張弘弛，付莉媛，周鳳，李慧，劉瑞*

（1.大同大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西 大同 037009；2.大同大學(xué)應(yīng)用生物技術(shù)研究所，山西 大同 037009）

黃芪主要分布于我國山西、內(nèi)蒙古和甘肅，其中被譽(yù)為“黃芪王”的恒山黃芪產(chǎn)于山西渾源恒山地區(qū)。恒山黃芪莖狀均勻、平滑、順直，橫截面顏色偏亮黃，為中國北芪之正宗。 黃芪除具有廣泛食療價(jià)值[1]，還具有廣泛的藥理作用[2]，配合其它中藥的服用更能發(fā)揮其功效，具有良好的降壓、利尿、保肝等作用，還能增強(qiáng)人體免疫力[3]。 黃芪中的藥效成分主要為皂苷，黃芪中皂苷含量豐富，且類型多樣，但是傳統(tǒng)的溶劑提取法，如水煎煮中藥材法、乙醇溶劑提取法、超聲波輔助提取法等[4]提取效果低于預(yù)期，而新興的酶法提取活性物質(zhì)，已有成功的研究成果，如果膠酶提取絞股藍(lán)皂苷新工藝與傳統(tǒng)堿水提取工藝相比，收率大幅提高[5]，酶是具有專一性、催化效率高等特點(diǎn)的生物催化劑[6]，可以破壞植物細(xì)胞壁中的纖維素成分，纖維素酶將纖維素水解為葡萄糖[7]，果膠酶可以破壞細(xì)胞壁中的果膠質(zhì)，達(dá)到破碎植物細(xì)胞壁的目的，讓胞內(nèi)物質(zhì)釋放[8-9]。

本研究擬嘗試用一種新的方式——酶結(jié)合超聲波輔助法提取黃芪中的總皂苷， 結(jié)合響應(yīng)面法考察酶添加量、乙醇濃度、超聲時(shí)間、超聲溫度以及pH 值對黃芪中總皂苷提取效果的影響。在前期研究基礎(chǔ)上加入新的工藝以期為黃芪總皂苷提取提供新的工藝方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

恒山黃芪根（粉碎后試驗(yàn)）：山西渾源萬生黃芪開發(fā)有限公司；黃芪甲苷對照品（編號Z0371312）：北京譜析科技有限公司；纖維素酶（3 U/mg）：和氏璧生物科技有限公司；果膠酶（30 U/mg）：上海藍(lán)季生物有限公司；淀粉酶（1 U/mg）：山東隆科特有限公司；濃硫酸：招遠(yuǎn)市大明儀表有限公司；香草醛：北京創(chuàng)煌偉業(yè)食品配料有限公司；無水乙醇：湖北新河原藥有限公司；甲醇：中煤龍化哈爾濱煤化工有限公司；以上所有試劑均為分析純。

XFB-200 型小型中藥粉碎機(jī)： 吉首中誠制藥廠；HH-3S 三孔三控溫水槽：常州市英格爾儀器制造有限公司；T650CT 雙頭恒溫超聲波提取機(jī)： 上海左樂儀器有限公司；SHB-IIIA 型循環(huán)水式多用真空泵： 鄭州長城科工貿(mào)有限公司；RE-2000E 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：西安禾普生物科技有限公司；UV-3200S 紫外分光光度計(jì)：上海美譜達(dá)儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 黃芪總皂苷標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱量黃芪甲苷對照品12.5 mg，用適量甲醇充分溶解，置入25 mL 容量瓶定容備用，即為黃芪甲苷的標(biāo)準(zhǔn)溶液（濃度為0.5 mg/mL）。 精確量取0、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50 mL 上述黃芪甲苷標(biāo)準(zhǔn)溶液， 加入適量甲醇使得溶液總量為0.5 mL， 取質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8%的香草醛無水乙醇溶液2.5 mL 分別加入至試管中，振蕩均勻，置于62 ℃恒溫水浴中，溫?zé)岷笥诿恐辉嚬苤屑尤?.5 mL 體積分?jǐn)?shù)為72%的硫酸（不斷振蕩防止局部溫度過高）。保溫20 min，冷水浴中保持10 min。將0 號試管中的待測液作為空白對照，30 min 內(nèi)，紫外分光光度計(jì)波長設(shè)定540 nm[10]，測吸光度值并記錄。

1.2.2 黃芪中總皂苷的提取

取各試驗(yàn)中提取液， 置于沸水浴進(jìn)行酶的滅活，待冷卻至室溫（25 ℃）后過濾，加甲醇稀釋，依據(jù)1.2.1中硫酸-香草醛-無水乙醇法檢測，將所得吸光度值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程， 求得溶液中的總皂苷濃度，并且按照下述公式計(jì)算出黃芪總皂苷提取率。

