王志鵬，張璇，車子良，蔣振雄，馬新雨

1 Division of Genetics, Department of Medicine, Brigham and Women’s Hospital, Department of Biological Chemistry and Molecular Pharmacology, Harvard Medical School, Boston, MA 02115, USA.

2 Department of Chemistry, Texas A&M University, College Station, TX 77840, USA.

3清華大學(xué)化學(xué)系，北京 100084

4清華大學(xué)生命學(xué)院，北京100084

5 Department of Mathematics, Harvard University, MA 02138, USA.

6 Department of Biology, Texas A&M University, College Station, TX 77840, USA.

質(zhì)譜技術(shù)在最近幾十年間得以突飛猛進(jìn)的發(fā)展與應(yīng)用，尤其是串級(jí)質(zhì)譜的發(fā)展對(duì)于化學(xué)和生命科學(xué)等眾多分支學(xué)科起到了極大的推動(dòng)作用?？梢哉f一系列組學(xué)的創(chuàng)立就是以質(zhì)譜為基礎(chǔ)的，例如蛋白質(zhì)組學(xué)(Proteomics)、表觀遺傳組學(xué)(Epigenomics)和代謝組學(xué)(Metabolomics)等[1]。其中，基于串級(jí)質(zhì)譜的蛋白質(zhì)翻譯后修飾及表觀遺傳組學(xué)是后基因組時(shí)代的重要研究領(lǐng)域。

翻譯后修飾是表觀遺傳學(xué)的核心組成之一，在體內(nèi)的胞質(zhì)蛋白、膜蛋白和核蛋白上都大量存在。尤其是以組蛋白為代表的核蛋白，其上的各類修飾可能改變DNA分子在組蛋白異源八聚體上纏繞的緊密程度，進(jìn)而直接影響染色體結(jié)構(gòu)。同時(shí)，這些翻譯后修飾還可以影響mRNA轉(zhuǎn)錄酶復(fù)合體II及各種其他轉(zhuǎn)錄因子(Transcriptional factor)的結(jié)合，進(jìn)而改變基因的轉(zhuǎn)錄活性[2]。值得一提的是，所有的蛋白質(zhì)翻譯后修飾均涉及三類蛋白質(zhì)或酶類，包括“寫錄者(Writer)”，“讀取者(Reader)”和“擦除者(Eraser)”。這三者精密配合，共同調(diào)控翻譯后修飾[3]。

質(zhì)譜本身作為分析化學(xué)技術(shù)對(duì)于蛋白質(zhì)翻譯后修飾的各個(gè)研究領(lǐng)域均有重要作用。而新型蛋白質(zhì)翻譯后修飾的發(fā)現(xiàn)和驗(yàn)證則可作為極佳的教學(xué)素材用于化學(xué)、生物學(xué)和醫(yī)學(xué)等交叉學(xué)科的基礎(chǔ)教學(xué)中，可以融入例如有機(jī)化學(xué)、生物化學(xué)、酶學(xué)、化學(xué)生物學(xué)、分子生物學(xué)、遺傳學(xué)、生物物理學(xué)等一系列二級(jí)學(xué)科中。而對(duì)于新型蛋白質(zhì)翻譯后修飾這一過程的探索發(fā)現(xiàn)極大地體現(xiàn)了化學(xué)發(fā)現(xiàn)新結(jié)構(gòu)這一永恒的主題，頗有偵探推理“抽絲剝繭”的意味，在將深刻的前沿生物化學(xué)知識(shí)融入基礎(chǔ)化學(xué)的同時(shí)可以充分調(diào)動(dòng)學(xué)生的興趣[4]。并讓學(xué)生從這些研究中看出基礎(chǔ)有機(jī)化學(xué)和分析化學(xué)知識(shí)對(duì)于前沿生命科學(xué)研究仍然具有的重要意義。對(duì)培養(yǎng)新時(shí)代的創(chuàng)造性跨學(xué)科人才有重要作用。本文將從質(zhì)譜技術(shù)原理入手，以若干新型蛋白質(zhì)翻譯后修飾的發(fā)現(xiàn)研究為典例，按照科學(xué)哲學(xué)的邏輯為基礎(chǔ)，探討結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)在化學(xué)與生物學(xué)教學(xué)中的意義與重要性，以期對(duì)相關(guān)領(lǐng)域的教學(xué)和研究有助[5]。

