.56* 180.85±6.14*× 180.29±11.81*× 174.41±12.86* 170.63±7.12*●D14 226.96±11.65 178.13±7.85* 168.88±9.34* 181.63±5.41*× 184.95±12.09*× 177.85±12.08* 172.71±6.16*D16 236.41±11.47 181.88±9.04* 173.66±7.53* 186.71±6.18*× 189.96±11.86*× 183.36±12.79*× 178.86±6.04*D18 242.56±11.64 188.23±12.58* 177.18±10.46* 191.86±6.48*× 195.25±13.43*× 190.36±14.05*× 182.26±5.61*D20 250.73±11.73 196.40±12.31* 183.23±9.48*＃ 198.10±5.93*× 202.56±13.90*× 197.05±12.34*× 190.35±6.18*×D22 243.60±9.93 190.50±11.36* 182.13±9.51* 195.35±7.27*× 201.69±13.80*＃ × 194.16±12.75*× 186.54±7.71*

2.2 各組大鼠足跖容積比較 見表2。

表2 各組大鼠足跖容積比較［ml，（）］

表2 各組大鼠足跖容積比較［ml，（）］

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，＃P＜0.05；與基酒組比較，×P＜0.05；與雷公藤多苷組比較，●P＜0.05

組別 空白組 模型組 基酒組 雷公藤多苷組 三七藥酒低劑量組 三七藥酒中劑量組 三七藥酒高劑量組D1 1.19±0.17 1.16±0.13 1.21±0.17 1.19±0.08 1.13±0.06 1.15±0.12 1.15±0.11 D3 1.23±0.15 2.22±0.20* 2.41±0.17* 2.46±0.27* 2.25±0.16*● 2.07±0.15*＃ × ● 2.17±0.22*× ●D5 1.23±0.09 3.07±0.10* 2.89±0.36* 2.88±0.17* 2.93±0.28* 2.68±0.21* ＃ × 2.87±0.21*D7 1.27±0.11 3.81±0.26* 3.76±0.45* 3.94±0.27* 3.62±0.28* 3.14±0.47* ＃ × ● 3.44±0.45* ?！馜9 1.33±0.06 3.94±0.34* 3.96±0.26* 3.91±0.38* 3.27±0.55*＃×● 3.32±0.23*?！痢?3.44±0.42*＃×●D11 1.25±0.15 3.86±0.34* 3.85±0.44* 3.68±0.35* 3.20±0.39*?！痢?3.16±0.31*＃×● 3.16±0.41*?！痢馜13 1.31±0.10 4.19±0.43* 3.94±0.61* 3.74±0.33*＃ 3.57±0.30*＃ 3.19±0.45*?！痢?3.31±0.44*?！痢馜15 1.40±0.10 4.00±0.48* 3.73±0.42*＃ 3.98±0.32* 3.61±0.30*?！?3.02±0.27*＃×● 3.22±0.41*?！痢馜17 1.37±0.10 4.08±0.26* 3.55±0.51*＃ 3.94±0.23*× 3.44±0.40*＃● 3.09±0.21*＃ × ● 3.38±0.42*?！馜19 1.42±0.10 3.92±0.39* 3.67±0.39*＃ 3.80±0.38* 3.33±0.29*?！痢?2.87±0.28*＃×● 3.22±0.25*?！痢馜21 1.37±0.15 3.82±0.11* 3.87±0.43* 3.76±0.32* 3.24±0.21*＃×● 2.84±0.25*?！痢?3.12±0.28*＃×●

2.3 各組大鼠痛閾值變化情況比較 見表3。

表3 各組大鼠痛閾值變化情況比較［g，（）］

表3 各組大鼠痛閾值變化情況比較［g，（）］

注：表示與空白組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 *P＜0.05；表示與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義＃P＜0.05；表示與基酒組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 ×P＜0.05；與雷公藤多苷組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 ● P＜0.05