式中：W 為總皂苷的提取率，%；c 為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程所計(jì)算出的溶液濃度，mg/mL；D 為溶液稀釋倍數(shù)；V 為待測溶液的體積，mL；m 為材料質(zhì)量，mg。

1.2.3 酶制劑的選擇

精確稱取3 份1.0 g 黃芪分別放置100 mL 燒杯中，分別加入占原材料質(zhì)量5%的纖維素酶、果膠酶、淀粉酶，把未加入任何酶制劑的樣品作為對照。 將每份樣品中加入50 mL 體積分?jǐn)?shù)為70%乙醇溶劑，將上述各樣品置于溫度為45 ℃、超聲功率200 W、超聲時(shí)間為30 min、pH 6 的環(huán)境中處理，完成酶解后，沸水浴中進(jìn)行5 min 酶的滅活，待冷卻至室溫（25 ℃），離心得到上清液。 采用硫酸-香草醛-無水乙醇法進(jìn)行檢測，測定其吸光度值并記錄，計(jì)算總皂苷提取率。

1.2.4 單因素試驗(yàn)

采用1.2.3 的方法提取黃芪總皂苷，基礎(chǔ)提取試驗(yàn)條件為：pH 6、設(shè)定超聲功率1 000 W、超聲時(shí)間30 min、固定超聲溫度為45 ℃、乙醇濃度為70%、乙醇溶劑用量為50 mL 以及酶添加量為5%。 各單因素變量設(shè)定為：酶添加量（1%、2%、4%、6%、8%、10%、12%）、乙醇濃度（40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%）、超聲時(shí)間（10、20、30、50、70 min）、超聲功率（800、1 000、1 200、1 500、2 000 W）、超聲溫度（35、40、45、50、55、60 ℃）、pH 值（3.5、4、4.5、5、5.5、6）。采用硫酸-香草醛-無水乙醇法檢測吸光度值，計(jì)算總皂苷提取率。

1.2.5 響應(yīng)面試驗(yàn)

以單因素試驗(yàn)為基礎(chǔ)，基于Box-Behnken 的中心組合設(shè)計(jì)原理[11-13]，響應(yīng)面分析優(yōu)選酶-超聲波輔助提取黃芪總皂苷的最佳提取條件。 以黃芪總皂苷提取率為響應(yīng)值，選擇酶添加量、乙醇濃度、超聲時(shí)間、超聲溫度及pH 值為考察因素自變量， 設(shè)計(jì)五因素三水平響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝，自變量的低、中、高水平分別用-1、0 和1 表示，因素與水平見表1。

表1 響應(yīng)面因素及水平Table 1 Factors and levels of response surface methodology

1.3 數(shù)據(jù)的處理

運(yùn)用軟件Design-Expert 8.0.6 進(jìn)行方差分析，用Origin 8.0 軟件進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃芪總皂苷標(biāo)準(zhǔn)曲線

用最小二乘法對所得結(jié)果進(jìn)行線性回歸，可得黃芪甲苷溶液濃度c（mg/mL）與吸光度值A(chǔ) 的回歸方程式為：A=1.907c-0.824（R2=0.991 5）。

2.2 酶制劑篩選的結(jié)果

酶制劑篩選結(jié)果見圖1。

圖1 酶制劑篩選Fig.1 Enzyme preparation screening

由圖1 可知，纖維素酶提取總皂苷提取率最高，果膠酶對黃芪總皂苷的提取略低一些，淀粉酶最低。 植物細(xì)胞壁的主要成分是纖維素、 半纖維素和果膠，試驗(yàn)結(jié)果表明纖維素的分解率是影響黃芪細(xì)胞破碎的主要因素，因而本研究確定使用纖維素酶作為細(xì)胞破碎的生物酶。

2.3 單因素的試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 纖維素酶添加量對黃芪中總皂苷提取率的影響

纖維素酶添加量對黃芪總皂苷提取率的影響見圖2。

由圖2 可知， 總皂苷的提取率隨著酶添加量增加呈現(xiàn)先升高后平穩(wěn)的趨勢。 在酶添加量為原料總量的2%時(shí)，達(dá)到最大值。 因此為進(jìn)一步了解酶添加量對總皂苷提取效果的影響，選擇酶添加量為1%、2%、3%進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

圖2 纖維素酶添加量對總皂苷提取率的影響Fig.2 Effect of the amount of compound enzyme on the extraction rate of total saponin

