步雨珊　李劍勛　易華西　劉同杰　公丕民　王淑梅　劉銀雪

摘? 要： 植物乳桿菌素plantaricin Q7是由植物乳桿菌Lactobacillus plantarum Q7產(chǎn)生的，其具有廣譜抑菌活性的細(xì)菌素，有安全、高效、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn).將效價(jià)為533 AU?mL^-1的植物乳桿菌素Q7添加到牛乳中，探究其在牛乳貯藏過(guò)程中的保鮮效果.結(jié)果表明：植物乳桿菌素Q7維持了牛乳良好感官，牛乳貯藏第13天時(shí)仍沒(méi)有異味出現(xiàn)，保持乳白色、略帶黃色的狀態(tài)，無(wú)分層和沉淀.熒光假單胞菌是牛乳中的優(yōu)勢(shì)嗜冷腐敗菌.未添加植物乳桿菌素Q7的牛乳中，熒光假單胞菌落數(shù)在第7天超出國(guó)標(biāo)規(guī)定;添加植物乳桿菌素Q7將延長(zhǎng)熒光假單胞菌落數(shù)超出國(guó)標(biāo)規(guī)定的時(shí)間4 d.植物乳桿菌素Q7有效減緩了牛乳酸度的增加速度，降低了牛乳pH值的下降速度.本研究為植物乳桿菌素Q7的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用提供了依據(jù).

關(guān)鍵詞： 植物乳桿菌素; 牛乳; 貯藏; 保鮮

中圖分類(lèi)號(hào)： TS 252.4??? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A??? 文章編號(hào)： 1000-5137（2021）02-0146-08

Application of plantaricin Q7 in the storage and preservation of milk

BU Yushan¹， LI Jianxun¹， LIU Yinxue¹， LIU Tongjie¹， GONG Pimin¹，WANG Shumei^2*， YI Huaxi^1*

（1.College of Food Science and Engineering， Ocean University of China， Qingdao 266000， Shandong， China;2.College of Food Engineering， Harbin University， Harbin 150086， Heilongjiang， China）

Abstract： Plantaricin Q7 is a bacteriocin produced byLactobacillus plantarumQ7 with broad-spectrum antibacterial activity.It has the advantages of safety，high efficiency and good stability.In this study，plantaricin Q7 with a titer of 533 AU?mL^-1was added to milk to explore its preservation effects in the process of milk storage.The result showed that plantaricin Q7 maintained the good sense of milk.There was no peculiar smell on the 13^thday of storage，and the milk remained white and slightly yellow，without stratification and precipitation.Pseudomonas fluorescenswas the dominant psychrophilic spoilage bacteria in milk.Without adding plantaricin Q7，the number ofP.fluorescensin milk exceeded the national standard on the 7^thday.After adding plantaricin Q7，the time ofP. fluorescensexceeding the national standard was postponed for 4 days.Plantaricin Q7 effectively slowed down the increase of milk acidity and the decrease of milk pH value.The results provided a basis for the development and application of plantaricin Q7.