1 質(zhì)譜技術(shù)簡(jiǎn)述

質(zhì)譜技術(shù)本身的知識(shí)屬于分析化學(xué)或儀器分析。但可以劃歸入基礎(chǔ)有機(jī)化學(xué)、生物化學(xué)和化學(xué)生物學(xué)等二級(jí)學(xué)科中。在基礎(chǔ)教學(xué)尤其是非分析化學(xué)課程教學(xué)中有必要首先講解現(xiàn)代質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用。

1.1 質(zhì)譜概要

質(zhì)譜作為一種基于分子量的分析化學(xué)工具，在過去的20年內(nèi)發(fā)生了很多重大的革新。以電噴霧質(zhì)譜(ESI)[6]和基質(zhì)輔助激光離子化(MALDI)[7]為代表的新型離子化手段的出現(xiàn)使得蛋白質(zhì)分析成為了可能。伴隨硬件的發(fā)展，質(zhì)譜的檢測(cè)器也實(shí)現(xiàn)了多樣化，發(fā)展出飛行時(shí)間(TOF)、四級(jí)桿(Quadrupole)、離子阱(Ion traps)、軌道離子阱(Orbitraps)和離子回旋共振(ICR)五大類，并使用傅里葉變換(FT)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。這些檢測(cè)器不僅可以生成被測(cè)物的質(zhì)荷比信號(hào)(m/z)，還可以得出不同荷質(zhì)比的相對(duì)強(qiáng)度，進(jìn)而生成最終的質(zhì)譜圖譜。對(duì)于蛋白質(zhì)這些大分子量生物分子，其可以同時(shí)帶有若干電荷，故而人們發(fā)展了對(duì)應(yīng)的軟件進(jìn)行特定峰值的劃歸計(jì)算，即去卷積化(Deconvolution)。

當(dāng)被分析的生物大分子處于復(fù)雜的混合物狀態(tài)時(shí)，我們需要進(jìn)行液質(zhì)聯(lián)用(HPLC-MS)。經(jīng)由HPLC先對(duì)樣品進(jìn)行純化分離后，再送入質(zhì)譜分析。這樣的混合物狀態(tài)可以直接來自細(xì)胞裂解液或者提純的細(xì)胞器或細(xì)胞核，還可以是人為進(jìn)行蛋白質(zhì)酶解后所得的多肽片段混合物。值得注意的是，在使用C18反相柱色譜進(jìn)行分離純化的同時(shí)，多肽也被富集到具有一定百分比有機(jī)溶劑的水相中，適合進(jìn)一步分析。

1.2 串級(jí)質(zhì)譜概要

串級(jí)質(zhì)譜(Tandem MS或MS/MS)是一種具有分析蛋白質(zhì)序列這一強(qiáng)有力手段的質(zhì)譜衍生技術(shù)。在檢測(cè)荷質(zhì)比后，具有特定荷質(zhì)比的前體離子(Precursor ion)將被電磁場(chǎng)分離，并與惰性氣體分子進(jìn)行碰撞而裂解形成子代離子(Daughter ion)。子代離子進(jìn)而被下一級(jí)質(zhì)譜檢測(cè)。除了與稀有氣體分子的碰撞而導(dǎo)致解離(CID)外，電子轉(zhuǎn)移(ETD)、電子捕獲(ECD)等也能導(dǎo)致前體離子的解離。

解離涉及到前體離子化學(xué)鍵的斷裂，故而鍵能較弱的共價(jià)鍵易于斷裂。由于解離過程包含有前體離子的結(jié)構(gòu)信息，故而串級(jí)質(zhì)譜可以反映前體離子的結(jié)構(gòu)。這對(duì)于多肽尤其重要，雖然多肽所裂解產(chǎn)生的子代離子可能有多種不同的模式，但都具有逐個(gè)氨基酸的信息[8]。故而，將同種前體離子檢測(cè)到的所有子代離子的荷質(zhì)比合并作圖可得串級(jí)質(zhì)譜圖譜。將串級(jí)質(zhì)譜圖譜與同種前體離子可以產(chǎn)生所有的理論子代離子相互對(duì)比即可確定多肽的序列。這一過程通過特定的計(jì)算機(jī)軟件算法得出，之后則需人工進(jìn)行峰歸屬劃分[9]。隨著檢測(cè)需求的增加，相關(guān)的配套軟件也進(jìn)行了不斷的升級(jí)和改進(jìn)。為了進(jìn)一步提升軟件對(duì)于肽和翻譯后修飾(PTM)識(shí)別的準(zhǔn)確性和靈敏度，趙英明課題組[10]近來開發(fā)了PTMap軟件。該軟件包含了峰值選擇、不精確誤差調(diào)整和PTM的精確定位等功能。而對(duì)于不匹配的峰，該軟件還能自動(dòng)執(zhí)行基于手動(dòng)驗(yàn)證規(guī)則的肽段鑒定，提高了后期修正的效率。