2.3.2 乙醇濃度對黃芪總皂苷提取率的影響

乙醇濃度對黃芪總皂苷提取率的影響見圖3。

圖3 乙醇濃度對總皂苷提取率的影響Fig.3 Effect of ethanol concentration on the extraction rate of total saponins

由圖3 可知， 隨乙醇濃度增加總皂苷的提取率逐漸增加。 乙醇濃度越高對于黃芪總皂苷的提取效果越好，但后期增長趨勢不明顯。 為進(jìn)一步研究乙醇濃度對黃芪總皂苷提取率的影響， 選擇乙醇濃度為90%、95%、100%進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

2.3.3 超聲時(shí)間對黃芪總皂苷提取率的影響

超聲時(shí)間對黃芪總皂苷提取率的影響見圖4。

圖4 超聲時(shí)間對總皂苷提取率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic time on extraction rate of the total saponins

由圖4 可知，超聲時(shí)間在20 min 內(nèi)，總皂苷的提取率呈現(xiàn)快速上升的趨勢，但是隨著超聲時(shí)間延長提取率反而趨于平衡甚至略微降低，可能的原因是超聲波時(shí)間累積量對細(xì)胞的破碎趨于平衡，因而總皂苷的提取率在長時(shí)間超聲后，變化很小。 因此選取10、20、30 min 進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

2.3.4 超聲功率對黃芪中總皂苷提取率的影響

超聲功率對黃芪總皂苷提取率的影響見圖5。

圖5 超聲功率對總皂苷提取率的影響Fig.5 Effect of ultrasonic power on extraction rate of the total saponins

由圖5 可知，超聲功率從800 W 上升至2 000 W，總皂苷的提取率波動在0.25%左右， 在合適的酶分解條件下， 超聲功率累積量對細(xì)胞的破碎幾乎沒有影響，因而總皂苷的提取率變化很小。 因此在后續(xù)響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)中，超聲功率不再作為考察因素。

2.3.5 超聲溫度對黃芪總皂苷提取率的影響超聲溫度對黃芪總皂苷提取率的影響見圖6。

圖6 超聲溫度對總皂苷提取率的影響Fig.6 Effect of ultrasonic temperature on extraction rate of the total saponins

由圖6 可知，總皂苷的提取率在溫度為50 ℃時(shí)出現(xiàn)一個(gè)峰值，在峰的兩側(cè)總皂苷的提取率變化急劇下降。 從酶本身的性質(zhì)出發(fā)，可以發(fā)現(xiàn)在峰值兩側(cè)，越偏離峰值酶的活性越低，在峰的右側(cè)，總皂苷提取率下降較快，可能由于溫度的提升致使酶活性的降低，而導(dǎo)致分子中的皂苷不能得以釋放，因而總皂苷提取率降低。 為進(jìn)一步研究超聲溫度對總皂苷提取率的影響，分別在超聲溫度為40、50、60 ℃進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

2.3.6 pH 值對黃芪總皂苷提取率的影響

提取液pH 值對黃芪總皂苷提取率的影響見圖7。

圖7 pH 值對總皂苷提取率的影響Fig.7 Effect of pH on extraction rate of the total saponins

由圖7 可知，隨著pH 值不斷增加，黃芪總皂苷的提取率呈現(xiàn)出先增加到峰值接著急劇下降之后又緩慢上升，存在兩個(gè)極值點(diǎn)（可能是提取體系中不同因素影響了纖維素酶的酶促反應(yīng)的最適合pH 值而導(dǎo)致），但是在pH 值為4 時(shí)到達(dá)最值。 提取率出現(xiàn)下降趨勢的原因可能是超過酶的最適pH 值環(huán)境， 導(dǎo)致酶活力的下降或失活。 因此為進(jìn)一步探索pH 值對總皂苷提取率的影響， 故選擇pH 值分別為3.5、4.0、4.5 進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)

2.4.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果分析

綜合利用單因素試驗(yàn)所得結(jié)果，根據(jù)Box-Behnken的中心組和設(shè)計(jì)原理[11-13]。 以黃芪總皂苷提取率作為考察的指標(biāo)，綜合選取ApH 值、B 超聲時(shí)間、C 超聲溫度、D 乙醇濃度及E 酶添加量這5 個(gè)因素設(shè)計(jì)五因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見表2，回歸系數(shù)顯著性檢驗(yàn)見表3。