空白組 模型組 基酒組 雷公藤多苷組 三七藥酒低劑量組 三七藥酒中劑量組 三七藥酒高劑量組D1 256.76±46.95 221.87±32.35 239.11±27.37 229.30±40.18 258.68±50.27 259.93±52.79 245.96±30.51 D3 261.91±35.18 163.62±29.65* 171.74±41.83* 158.45±47.99* 173.30±33.06* 141.24±25.59* 143.68±31.29*D5 307.95±57.03 139.84±27.15* 150.84±28.45* 163.51±32.98* 173.68±34.87*※ 139.71±20.83* 157.80±30.60*D7 330.25±66.52 156.28±24.22* 135.51±23.36* 166.45±29.96* 173.43±24.12*× 171.47±35.80* 186.84±49.58*×D9 403.95±70.71 143.23±30.59* 161.75±27.76* 195.40±28.40*＃ 183.29±30.24*＃ 157.03±24.55*● 177.95±35.76*D11 361.61±71.17 127.48±29.53* 126.14±17.23* 154.98±32.17* 160.76±25.00* 163.13±42.28* 173.00±30.54* ＃ ×D13 374.98±76.78 133.55±33.45* 136.91±30.58* 154.95±32.47* 177.05±34.73* ＃ × 151.78±29.49* 162.75±29.85*D15 398.63±57.68 115.58±13.88* 121.51±26.76* 155.00±35.20*＃ 158.81±35.51*?！?160.71±26.44*?！?171.28±33.91*?！罝17 394.14±58.02 127.99±25.85* 119.53±19.66* 169.85±36.37*＃ × 160.48±35.49*× 164.45±29.81*＃ × 163.33±33.76*＃ ×D19 411.33±53.40 125.75±23.02* 126.90±25.09* 155.74±40.78* 157.58±30.45*＃ 170.88±22.26*＃ × 170.48±22.98*＃ ×D21 417.20±37.95 133.38±19.81* 122.85±21.49* 152.33±25.14*× 159.05±27.79*× 170.71±27.37*＃ × 168.48±19.81*＃ ×

2.4 各組大鼠裸關(guān)節(jié)周長(zhǎng)比較 見表4。

表4 各組大鼠裸關(guān)節(jié)周長(zhǎng)比較［cm，（）］

表4 各組大鼠裸關(guān)節(jié)周長(zhǎng)比較［cm，（）］

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，＃P＜0.05；與基酒組比較，×P＜0.05；與雷公藤多苷組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 ●P＜0.05

空白組 模型組 基酒組 雷公藤多苷組 三七藥酒低劑量組 三七藥酒中劑量組 三七藥酒高劑量組D13 2.22±0.05 4.28±0.11* 4.32±0.15* 4.22±0.14* 4.05±0.11*?！痢?3.92±0.10*?！痢?3.94±0.16*?！痢馜15 2.23±0.11 4.31±0.17* 4.24±0.07* 4.30±0.23* 4.06±0.16*＃×● 3.96±0.10*?！痢?4.12±0.22*?！馜17 2.25±0.09 4.31±0.23* 4.34±0.18* 4.22±0.27* .99±0.26*?！痢?4.00±0.09*＃×● 4.06±0.10*?！罝19 2.30±0.11 4.18±0.22* 4.09±0.21*＃ 4.00±0.18*＃ 3.92±0.21*?！?3.86±0.15*?！?3.95±0.12*＃×D21 2.25±0.07 3.99±0.09* 4.13±0.29* 4.02±0.27* 3.77±0.20*?！痢?3.72±0.19*＃×● 3.87±0.13*×