1.3 質(zhì)譜對(duì)翻譯后修飾研究的應(yīng)用

質(zhì)譜對(duì)于翻譯后修飾領(lǐng)域的發(fā)展具有極為關(guān)鍵的作用，可以說翻譯后修飾的發(fā)現(xiàn)、功能研究都直接或間接與質(zhì)譜相關(guān)?？梢苑譃橹饕獛讉€(gè)方面。首先，質(zhì)譜技術(shù)可以用于發(fā)現(xiàn)和確定新的翻譯后修飾模式，這種定性研究是后續(xù)研究的基礎(chǔ)。其次，借助于質(zhì)譜技術(shù)，我們可以對(duì)某種翻譯后修飾進(jìn)行定量研究，以確定某種特定的翻譯后修飾在細(xì)胞生理或病理過程中的變化情況。這種定量研究同樣是后續(xù)研究的基礎(chǔ)。

之后三個(gè)應(yīng)用都是基于前兩個(gè)完成的。第三，對(duì)于某種翻譯后修飾定量研究的結(jié)論，我們可以追本溯源地尋找其對(duì)應(yīng)的“寫錄者”和“擦除者”，并進(jìn)行進(jìn)一步的生物化學(xué)和生物物理學(xué)研究。第四，同樣是基于某種翻譯后修飾定量研究的數(shù)據(jù)，我們可以搜尋其上游的“寫錄者”和下游的“讀取者”以明確其在細(xì)胞信號(hào)傳遞通路中的作用。最后，基于單一翻譯后修飾的定性、定量數(shù)據(jù)，我們可以進(jìn)一步研究蛋白質(zhì)翻譯后修飾之間的交叉感應(yīng)(Crosstalk)的情況。本文將主要針對(duì)質(zhì)譜與串級(jí)質(zhì)譜技術(shù)對(duì)于新型翻譯后修飾的發(fā)現(xiàn)進(jìn)行分析。從方法論出發(fā)，并列舉若干近年來的主要突破性進(jìn)展。

2 質(zhì)譜技術(shù)發(fā)現(xiàn)新型翻譯后修飾之總論

質(zhì)譜的進(jìn)步對(duì)新型翻譯后修飾的發(fā)現(xiàn)和確認(rèn)可以算一次技術(shù)上的重大革新。這里可以簡(jiǎn)單分為三大步驟。值得一提的是，人們通常選用組蛋白作為發(fā)現(xiàn)新型翻譯后修飾并研究翻譯后修飾的理想目標(biāo)。一方面是組蛋白上存在豐富的翻譯后修飾，而這些翻譯后修飾也有重要的生物調(diào)控功能。另一方面，組蛋白相比其他胞質(zhì)蛋白如代謝酶類具有更加豐富的量并易于進(jìn)行生物化學(xué)和化學(xué)生物學(xué)處理。

2.1 分子量確認(rèn)

傳統(tǒng)的以組蛋白為典型代表的翻譯后修飾的搜尋可以歸納為偶然的意外發(fā)現(xiàn)。而現(xiàn)代的精確質(zhì)譜法對(duì)于新型翻譯后修飾的發(fā)現(xiàn)則形成了系統(tǒng)化的流程。高靈敏度的HPLC-MS/MS是檢測(cè)出低豐度新型翻譯后修飾的先決條件。而這一分析過程一般是在將目標(biāo)蛋白質(zhì)通過胰蛋白酶酶切形成的多肽片段上進(jìn)行的。在未知理論分子量變化(ΔMr)的情況下，一級(jí)質(zhì)譜算法可以實(shí)現(xiàn)無差別的全序列篩查。由于從分子量無法直接推斷序列及結(jié)構(gòu)的信息，故而來自一級(jí)質(zhì)譜的數(shù)據(jù)并不能直接確定修飾的更多結(jié)構(gòu)信息。即便如此，人們也可以利用高精度的ΔMr數(shù)值與原子量的精確數(shù)值進(jìn)行對(duì)比而計(jì)算出新型翻譯后修飾的分子式。進(jìn)而通過串級(jí)質(zhì)譜確定該翻譯后修飾所在的氨基酸位置。這可以確定一些可以修飾多種氨基酸殘基的翻譯后修飾的具體位置，例如賴氨酸和精氨酸都可以烷基化，而絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸和組氨酸都可以磷酸化。