將表2 中所得數(shù)據(jù)處理后， 可得5 個(gè)自變量與黃芪總皂苷提取率的回歸方程為： 總皂苷提取率=3.26-0.36A+0.29B+0.010C-0.030D+0.15E+0.030AB-0.045AC+0.12AD+0.16AE-5×10-3BC-0.27BD+0.065BE-0.15CD-0.12CE-0.050DE-0.34A2-0.16B2-0.32C2-0.13D2-0.41E2-0.16A2B+0.24A2C-0.045A2D-0.53A2E+0.44AB2+0.64AC2+0.38AD2+5×103B2C-0.32B2D+0.025B2E+0.090BC2-0.15 BD2-0.100C2D+0.060C2E-0.020CD2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)方案與結(jié)果Table 2 Design and experimental results of response surface experiment

據(jù)表3 可知回歸模型的方差分析結(jié)果，其中，模型P=0.000 5＜0.01，方程模型極顯著，其失擬項(xiàng)P=0.355 7＞0.05，其失擬不顯著。 上述回歸模型總決定系數(shù)R2為0.967 7， 調(diào)整決定系數(shù)R2Adj是0.854 5， 變異系數(shù)CV為5.3%，由此可說明，不論是在擬合性方面還是誤差范圍方面，該模型均體現(xiàn)出較好的狀態(tài)，故上述回歸方程模型可以作為參考，能夠用于黃芪總皂苷纖維素酶解-超聲波輔助提取條件的分析以及預(yù)測。 模型的一次項(xiàng)A（pH）、B（超聲時(shí)間）極顯著（P＜0.01）；二次項(xiàng)A2、C2、E2達(dá)高度顯著水平（P＜0.000 1），B2、D2處于顯著水平（P＜0.05）。 在5 個(gè)影響因素之中，pH 值對提取黃芪總皂苷效果的影響是最強(qiáng)烈的，其次是B-超聲時(shí)間、E-纖維素酶添加量、D-乙醇濃度和C-超聲溫度。經(jīng)過Design-Expert 8.0.6 優(yōu)化， 通過對回歸模型求解方程， 得出纖維素酶-超聲波輔助法提取恒山黃芪總皂苷最優(yōu)工藝條件是：pH 值為4.5， 乙醇濃度90%，超聲時(shí)間30 min，超聲溫度為50 ℃，2%的纖維素酶添加量。 在這個(gè)條件下，黃芪總皂苷的提取率為4.51%。

表3 回歸系數(shù)顯著性檢驗(yàn)Table 3 Significant of regression coefficient

2.4.2 交互項(xiàng)擬合響應(yīng)值分析

Design-Expert 所得出各因素的交互影響圖分析，各水平軸表示不同因素的變量，Z 軸表示響應(yīng)值，建立3D 響應(yīng)面圖見圖8，在響應(yīng)面圖中，坡面的平緩程度表明影響因素的效果。

圖8 超聲溫度和纖維素酶制劑添加量交互作用對黃芪總皂苷提取率影響的等高線圖和響應(yīng)面圖Fig.8 Response surface and contour map of ultrasonic temperature and cellulase dosage on the extraction rate of total saponins of Astragalus membranaceus

如圖8 所示， 超聲溫度和纖維素酶添加量的等高線圖更接近于橢圓，說明二者之間的交互作用更加顯著，這一結(jié)果與文獻(xiàn)[14]較為類似，而其它因素作用于提取率的效果則并不十分顯著或沒有顯著性。

2.5 最優(yōu)工藝條件的確定及驗(yàn)證

纖維素酶-超聲波輔助法提取恒山黃芪總皂苷最優(yōu)工藝條件是：pH 值為4.5，乙醇濃度90%，超聲時(shí)間30 min，超聲溫度為50 ℃，2%的纖維素酶添加量。為驗(yàn)證Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)的結(jié)果及其可靠性，在如上所述的最優(yōu)工藝條件下，進(jìn)行3 次平行試驗(yàn)，實(shí)測的提取率為（4.51±0.03）%，與預(yù)測值基本一致，因此，通過上述試驗(yàn)方法所得的最優(yōu)提取黃芪中總皂苷的條件可靠，具有一定的試驗(yàn)參考價(jià)值及意義。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)研究將纖維素酶法和超聲波法結(jié)合，數(shù)據(jù)分析采用中心組合法，對黃芪中總皂苷的提取工藝條件進(jìn)行了一定的優(yōu)化。 考察了一系列因素對恒山黃芪總皂苷提取的影響，獲得最佳工藝條件為pH 值為4.5，乙醇濃度90%， 超聲時(shí)間30 min， 超聲溫度為50 ℃，2%的纖維素酶添加量。 在上述條件下，黃芪中總皂苷的提取率最大為4.51%。