劉小芳，宮玉雪，田良良，于源，苗鈞魁，冷凱良*

（1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部極地漁業(yè)開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266071；2.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所，上海 200090）

衰老是一種復(fù)雜的自然現(xiàn)象，通常表現(xiàn)為機(jī)體的功能衰退、對(duì)環(huán)境的抵抗力減弱、代謝緩慢、應(yīng)激反應(yīng)遲鈍等[1-2]。 目前針對(duì)衰老機(jī)理已有較多報(bào)道，包括免疫學(xué)說(shuō)、自由基學(xué)說(shuō)、蛋白質(zhì)合成差錯(cuò)累積學(xué)說(shuō)、線粒體損傷學(xué)說(shuō)及端粒假說(shuō)等[3]。 自由基增多和蛋白質(zhì)羰基化增加是目前公認(rèn)的導(dǎo)致機(jī)體衰老發(fā)生發(fā)展的主要原因。 衰老不可逆轉(zhuǎn)，但可通過(guò)膳食干預(yù)抗氧化物質(zhì)，提高機(jī)體抗氧化能力，清除體內(nèi)過(guò)量自由基，減少其對(duì)細(xì)胞和組織的破壞，延緩衰老進(jìn)程[4]。

南極磷蝦（Euphausia superba）是一種生活在南極海域的小型甲殼類(lèi)浮游動(dòng)物，資源蘊(yùn)藏量巨大，生物量達(dá)到6.5 億噸～10 億噸， 具有打造我國(guó)第二個(gè)遠(yuǎn)洋漁業(yè)的巨大潛力[5]。 南極磷蝦油是目前南極磷蝦陸基加工最重要的高值產(chǎn)品形式，其是從南極磷蝦中提取而來(lái)的油脂， 富含磷脂、 二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）和二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）等多不飽和脂肪酸以及蝦青素等天然抗氧化物質(zhì)[6]。 目前關(guān)于南極磷蝦油在預(yù)防和治療心腦血管疾病、改善腦細(xì)胞功能、改善骨質(zhì)疏松、抑制炎癥等方面的功能已有較多報(bào)道[6-7]，但針對(duì)其體內(nèi)抗氧化效果，特別是有效劑量方面尚缺少充足數(shù)據(jù)支持。 綜上，本研究通過(guò)構(gòu)建D-半乳糖致衰老小鼠模型，觀察不同劑量南極磷蝦油干預(yù)對(duì)衰老小鼠血液中自由基氧化損傷和蛋白質(zhì)羰基化相關(guān)生化指標(biāo)的影響，探討南極磷蝦油的抗氧化作用，以期為南極磷蝦油相關(guān)功能食品開(kāi)發(fā)提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、材料與試劑

SPF 級(jí)雄性ICR 小鼠，體重25 g～30 g，8～10 周齡，購(gòu)自斯貝福（北京） 生物技術(shù)有限公司， 許可證號(hào)：SCXK（京）2019-0010。

南極磷蝦油： 遼漁南極磷蝦科技發(fā)展有限公司；D-半乳糖（分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；生理鹽水：四川科倫藥業(yè)股份有限公司；大豆油：嘉里糧油（天津）有限公司；丙二醛（malondialdehyde，MDA）測(cè)定試劑盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）測(cè)定試劑盒、還原型谷胱甘肽（reduced glutathione，GSH）測(cè)定試劑盒、蛋白質(zhì)羰基含量測(cè)定試劑盒：南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

BAS224S-CW 型電子天平：賽多利斯（北京）科學(xué)儀器有限公司；Neofuge 15R 型高速冷凍離心機(jī)： 上海力申科學(xué)儀器有限公司；HH-4 型數(shù)顯恒溫水浴鍋：常州智博瑞儀器制造有限公司；UV1102 Ⅱ型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)： 上海天美科學(xué)儀器有限公司；CMax Plus型酶標(biāo)儀：美谷分子儀器（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)分組、造模與灌胃

雄性ICR 小鼠50 只，飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)化動(dòng)物房，環(huán)境溫度（25±2）℃，相對(duì)濕度50%～60%，晝夜交替。 適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d 后，除正常組（10 只）外，其余小鼠（40 只）均采用頸背部皮下注射D-半乳糖（500 mg/kg bw）造模，注射量為0.1 mL/10 g，每日1 次，正常組注射等體積生理鹽水，連續(xù)造模6 周。 造模6 周后，小鼠經(jīng)眼眶靜脈取血，分離血清測(cè)定MDA 含量。 按照MDA 水平將模型小鼠分為模型組、低劑量南極磷蝦油組（低劑量組，50 mg/kg bw）、中劑量南極磷蝦油組（中劑量組，150 mg/kg bw、高劑量南極磷蝦油組（高劑量組，300 mg/kg bw），每組10 只，保證各南極磷蝦油劑量組小鼠血清MDA 起始水平與模型組基本一致。 南極磷蝦油用大豆油稀釋至5、15、30 mg/mL， 按相應(yīng)劑量灌胃小鼠，灌胃量為0.1 mL/10 g，正常組和模型組小鼠灌胃等體積大豆油，連續(xù)灌胃30 d。 給予受試物期間，模型組和各南極磷蝦油劑量組小鼠繼續(xù)頸背部皮下注射D-半乳糖，每隔15 d 記錄體重。 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，小鼠經(jīng)12 h 禁食不禁水， 稱(chēng)重后采尾尖血20 μL 制備4%溶血液，測(cè)定GSH 含量。而后小鼠經(jīng)眼球取血后處死，血液于室溫（25 ℃）靜置30 min 后，4 ℃、4 000 r/min 離心15 min，分離血清，測(cè)定MDA、SOD、蛋白質(zhì)羰基含量等指標(biāo)。