2.2 結(jié)構(gòu)確定

在確定分子式后，我們需要對(duì)新型翻譯后修飾進(jìn)行可能的異構(gòu)體排查以確定其結(jié)構(gòu)式。理想情況下，我們直接將對(duì)應(yīng)的翻譯后修飾蛋白或多肽進(jìn)行核磁共振(NMR)分析即可，但是一方面我們很難提取到足夠的勻質(zhì)的翻譯后修飾蛋白，另一方面NMR分析可能過于復(fù)雜。故而，我們需要用窮舉法列出所有的可能翻譯后修飾結(jié)構(gòu)。一般說來翻譯后修飾的分子式不會(huì)過于復(fù)雜，通常在10個(gè)碳原子以內(nèi)，使得可能的結(jié)構(gòu)式也不會(huì)過于繁雜。我們進(jìn)一步合成對(duì)應(yīng)含有新型翻譯后修飾的多肽進(jìn)行質(zhì)譜和串級(jí)質(zhì)譜研究，并與天然多肽的圖譜進(jìn)行對(duì)比。利用一些細(xì)小的“指紋圖譜”一般能夠確定具體的結(jié)構(gòu)。

2.3 最終確認(rèn)

3 質(zhì)譜技術(shù)發(fā)現(xiàn)新型翻譯后修飾之分論

在最近的數(shù)十年內(nèi)，人們發(fā)現(xiàn)并解析了大量的新型翻譯后修飾。這些翻譯后修飾不僅存在于組蛋白上，還存在于各類胞質(zhì)蛋白和膜蛋白上。下面分類列舉若干典型案例著重對(duì)發(fā)現(xiàn)過程進(jìn)行討論。這部分主要引用芝加哥大學(xué)趙英明課題組的近期研究成果，該課題組主要致力于利用串級(jí)質(zhì)譜技術(shù)對(duì)蛋白質(zhì)的新型翻譯后修飾進(jìn)行定性定量研究。

3.1 執(zhí)果索因：賴氨酸三種二?；?/h3>

賴氨酸酰基化是一大類翻譯后修飾。最初人們對(duì)其的認(rèn)識(shí)僅僅是乙酰、丙酰、丁酰等簡(jiǎn)單的修飾模式[14]。直到二酰化的發(fā)現(xiàn)極大地突破了人類的認(rèn)知。2012年，趙英明課題組[15]在人、小鼠、果蠅和酵母細(xì)胞的組蛋白上發(fā)現(xiàn)賴氨酸的丁二酰化(Succinylation)與丙二?；?Malonylation)。與典型的新型翻譯后修飾發(fā)現(xiàn)的模式不同，由于丁二?；诩?xì)胞內(nèi)作為代謝中間體廣泛存在，尤其是在線粒體三羧酸循環(huán)中。該課題組之前已經(jīng)在非組蛋白上鑒定到賴氨酸丁二?；?，進(jìn)而預(yù)測(cè)丁二酰化賴氨酸亦存在于組蛋白的前提下對(duì)其進(jìn)行蛋白質(zhì)免疫印跡的檢定。之后用HPLC-MS/MS的手段檢測(cè)并分析出組蛋白上丁二?；男揎椢稽c(diǎn)，并最終合成修飾后的多肽進(jìn)行驗(yàn)證?；谝陨蟽煞N二?；g后修飾，趙英明課題組[16]又于2014年發(fā)現(xiàn)了蛋白質(zhì)的賴氨酸戊二?；?Glutarylation)?？紤]到結(jié)構(gòu)的相似性，戊二?；梢砸暈楸；?、丁二?；牡谌N同系物。該課題組同樣從免疫印跡法入手進(jìn)而用串級(jí)質(zhì)譜進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)并驗(yàn)證了該翻譯后修飾在人體蛋白質(zhì)組中廣泛存在。而重要的代謝酶氨基甲酰磷酸合成酶1 (CPS1)的戊二?；揎椏梢员唤M蛋白去乙?；窼irtuin5脫除。這三種二?；嚢彼岬陌l(fā)現(xiàn)極大地拓寬了人們對(duì)于翻譯后修飾的認(rèn)識(shí)，不僅消除了賴氨酸在天然狀態(tài)下原本的正電荷，還附加了一個(gè)額外的負(fù)電荷，故而極大地影響了對(duì)應(yīng)的底物蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)功能與調(diào)控[17]。