Key words： plantaricin; milk; storage; preservation

0? 引言

牛乳中含有乳糖、優(yōu)質(zhì)蛋白、必需氨基酸、脂溶性維生素、礦物質(zhì)等，其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富且易于吸收，對(duì)維持人體健康有著重要作用^[1].然而正是由于牛乳高營(yíng)養(yǎng)的特點(diǎn)，在生產(chǎn)、運(yùn)輸及保藏過(guò)程中，微生物容易在其中加速繁殖，從而導(dǎo)致牛乳品質(zhì)下降^[2].為了保證牛乳貯藏過(guò)程中的安全性和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，尋找一種方便、安全、有效的防腐策略十分必要.低溫保藏是最常見(jiàn)的一種措施，但低溫?zé)o法抑制嗜冷菌生長(zhǎng)，特別是牛乳中的優(yōu)勢(shì)腐敗菌——熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）在低溫時(shí)仍可以存活^[3]，其產(chǎn)生的蛋白酶及脂肪酶能夠耐受高溫，即使高溫滅菌也無(wú)法將其滅活^[4].使用防腐劑是食品保鮮的另一項(xiàng)重要策略，其中綠色健康的生物防腐劑認(rèn)可度更高^[5].細(xì)菌素是細(xì)菌代謝產(chǎn)生的能夠發(fā)揮抑菌功效的多肽或蛋白質(zhì)，是目前食品生物防腐領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，乳酸鏈球菌素Nisin應(yīng)用廣泛^[6].GAO等^[7]探究了清酒乳桿菌C2（Lactobacillus sakeiC2）產(chǎn)生的細(xì)菌素sakacin C2對(duì)低脂和全脂牛乳中大腸桿菌（Escherichia coli）活性的影響，發(fā)現(xiàn)Nisin能夠增強(qiáng)sakcin C2的抑菌功效.JIN^[8]開(kāi)發(fā)抗菌涂料時(shí)發(fā)現(xiàn)，在未經(jīng)聚乳酸和乳酸鏈球菌素Nisin混合物處理的脫脂牛乳中，單增李斯特菌（Listeria monocytogenes）生長(zhǎng)良好，涂抹聚乳酸和250 mg Nisin后，在3～42 d的整個(gè)儲(chǔ)存期內(nèi)完全滅活了脫脂牛乳中的單增李斯特菌，產(chǎn)生了較好的抗菌防腐效果.Nisin雖然安全高效，但只能抑制革蘭氏陽(yáng)性菌生長(zhǎng)，卻不能殺滅牛乳中熒光假單胞菌和大腸桿菌等革蘭氏陰性菌^[9].本課題組前期從青海牦牛奶中篩選到一株具有抑菌特性的植物乳桿菌Lactobacillus plantarumQ7，完成了全基因組測(cè)序，經(jīng)分離純化和結(jié)構(gòu)鑒定，確定其抗菌成分是植物乳桿菌素Q7^[10].植物乳桿菌素Q7屬于Ⅱ類(lèi)細(xì)菌素，不僅無(wú)毒、高效、穩(wěn)定性強(qiáng)，而且抑菌譜廣，對(duì)多種革蘭氏陽(yáng)性和陰性菌（單增李斯特菌、熒光假單胞菌、大腸桿菌、志賀氏菌等）均具有明顯的抑制效果，可以作為生物防腐劑在牛乳貯藏保鮮中發(fā)揮作用.

1? 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌? 株

植物乳桿菌Lactobacillus plantarumQ7保存于中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院功能性乳品與益生菌工程研究室.

熒光假單胞菌Pseudomonas fluorescens CICC23253購(gòu)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心.

1.1.2 儀? 器

LDZX-75KBS立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠(chǎng)）、SW-CJ-1D潔凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司）、DK-98-IIA電熱恒溫水浴鍋（天津市泰斯特儀器有限公司）、LRH-250生化培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）、ZWY-1102C雙層恒溫培養(yǎng)振蕩器（上海智城分析制造有限公司）、TG20KR-D高速冷凍離心機(jī)（長(zhǎng)沙東旺實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）、PB-10pH計(jì)（賽多利斯儀器有限公司）.

1.1.3 試? 劑

MRS肉湯（青島海博生物技術(shù)有限公司）、LB肉湯（青島海博生物技術(shù)有限公司）、LB營(yíng)養(yǎng)瓊脂（青島海博生物技術(shù)有限公司）、酚酞（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）、氫氧化鈉（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）、蒸餾水.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌株活化

植物乳桿菌Q7以2%（體積分?jǐn)?shù)）的比例接種到MRS肉湯中，在37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h活化;熒光假單胞菌以2%（體積分?jǐn)?shù)）的比例接種到LB肉湯中，在25 ℃振蕩培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h活化，兩者均活化兩代之后進(jìn)行實(shí)驗(yàn).

1.2.2 植物乳桿菌素Q7制備

將植物乳桿菌Q7發(fā)酵液以8 000 r?min^-1的速度離心5 min，除去菌體，獲取上清液.用氫氧化鈉將上清液調(diào)至與蒸餾水pH值一致，然后經(jīng)0.22 ?m濾膜過(guò)濾后進(jìn)行超濾濃縮處理備用.

1.2.3 牛乳預(yù)處理

將牛乳分裝完成后在95 ℃恒溫水浴鍋內(nèi)滅菌10 min，待其冷卻后接入熒光假單胞菌，使菌液在牛乳中的終濃度為1×10³CFU?mL^-1.實(shí)驗(yàn)組牛乳中加入濃縮的植物乳桿菌素Q7，使其在牛乳中的終效價(jià)為533 AU?mL^-1;對(duì)照組加入等量蒸餾水.將處理好的牛乳密封好，儲(chǔ)存于4 ℃的冰箱中，每隔1 d取樣進(jìn)行感官、熒光假單胞菌落數(shù)、酸度和pH值檢測(cè).