2.5 各組大鼠踝關(guān)節(jié)病理變化 空白組大鼠踝關(guān)節(jié)組織學(xué)結(jié)構(gòu)正常，胞漿紅染，細(xì)胞形態(tài)正常；模型組大鼠關(guān)節(jié)滑模增生，有大量炎性細(xì)胞侵潤(rùn)，胞漿嗜酸性增強(qiáng)；基酒組大鼠關(guān)節(jié)滑模增生，有大量炎性細(xì)胞侵潤(rùn)，胞漿嗜酸性增強(qiáng)，可見較多免疫沉淀物；雷公藤多苷組關(guān)節(jié)滑模增生較模型組減輕，可見炎性細(xì)胞侵潤(rùn)；三七藥酒低劑量組滑膜增生與雷公藤多苷組相當(dāng)，偶見炎癥細(xì)胞侵潤(rùn)；三七藥酒中劑量組滑膜增生與雷公藤多苷組相當(dāng)，偶見炎癥細(xì)胞侵潤(rùn)；三七藥酒高劑量組滑膜增生較三七藥酒中劑量組嚴(yán)重，炎癥細(xì)胞侵潤(rùn)較三七藥酒中劑量和低劑量組嚴(yán)重。病理改變見圖1。

圖1 各組大鼠踝關(guān)節(jié)HE染色（×100）

3 討論

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）是一種自身免疫性疾病，其發(fā)病原因及機(jī)制十分復(fù)雜。一般認(rèn)為，RA是遺傳易感者在某種特殊環(huán)境因素的激發(fā)下，啟動(dòng)由自身反應(yīng)性T 細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫反應(yīng)，進(jìn)而引起一系列炎癥、免疫反應(yīng)和關(guān)節(jié)滑膜的增生，最終導(dǎo)致滑膜炎、關(guān)節(jié)破壞和全身器官受損［2-4］。

AA模型是由Pearson在20世紀(jì)50年代創(chuàng)立的一種免疫性關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型。AA模型的發(fā)病特點(diǎn)、關(guān)節(jié)疼痛、腫脹和病理改變、骨質(zhì)破壞和滑膜增生等與臨床上患者RA病理學(xué)改變相似，經(jīng)過多次改良，已成為目前篩選研究治療RA藥物較為理想的動(dòng)物模型之一［5］。AA模型的發(fā)病原理主要是分子模擬理論。AA免疫是T細(xì)胞介導(dǎo)的慢性全身性炎癥反應(yīng)，其中輔助性T細(xì)胞（Th）中T細(xì)胞亞群之間的平衡紊亂是AA大鼠免疫功能異常的重要特征之一。

三七總皂苷具有活血化淤的作用。姜輝等［6］研究發(fā)現(xiàn)，三七總皂苷對(duì)AA大鼠具有一定的保護(hù)作用，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的產(chǎn)生有關(guān)。顧超蘭等［7］研究發(fā)現(xiàn)，紅花的有效成分紅花黃色素能顯著緩解佐劑型關(guān)節(jié)炎大鼠的關(guān)節(jié)炎癥，其機(jī)制與下調(diào)炎癥因子IL-1β及TNF-α的表達(dá)有關(guān)。付鈺等［8］研究發(fā)現(xiàn)，中藥大血藤可抑制AA大鼠滑膜細(xì)胞分泌MMP-2、MMP-9，減輕其參與或介導(dǎo)的對(duì)滑膜組織造成的損害，控制滑膜炎癥的發(fā)生。李小敏等［9］研究蘇木醇提取物對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）的治療作用，發(fā)現(xiàn)蘇木醇提取物可以減輕佐劑關(guān)節(jié)炎大鼠的足趾腫脹。本研究進(jìn)一步證實(shí)，三七藥酒具有良好的消腫、減痛和促進(jìn)踝關(guān)節(jié)黏膜修復(fù)的藥效作用，其作用機(jī)制可能是通過抑制炎癥細(xì)胞的分泌、減少炎性細(xì)胞浸潤(rùn)而發(fā)揮鎮(zhèn)痛、抗炎作用，通過抑制關(guān)節(jié)滑膜增生來保護(hù)關(guān)節(jié)滑膜組織，但三七藥酒高劑量組的病理結(jié)果尚不理想，故需進(jìn)一步研究探討。