3.2 上下求索：賴氨酸苯甲?；?/h3>

前三種二?；嚢彼岬陌l(fā)現(xiàn)可以算是“有的放矢”，即在已經(jīng)根據(jù)細(xì)胞代謝過程或其他信息猜想特定結(jié)構(gòu)存在的前提下進(jìn)行的檢測(cè)與驗(yàn)證。其本身的過程較為直截了當(dāng)，并不太符合前文所述的“發(fā)現(xiàn)–猜想–驗(yàn)證”的模式。

新型翻譯后修飾層出不窮。直到2018年，趙英明課題組[18]還進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)了組蛋白上賴氨酸的苯甲?；?Benzoylation)。該課題組在將胰蛋白酶處理后的HepG2細(xì)胞組蛋白提取物進(jìn)行串級(jí)質(zhì)譜分析過程中發(fā)現(xiàn)其H2B的第五位賴氨酸(K5)上帶有+104.0268 Da的增加。經(jīng)過精細(xì)分子量比對(duì)，得出可能的修飾分子式為C7H4O?？紤]到其帶有的一個(gè)自由價(jià)(單電子)，且取代賴氨酸時(shí)需要脫去一個(gè)氫原子，劃歸后的修飾分子式為C7H6O。此分子式的不飽和度是5，推斷只能是“苯甲醛”(圖1)。故而得出該修飾為苯甲?；揎?。在后續(xù)驗(yàn)證中，合成的多肽和天然多肽，及二者的混合物均展現(xiàn)相似的特征串級(jí)質(zhì)譜圖譜。該修飾是由于服用了作為美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準(zhǔn)作為藥物及食品防腐劑的苯甲酸鈉而促進(jìn)產(chǎn)生的，并可以進(jìn)一步作為組蛋白翻譯后修飾參與生理調(diào)控。

圖1 賴氨酸苯甲酰化的結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)

從這里可以看出，要想準(zhǔn)確確定修飾的分子式，其前提條件是精確測(cè)定的分子量增量。類似的還有賴氨酸的甲酰化的發(fā)現(xiàn)。雖然對(duì)于甲?；投谆鶠?28 Da，但是二者相距0.0364 Da。Wisniewski課題組[19]通過串級(jí)質(zhì)譜精確測(cè)定的分子量變化進(jìn)而確定之，而甲?；鳛樽詈?jiǎn)單的一個(gè)碳原子的酰基化，只有唯一一種可能結(jié)構(gòu)。而這一修飾的來源可能是DNA的氧化損傷[20]。

3.3 左右逢源：賴氨酸羥基異丁?；?Hydroxyisobutyrylation)

如果說苯甲?；陌l(fā)現(xiàn)是一帆風(fēng)順，而另外一種修飾的發(fā)現(xiàn)過程則一波三折。由于細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)與能量代謝中可能產(chǎn)生各種各樣的活性酰基，這些酰基可以以酶促反應(yīng)或非酶促反應(yīng)的方式對(duì)蛋白質(zhì)賴氨酸和氮端氨基進(jìn)行修飾。故而存在各種可能的新型修飾結(jié)構(gòu)。

早在2010年，趙英明課題組[21]就開始對(duì)新型蛋白質(zhì)翻譯后修飾進(jìn)行發(fā)現(xiàn)和研究。他們首先將胰蛋白酶處理后的小鼠睪丸細(xì)胞組蛋白提取物用HPLC-MS/MS分離鑒定，發(fā)現(xiàn)組蛋白H4第77位賴氨酸(K77)上帶有未知的+86.0354 Da的增加。根據(jù)精細(xì)分子量比對(duì)，得出可能的修飾分子式為C4H7O2，再確定劃歸后的修飾分子式C4H8O2。與前例中“苯甲醛”不同，單純從這一分子式的化學(xué)角度看似乎具有太多結(jié)構(gòu)可能性，但接下來需要整合各種信息進(jìn)行系統(tǒng)性推理并加以驗(yàn)證。

首先，C4H8O2的不飽和度是1，結(jié)合賴氨酸修飾模式，最大可能是被酰基占用。再結(jié)合人體細(xì)胞代謝產(chǎn)物中一般不具有醚的結(jié)構(gòu)，故而剩下的結(jié)構(gòu)為羥基丙基結(jié)構(gòu)?？紤]其碳鏈的構(gòu)造異構(gòu)體，具有五種可能。首先是直鏈丙基上的伯碳取代形成羥基正丙基對(duì)應(yīng)4-羥基丁酰(圖2A)、2位仲碳取代形成的2-羥基丙基對(duì)應(yīng)3-羥基丁酰(圖2B)、3位仲碳取代形成的1-羥基丙基對(duì)應(yīng)的2-羥基丁酰(圖2C)；其次是支鏈異丙基的伯碳取代形成的2-羥基異丙基對(duì)應(yīng)的3-羥基異丁酰(圖2D)和仲碳取代形成的1-羥基異丙基對(duì)應(yīng)的2-羥基異丁酰(圖2E)。