1.2.4 牛乳感官評(píng)價(jià)

由8位培訓(xùn)后的食品專(zhuān)業(yè)學(xué)生組成感官評(píng)價(jià)小組，每隔1 d從氣味、色澤和組織狀態(tài)3方面對(duì)牛乳評(píng)分，評(píng)分表制定參照GB 19301—2010^[11]，如表1所示.

1.2.5 牛乳中熒光假單胞菌落數(shù)測(cè)定

牛乳中熒光假單胞菌落數(shù)測(cè)定參照GB 4789.2—2016^[12].每隔1 d取牛乳，使用生理鹽水做10倍梯度稀釋?zhuān)诤线m的梯度下取100 ?L牛乳稀釋液進(jìn)行涂布，在25 ℃下培養(yǎng)48 h后計(jì)數(shù).

1.2.6 牛乳酸度測(cè)定

牛乳酸度測(cè)定參照GB 5009.239—2016^[13].每隔1 d用酚酞作為指示劑，采用滴定法測(cè)定牛乳酸度.

1.2.7 牛乳pH值測(cè)定

每隔1 d用pH計(jì)測(cè)定牛乳的pH值.

1.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)設(shè)置3次重復(fù)，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示.

2? 結(jié)果與討論

2.1 植物乳桿菌素Q7對(duì)牛乳感官特性的影響

2.1.1 植物乳桿菌素Q7對(duì)牛乳氣味的影響

從圖1可以看出，對(duì)照組牛乳儲(chǔ)存前7天一直有奶香味，沒(méi)有異味出現(xiàn)，然而從第9天開(kāi)始出現(xiàn)異味，卻仍可以接受，但在第13天時(shí)腐敗味道較濃，有刺鼻氣味.添加植物乳桿菌素Q7后，實(shí)驗(yàn)組牛乳儲(chǔ)存前7天奶香氣濃郁，直到第13天仍沒(méi)有異味出現(xiàn)，說(shuō)明植物乳桿菌素Q7對(duì)腐敗菌生長(zhǎng)有一定抑制作用，減緩了細(xì)菌將牛乳中乳糖和蛋白類(lèi)物質(zhì)分解而產(chǎn)生腐敗氣味，使牛乳保持香氣.

2.1.2 植物乳桿菌素Q7對(duì)牛乳色澤的影響

植物乳桿菌素Q7對(duì)牛乳色澤的影響如圖2所示.對(duì)照組牛乳從第9天起色澤變暗，逐漸出現(xiàn)焦黃色，第13天時(shí)牛乳顏色發(fā)青，在視覺(jué)上不可接受.而實(shí)驗(yàn)組牛乳在第13天還保持乳白色、略帶黃色的狀態(tài)，說(shuō)明植物乳桿菌素Q7抑制了熒光假單胞菌的生長(zhǎng)，使蛋白酶將牛乳蛋白分解為氨基酸引起褐變的過(guò)程得到緩解，從而使牛乳維持乳白色、略帶黃色.

2.1.3 植物乳桿菌素Q7對(duì)牛乳組織狀態(tài)的影響

對(duì)儲(chǔ)存13 d內(nèi)牛乳的組織狀態(tài)進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果如圖3所示.對(duì)照組牛乳在前3天時(shí)組織狀態(tài)良好，到第7天時(shí)均一性略有下降，第11天時(shí)有分層現(xiàn)象，第13天在底部已有絮狀沉淀.添加了植物乳桿菌素Q7的牛乳在儲(chǔ)存前9天保持均勻一致，沒(méi)有凝塊沉淀出現(xiàn)，第13天雖然稍有黏稠，但并沒(méi)有出現(xiàn)分層、沉淀等.熒光假單胞菌蛋白酶會(huì)將牛乳中的酪蛋白分解，使蛋白質(zhì)失去平衡從而形成沉淀^[14]，植物乳桿菌素 Q7的添加一定程度上抑制以上過(guò)程的發(fā)生，使牛乳保持良好的組織狀態(tài).

2.1.4 植物乳桿菌素Q7對(duì)牛乳感官的綜合影響

根據(jù)牛乳的氣味、色澤和組織狀態(tài)，對(duì)牛乳的感官進(jìn)行綜合打分，結(jié)果如圖4所示.比較每天的分值，發(fā)現(xiàn)對(duì)照組總低于添加植物乳桿菌素Q7組.13 d內(nèi)添加植物乳桿菌素Q7的牛乳感官總分不低于20分，而未添加細(xì)菌素的牛乳從第9天起便低于20分，第13天總分只有8.45分.通過(guò)感官評(píng)價(jià)發(fā)現(xiàn)：植物乳桿菌素Q7有助于牛乳在貯藏保鮮過(guò)程中維持良好感官.