1.3.2 評(píng)價(jià)指標(biāo)測(cè)定

MDA、GSH、蛋白質(zhì)羰基含量和SOD 活力的測(cè)定按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差形式表示。 采用SPSS 18.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，采用單因素方差分析進(jìn)行組間比較，以P<0.05 為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 南極磷蝦油對(duì)小鼠體重的影響

不同實(shí)驗(yàn)組小鼠體重變化數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。

表1 南極磷蝦油對(duì)模型小鼠體重的影響（n=10）Table 1 Effects of Antarctic krill oil on the body weights of model mice（n=10）

由表1 可知，各組小鼠初始體重?zé)o顯著差異（P＞0.05），經(jīng)灌胃不同劑量南極磷蝦油后，小鼠體重增長(zhǎng)量均較小， 推測(cè)與小鼠灌胃時(shí)已達(dá)到14～16 周齡，發(fā)育已成熟且生長(zhǎng)趨于穩(wěn)定有關(guān)。 各劑量組小鼠體重增長(zhǎng)量與模型組比均無(wú)顯著差異（P＞0.05），提示南極磷蝦油對(duì)消化道無(wú)刺激作用，不影響小鼠正常生長(zhǎng)。

2.2 南極磷蝦油對(duì)小鼠血清MDA 含量的影響

不同實(shí)驗(yàn)組小鼠血清MDA 含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 南極磷蝦油對(duì)模型小鼠血清MDA 含量的影響Fig.1 Effects of Antarctic krill oil on MDA contents in the serum of model mice

MDA 是脂肪氧化的終產(chǎn)物，其含量可直觀反映機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化水平。 由圖1 可知，與正常組相比，模型組小鼠血清MDA 含量顯著升高（P＜0.05）。灌胃給予不同劑量南極磷蝦油30 d 后， 小鼠血清MDA 含量出現(xiàn)不同程度的降低。 與模型組相比，低劑量、中劑量、高劑量南極磷蝦油組小鼠血清MDA 含量分別下降了22.98%（P ＞0.05）、43.20%（P ＜0.05）、50.10%（P ＜0.01），表明南極磷蝦油可以通過(guò)降低小鼠脂質(zhì)過(guò)氧化程度來(lái)保護(hù)機(jī)體免受氧化損傷。

2.3 南極磷蝦油對(duì)小鼠血清SOD 活力的影響

不同實(shí)驗(yàn)組小鼠血清SOD 活力測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 南極磷蝦油對(duì)模型小鼠血清SOD 活力的影響Fig.2 Effects of Antarctic krill oil on SOD activities in the serum of model mice

SOD 可清除體內(nèi)氧自由基，維持機(jī)體內(nèi)活性氧含量的動(dòng)態(tài)平衡。 機(jī)體內(nèi)SOD 活力降低，細(xì)胞將會(huì)發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，產(chǎn)生MDA，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[8]。 由圖2 可知，與正常組相比，模型組小鼠血清SOD 活力極顯著下降（P＜0.01）。 與模型組相比，低劑量、中劑量、高劑量南極磷蝦油組小鼠血清SOD 活力出現(xiàn)不同程度的提高， 分別增加了11.63%（P ＞0.05）、28.61%（P ＜0.05）、36.00%（P ＜0.01），表明南極磷蝦油可以通過(guò)提升小鼠機(jī)體中SOD 活力來(lái)清除體內(nèi)過(guò)多的活性氧自由基，起到保護(hù)機(jī)體免受氧化損傷的作用。

2.4 南極磷蝦油對(duì)小鼠全血GSH 含量的影響

不同實(shí)驗(yàn)組小鼠全血GSH 含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖3。

GSH 是體內(nèi)重要的非酶性抗氧化劑，其含量高低是衡量機(jī)體抗氧化能力大小的重要標(biāo)志[9]。 由圖3 可知，與正常組相比，模型組小鼠全血GSH 含量極顯著減少（P＜0.01）。與模型組相比，低劑量、中劑量、高劑量南極磷蝦油組小鼠全血GSH 含量出現(xiàn)不同程度的提高， 分別增加了36.13%（P＞0.05）、50.53%（P＜0.05）、60.80%（P＜0.01）， 表明南極磷蝦油可以通過(guò)提升小鼠機(jī)體中GSH 含量，清除機(jī)體中的過(guò)氧化物，減輕機(jī)體氧化損傷的程度。