圖2 賴氨酸羥基丁?；赡芙Y(jié)構(gòu)(1)

為了進(jìn)一步確認(rèn)新型翻譯后修飾的結(jié)構(gòu)，Zhao等[22]利用多肽固相合成產(chǎn)生含有以上五種修飾的多肽，進(jìn)行HPLC-MS/MS分析并與天然對(duì)應(yīng)多肽進(jìn)行對(duì)比。最終發(fā)現(xiàn)含有2-羥基異丁酰(圖2E)的多肽與天然修飾多肽具有一致的色譜保留時(shí)間及相同的串級(jí)質(zhì)譜指紋圖譜。故而得出結(jié)論新型翻譯后修飾為賴氨酸的2-羥基異丁?；?Khib)。該修飾被證明廣泛存在于細(xì)胞質(zhì)組中。

3.4 前呼后應(yīng)：賴氨酸β-羥基丁?；?β-hydroxybutyrylation)

如果說羥基異丁?；陌l(fā)現(xiàn)結(jié)合了基礎(chǔ)有機(jī)化學(xué)同分異構(gòu)體的知識(shí)，那么基礎(chǔ)生物化學(xué)知識(shí)在另一種修飾的發(fā)現(xiàn)過程中同樣起到了重要作用。這一典例進(jìn)一步說明新型蛋白質(zhì)翻譯后修飾的發(fā)現(xiàn)集合了多種交叉學(xué)科的知識(shí)，是極佳的教學(xué)素材。

無獨(dú)有偶，2016年趙英明課題組[23]用HPLC-MS/MS對(duì)胰蛋白酶處理后的HEK293細(xì)胞組蛋白提取物進(jìn)行分析，在組蛋白H3的第18位賴氨酸(K18)上發(fā)現(xiàn)同樣的未知+86.0376 Da的增加。這種修飾雖然與2-羥基異丁?；哂邢嗤姆肿邮?，但結(jié)構(gòu)并不相同。由于生物體系都具有特定的手性選擇，考慮到手性中心的不同，需要將該列表拓展至8種，即(R/S)-3-羥基丁酰(圖3B1/2)、(R/S)-2-羥基丁酰(圖3C1/2)、(R/S)-3-羥基異丁酰(圖3D1/2) (圖3)。

圖3 賴氨酸羥基丁?；赡芙Y(jié)構(gòu)(2)

為了驗(yàn)證結(jié)構(gòu)，該課題組合成了分別帶有以上8種可能的修飾模式的多肽，并進(jìn)行HPLC-MS/MS的鑒定。對(duì)于非對(duì)映異構(gòu)體，其具有不同的化學(xué)結(jié)構(gòu)，即便在非手性的HPLC柱色譜上也可根據(jù)不同的保留時(shí)間進(jìn)行區(qū)分。可以將可能性縮小至3-羥基丁基(β-羥基丁基)即的兩種異構(gòu)體(圖3B1/2)。

這里又需要借助于生物化學(xué)的分析。考慮到代謝中β-羥基丁酸(圖4I)是由乙酰乙酸(圖4G)還原而來，而后者又由乙酰輔酶A (Ac-SCoA，圖4F)縮合形成。β-羥基丁酸、乙酰乙酸和其非酶促脫羧產(chǎn)物丙酮(圖4H)這三者共同構(gòu)成“酮體”(Ketone body)。其中，β-羥基丁酸是乙酰乙酸在3-羥基丁酸脫氫酶催化下還原形成，主要產(chǎn)物為R構(gòu)象而非S構(gòu)象。其之的可能代謝路線是形成-羥基丁酰輔酶A (圖4J)，并最終酰化賴氨酸。故而可以推測(cè)修飾結(jié)構(gòu)為R-β-羥基丁酰化。合成的含有R-β-羥基丁酰化賴氨酸的多肽片段和天然片段具有一致的保留時(shí)間和相同的串級(jí)質(zhì)譜指紋圖譜，故而結(jié)構(gòu)(KBhb)得以最終確認(rèn)。