2.2 植物乳桿菌素Q7對(duì)牛乳中熒光假單胞菌落數(shù)的影響

GB 19301—2010規(guī)定菌落總數(shù)低于2×10⁶CFU?mL^-1的牛乳符合標(biāo)準(zhǔn)^[11].在實(shí)驗(yàn)初始，向牛乳中添加1×10³CFU?mL^-1的熒光假單胞菌.由圖5可知：對(duì)照組牛乳在儲(chǔ)存1 d后熒光假單胞菌落數(shù)便超出1×10³CFU?mL^-1，并且菌落數(shù)以較快的速度增加，第7天時(shí)超過(guò)2×10⁶CFU?mL^-1，在第13 d已高達(dá)10⁹CFU?mL^-1左右.添加了植物乳桿菌素Q7的牛乳在儲(chǔ)存第1天和第3天時(shí)，由于細(xì)菌素對(duì)熒光假單胞菌生長(zhǎng)有抑制作用，菌落數(shù)均低于起始的1×10³CFU?mL^-1.從第5天起，菌落數(shù)開(kāi)始超過(guò)起始接入的熒光假單胞菌數(shù)，直到第9天仍低于2×10⁶CFU?mL^-1，到第11天時(shí)，菌數(shù)超過(guò)國(guó)標(biāo)規(guī)定，但超出范圍很小.植物乳桿菌素Q7的添加，使牛乳中熒光假單胞菌的增長(zhǎng)速度變慢，除了從第5天到第7天增長(zhǎng)速度較快，其余時(shí)間菌落數(shù)都以較慢的速度增長(zhǎng).從牛乳中熒光假單胞菌落數(shù)的變化可以看出：植物乳桿菌素Q7有效地抑制了牛乳中熒光假單胞菌的生長(zhǎng)，對(duì)牛乳貯藏起到較好的保鮮效果.

2.3 植物乳桿菌素Q7對(duì)牛乳酸度的影響

GB 19301—2010規(guī)定牛乳酸度為12～18 °T^[11].添加植物乳桿菌素Q7后，牛乳酸度變化如圖6所示.隨著儲(chǔ)存天數(shù)的增多，細(xì)菌不斷繁殖從而產(chǎn)酸，使得牛乳的酸度不斷增加.13天內(nèi)添加植物乳桿菌素Q7牛乳的酸度始終低于對(duì)照組牛乳的酸度.對(duì)照組牛乳的酸度在第5天就已超出國(guó)標(biāo)范圍，在第13天時(shí)達(dá)到35 °T;而添加植物乳桿菌素Q7后，實(shí)驗(yàn)組在第9天酸度才超過(guò)18 °T，最終達(dá)到25 °T.可見(jiàn)植物乳桿菌素Q7可以減慢牛乳酸度的增加，在牛乳貯藏過(guò)程中起到保鮮作用.

2.4 植物乳桿菌素Q7對(duì)牛乳pH值的影響

植物乳桿菌素Q7對(duì)牛乳pH值的影響如圖7所示.隨著儲(chǔ)存天數(shù)的延長(zhǎng)，牛乳的pH值不斷下降.對(duì)照組牛乳的pH值從第1天的6.66下降到5.67，而添加植物乳桿菌素Q7后，牛乳的pH值從6.67下降至6.26，雖然pH值依然呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，但是速率明顯減慢.這說(shuō)明植物乳桿菌素Q7可以控制細(xì)菌生長(zhǎng)，從而抑制產(chǎn)酸，阻止牛乳pH值的快速下降，在牛乳貯藏保鮮中發(fā)揮重要作用.

3? 結(jié)論

本文探究了植物乳桿菌素Q7在牛乳貯藏過(guò)程中的保鮮效果.通過(guò)對(duì)貯藏13 d的牛乳進(jìn)行氣味、色澤和組織狀態(tài)等感官評(píng)價(jià)，以及對(duì)牛乳中熒光假單胞菌落數(shù)、酸度和pH值進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)添加植物乳桿菌素Q7能保持牛乳的感官品質(zhì)，抑制牛乳中腐敗菌生長(zhǎng)，有助于牛乳維持正常酸度和pH值，表明植物乳桿菌素Q7在乳品工業(yè)中的應(yīng)用潛力，為植物乳桿菌素Q7在食品防腐保鮮中的應(yīng)用提供了依據(jù).

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（責(zé)任編輯：顧浩然，馮珍珍）