圖3 南極磷蝦油對(duì)模型小鼠全血GSH 含量的影響Fig.3 Effects of Antarctic krill oil on GSH contents in the whole blood of model mice

2.5 南極磷蝦油對(duì)小鼠血清蛋白質(zhì)羰基含量的影響

不同實(shí)驗(yàn)組小鼠血清蛋白質(zhì)羰基含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 南極磷蝦油對(duì)模型小鼠血清蛋白質(zhì)羰基含量的影響Fig.4 Effects of Antarctic krill oil on protein carbonyl contents in the serum of model mice

蛋白質(zhì)羰基化是蛋白質(zhì)分子受到自由基攻擊后發(fā)生的非酶促不可逆變化， 羰基化蛋白極易相互交聯(lián)、聚集為大分子從而降低或失去原有功能。 蛋白質(zhì)羰基含量是反映機(jī)體氧化損傷程度的重要指標(biāo)[10]。 由圖4 可知，與正常組相比，模型組小鼠血清蛋白質(zhì)羰基含量顯著升高（P＜0.05）。 與模型組相比，低劑量、中劑量、 高劑量南極磷蝦油組小鼠血清蛋白質(zhì)羰基含量出現(xiàn)不同程度的降低，分別下降了17.99%（P＞0.05）、28.93%（P＜0.05）、31.55%（P＜0.01），表明南極磷蝦油可有效降低機(jī)體自由基含量， 減少蛋白質(zhì)羰基化的發(fā)生，減輕蛋白質(zhì)功能下降。

3 討論與結(jié)論

目前用于抗氧化功能研究的衰老動(dòng)物模型主要是自然衰老動(dòng)物和D-半乳糖致衰老動(dòng)物。已有研究證實(shí)，D-半乳糖致衰老動(dòng)物與自然衰老動(dòng)物具有較高的一致性，而前者模型具有組間差異小、試驗(yàn)周期短的優(yōu)點(diǎn)[11]。本研究采用頸背部皮下注射D-半乳糖建立小鼠過(guò)氧化損傷模型，造模6 周后，小鼠血清MDA 含量從（7.55±0.85）nmol/mL 增加到（10.05±0.92）nmol/mL。實(shí)驗(yàn)?zāi)┢冢?模型組小鼠較正常組血清MDA 和蛋白質(zhì)羰基含量顯著升高（P＜0.05）、血清SOD 活力和全血GSH 含量極顯著降低（P＜0.01），提示D-半乳糖供給過(guò)量，導(dǎo)致小鼠體內(nèi)超常產(chǎn)生活性氧，使體內(nèi)活性氧產(chǎn)生與消除的平衡狀態(tài)遭到破壞，引起小鼠氧化損傷，加速衰老。 不同劑量南極磷蝦油干預(yù)后，小鼠血清SOD 活力和全血GSH 含量得到提高、 血清MDA和蛋白質(zhì)羰基含量出現(xiàn)下降，其中，中劑量（150 mg/kg bw）和高劑量（300 mg/kg bw）干預(yù)效果顯著，證明南極磷蝦油能夠有效改善D-半乳糖致衰老動(dòng)物的氧化損傷。

南極磷蝦油中磷脂含量高達(dá)40%以上，EPA 和DHA 含量可達(dá)到18%以上，蝦青素含量為60 mg/kg 以上[6，12]。 EPA、DHA 等n-3 系列多不飽和脂肪酸具有良好的抗氧化作用，值得關(guān)注的是，區(qū)別于傳統(tǒng)魚(yú)油制品，EPA、DHA 在南極磷蝦油中更多地以磷脂型式存在[13-14]，生物利用度更高[15-16]，在體內(nèi)可發(fā)揮更優(yōu)的生理功能。 已有研究證明南極磷蝦EPA/DHA 磷脂能夠有效改善D-半乳糖致衰老小鼠的氧化損傷并修復(fù)皮膚衰老癥狀[17]。 蝦青素是目前已知的抗氧化能力最強(qiáng)的類(lèi)胡蘿卜素[18]，其抗氧化能力高于β-胡蘿卜素、葉黃素、輔酶Q10 和維生素E 等物質(zhì)，可通過(guò)淬滅單線態(tài)氧、消除自由基等途徑發(fā)揮抗氧化作用[19-20]。 已有研究證明南極磷蝦來(lái)源蝦青素提取物能夠有效改善D-半乳糖致衰老小鼠的氧化損傷，且效果優(yōu)于合成蝦青素[21]。

綜上，南極磷蝦油由于富含多種天然抗氧化營(yíng)養(yǎng)成分，能夠通過(guò)提高機(jī)體自由基清除能力、抑制脂質(zhì)過(guò)氧化和蛋白質(zhì)羰基化， 改善衰老小鼠的抗氧化能力，進(jìn)而起到延緩衰老的作用。 本研究可為南極磷蝦油在相關(guān)功能食品領(lǐng)域的應(yīng)用提供理論支持。