圖4 酮體與β-羥基丁酸的代謝

此外，2011年Zhao等[24]由組蛋白H2B第5位賴氨酸上發(fā)現(xiàn)+68.0230 Da，結(jié)合分子式的可能性和細(xì)胞代謝中間體分析確定為(Crotonylation)；2019年由趙英明課題組[25]利用類似方式發(fā)現(xiàn)的賴氨酸乳?；?Lactylation)，也是由+72.021 Da的分子量增加入手，結(jié)合分子式的有機(jī)化學(xué)分析與代謝過程的生物化學(xué)分析進(jìn)行確定驗(yàn)證。

3.5 為果設(shè)因：賴氨酸4-氧代-2-壬酰化修飾

在前文所列舉的若干案例中，都是直接用液相色譜-串級(jí)質(zhì)譜聯(lián)用直接從正常的培養(yǎng)細(xì)胞中提取蛋白質(zhì)進(jìn)行分析。而另外一些特別的情況則是讓細(xì)胞在人為控制的情況下生長(zhǎng)進(jìn)而進(jìn)行類似分析。一個(gè)典型案例是4-氧代-2-壬?；?4-ONEylation)的發(fā)現(xiàn)。由細(xì)胞代謝過程可知，長(zhǎng)鏈脂質(zhì)在氧化代謝過程中會(huì)產(chǎn)生多種α,β-不飽和醛類，例如4-羥基-2-壬醛(4-HNE)和4-氧代-2-壬醛(4-ONE)等(圖5)。從有機(jī)化學(xué)角度看這些α,β-不飽和醛類可以作為極好的邁克爾加成受體(Michael acceptor)并被細(xì)胞內(nèi)的親核基團(tuán)進(jìn)攻，例如蛋白質(zhì)上廣泛存在的賴氨酸、半胱氨酸和組氨酸等。其中，由于4-氧代-2-壬醛存在第2個(gè)羰基，故而理論上可以形成穩(wěn)定的1,2-加成產(chǎn)物。

2014年，Marnett課題組[26]分析了在含有炔基官能化的4-HNE和4-ONE的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)這兩類代謝產(chǎn)物會(huì)共價(jià)修飾組蛋白上的賴氨酸和組氨酸，代表性產(chǎn)物為4-氧代-2-壬酰化賴氨酸(圖5N)。而組蛋白H3第27位賴氨酸(K27)的4-氧代-2-壬?；揎椛踔?xí)种坪诵◇w的折疊。這種新型賴氨酸翻譯后修飾同樣被質(zhì)譜和串級(jí)質(zhì)譜中的分子量之改變所證實(shí)。而賴氨酸的4-羥基壬醛化修飾(4-HNEylation)也被證明以多種不同結(jié)構(gòu)(圖5K/L)存在，且與一些重要代謝疾病相關(guān)[27]。

圖5 可能的賴氨酸4-ONEylation與4-HNEylation修飾結(jié)構(gòu)

4 討論

對(duì)于翻譯后修飾，其生物化學(xué)性質(zhì)與生物學(xué)功能是最為重要的。各類翻譯后修飾對(duì)于調(diào)控底物蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能至關(guān)重要，進(jìn)而可以影響細(xì)胞的整體結(jié)構(gòu)、代謝、功能與活動(dòng)[28]。而質(zhì)譜技術(shù)對(duì)新型翻譯后修飾研究的貢獻(xiàn)還遠(yuǎn)不止發(fā)現(xiàn)。例如，將新型翻譯后修飾在全蛋白質(zhì)組進(jìn)行定位與定量研究、系統(tǒng)地預(yù)測(cè)可以對(duì)蛋白功能產(chǎn)生干擾的修飾位點(diǎn)[29]等。

4.1 教學(xué)素材選取

本文著重質(zhì)譜技術(shù)對(duì)于輔助新型蛋白質(zhì)翻譯后修飾的發(fā)現(xiàn)過程的討論，并未涉及質(zhì)譜技術(shù)對(duì)其進(jìn)一步的定性定量研究的相關(guān)內(nèi)容，難免有失偏頗。但這部分從教學(xué)的趣味性上看是難得的素材。在前沿科學(xué)研究中融入了基本的有機(jī)化學(xué)與生物化學(xué)知識(shí)，極為生動(dòng)地給學(xué)生們展示了基礎(chǔ)教學(xué)內(nèi)容可以被實(shí)實(shí)在在用于科研發(fā)現(xiàn)中去。

同時(shí)，對(duì)應(yīng)的案例教學(xué)可以融入五種經(jīng)典科學(xué)研究中可以遵循的研究邏輯：“執(zhí)果索因”即先有結(jié)構(gòu)后尋覓；“上下求索”即發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致唯一下游結(jié)果；“左右逢源”即發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致不唯一結(jié)果，需要利用窮舉法進(jìn)行排除試錯(cuò)；“前呼后應(yīng)”即與之前的結(jié)果相關(guān)，但需要借助其他各個(gè)學(xué)科知識(shí)進(jìn)行分析；“為果設(shè)因”即為了探尋假說而認(rèn)為創(chuàng)造可能情況。

4.2 化學(xué)生物學(xué)應(yīng)用

串級(jí)質(zhì)譜對(duì)于蛋白質(zhì)翻譯后修飾的研究的應(yīng)用與貢獻(xiàn)還遠(yuǎn)不止于此。一方面，近年來發(fā)現(xiàn)的新型翻譯后修飾遠(yuǎn)不止于此。單純以賴氨酸為例，在酶促或非酶促條件下可能的修飾有幾十種，例如通過蛋白質(zhì)組分析發(fā)現(xiàn)，糖酵解中間體1,3-雙磷酸甘油酸酯與蛋白質(zhì)中的特定賴氨酸殘基的反應(yīng)不需要酶催化即可形成3-磷酸甘油基賴氨酸(3-phosphoglycerylation)的過程[30]。這里只是與質(zhì)譜相關(guān)的少數(shù)典例。

另一方面，由于在研究特定蛋白質(zhì)翻譯后修飾蛋白質(zhì)時(shí)，我們需要首先獲取足夠量的目標(biāo)蛋白。而生物學(xué)家卻難以直接使用生物工程手段進(jìn)行表達(dá)[31]。故而對(duì)于化學(xué)生物學(xué)家，制備含有特定修飾的蛋白質(zhì)是一項(xiàng)挑戰(zhàn)[32]。目前已經(jīng)有非天然氨基酸引入法[33]、蛋白質(zhì)全合成與半合成法[34]、生物正交反應(yīng)法[35]等一系列合成手段。在合成后，仍然需要用串級(jí)質(zhì)譜進(jìn)行分析與驗(yàn)證。

5 結(jié)語

隨著蛋白質(zhì)翻譯后修飾的逐步發(fā)現(xiàn)和深入研究，質(zhì)譜技術(shù)也顯示出其在生命科學(xué)領(lǐng)域中廣泛存在的應(yīng)用價(jià)值。尤其是伴隨著一系列串級(jí)質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展，質(zhì)譜能提供一系列蛋白質(zhì)等生物大分子系列、結(jié)構(gòu)和修飾等信息。其中極高的分子量精度更是極大促進(jìn)了新型翻譯后修飾的發(fā)現(xiàn)。

本文首先對(duì)質(zhì)譜特別是串級(jí)質(zhì)譜進(jìn)行了概述。其次，對(duì)質(zhì)譜技術(shù)在發(fā)現(xiàn)新型翻譯后修飾方面發(fā)揮的作用，包括分子量的確認(rèn)、結(jié)構(gòu)確定及最終的驗(yàn)證等方面進(jìn)行了論述。隨后，我們以五個(gè)典型案例為例，包括賴氨酸三種二?；?、賴氨酸苯甲?；?、賴氨酸羥基異丁?；?、賴氨酸β-羥基丁?；唾嚢彼?-氧代-2-壬?；揎棧故玖瞬煌壿嬛笇?dǎo)下質(zhì)譜技術(shù)如何在新型蛋白質(zhì)翻譯后修飾發(fā)現(xiàn)過程中發(fā)揮作用。通過上述對(duì)于質(zhì)譜技術(shù)應(yīng)用案例的研究，筆者為學(xué)生生動(dòng)展示了基礎(chǔ)教學(xué)內(nèi)容與科學(xué)研究之間的聯(lián)系。在培養(yǎng)學(xué)生學(xué)習(xí)基礎(chǔ)化學(xué)和生命科學(xué)興趣[36]的同時(shí)，為教學(xué)研究中解析研究邏輯方面的內(nèi)容提供了良好的范例，并應(yīng)用于蛋白質(zhì)翻譯后修飾的化學(xué)生物學(xué)研究中去[37]。這對(duì)于培養(yǎng)新型創(chuàng)新性交叉學(xué)科人才極為重要[38]。

致謝：感謝Texas A&M University博士生Erol Can Vatansever參與討論和提出的建議。