謝玉瑾，宋雪云，馬永春

結(jié)核病是一種由單一傳染源引起的傳染性疾病，嚴重威脅人類生命健康[1]。結(jié)核分枝桿菌屬于革蘭陽性菌，主要侵犯肺臟，引發(fā)肺結(jié)核病。結(jié)核分枝桿菌主要在巨噬細胞內(nèi)寄生，當人體免疫力較強時，巨噬細胞可以殺滅細胞內(nèi)寄生的病原菌，而當人體免疫力較弱時，巨噬細胞免疫反應能力降低，病原菌在巨噬細胞內(nèi)長期存在[2]。長鏈非編碼RNA（long-non-coding RNA, lncRNA）在人體免疫反應、炎癥反應、細胞運動、新陳代謝等過程中發(fā)揮作用，是近些年生命科學領(lǐng)域研究中的重點和熱點[3]。研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA和結(jié)核病發(fā)生有關(guān)，參與巨噬細胞清除結(jié)核分枝桿菌過程，可能是疾病治療的分子靶標[4]。lncRNA PCED1BAS1是在結(jié)核病患者中表達下調(diào)的調(diào)節(jié)因子，影響巨噬細胞凋亡，可能是結(jié)核病進展中的抑制因子[5]，目前尚未明確其在巨噬細胞清除結(jié)核分枝桿菌以及分泌炎癥因子中的作用。本研究以巨噬細胞RAW264.7作為研究對象，探討PCED1B-AS1在巨噬細胞清除結(jié)核分枝桿菌以及分泌炎癥因子中的作用和可能機制，旨在為分子靶向治療結(jié)核病提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料 巨噬細胞RAW264.7購自南京科佰生物科技有限公司；結(jié)核分枝桿菌H37Rv購自美國ATCC；pcDNA-PCED1B-AS1、pcDNA均由云舟生物科技（廣州）有限公司構(gòu)建；核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體3（NLR family pyrindomain containing 3, NLRP3） 小干擾RNA（small interfering RNA,siRNA）、siRNA control由漢恒生物科技（上海）有限公司構(gòu)建；NLRP3抗體購自美國Abcam；引物由南京金斯瑞生物技術(shù)有限公司合成。

1.2 細胞感染模型構(gòu)建 巨噬細胞于含有1%雙抗、10%胎牛血清的RPMI1640中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度37 ℃，培養(yǎng)箱中含有5%的CO2，細胞密度超過90%以后，進行細胞傳代。感染結(jié)核分枝桿菌的巨噬細胞應為處于對數(shù)生長期的細胞，把細胞接種到24孔板內(nèi)，以H37Rv感染巨噬細胞（感染復數(shù)為5），繼續(xù)培養(yǎng)4 h以后，添加PBS溶液將細胞洗滌，然后添加新鮮的細胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。把沒有感染H37Rv的巨噬細胞命名為Control組，將感染H37Rv以后的巨噬細胞設(shè)置為Control+H37Rv組。收集Control組、Control+H37Rv組細胞培養(yǎng)48 h，用于1.3中檢測。

1.3 PCED1B-AS1、NLRP3 和 TNF-α、IL-6 mRNA水平檢測 在細胞內(nèi)添加Trizol試劑，用移液槍反復吹打混合，促進細胞充分裂解，然后按照常規(guī)方法提取細胞總RNA。將提取的RNA沉淀溶解在體積為20 μl的RNase-free水中，放在-80 ℃的冰箱中保存?zhèn)溆?。吸? μl的RNasefree水將紫外分光光度計清洗，然后吸取1 μl的RNA用于檢測A260/A280的比值，比值在1.8～2.0之間表示純度良好。cDNA合成反應如下：在EP管中添加 1 μl的 Oligo（dT）、1 μg 的 RNA、1 μl的Random primer，最后加ddH2O至總體積達到13 μl，在普通PCR儀上設(shè)置65 ℃反應13 min，置于冰上，繼續(xù)添加 1 μl的 dNTP、5 μl的 5×RT Reaction Buffer、1 μl 的 RNase inhibitor、1 μl 的M-MLV RTase，加入ddH2O至總體積為25 μl，在普通PCR儀上設(shè)置37 ℃條件結(jié)合60 min，85 ℃條件結(jié)合5 s，放在-20 ℃中保存。PCR的引物序列如下。PCED1B-AS1上游：TCAAGCCAATCAGCTGACAC；下游：AAACAAATGCCCTGCTTGAC。NLRP3上 游：CCCTGCATTTTGTTGTTGTTG； 下游：CCTGCTTCTCACATGTCGTC。TNF-α上游：ACGGCATGGATCTCAAAGAC；下游：GTGGGTGAGGAGCACGTAGT。IL-6上 游：ATGAACTCCTTCTCCACAAGCGC；下游：GAAGAGCCCTCAGGCTGGACTGG。GAPDH（內(nèi)參）上游：GCACCGTCAAGGCTGAGAAC；下游：TGGTGAAGACGCCAGTGGA。PCR反應體系為：2 μl的上游引物、2 μl的下游引物、10 μl的 2×All-in-one qPCR mix、2 μl的 cDNA模板、0.4 μl的 50×ROX reference，加入 ddH2O 至總體積為20 μl，在熒光定量PCR儀中，設(shè)置預變性條件為95 ℃ 10 min，變性條件為95 ℃ 10 s，退火條件為56 ℃ 20 s，延伸條件為72 ℃ 30 s，一共進行40個循環(huán)。根據(jù)反應得到的CT值，經(jīng)2-△△CT方法計算基因表達變化。

1.4 細胞轉(zhuǎn)染 將巨噬細胞種植到6孔板內(nèi)準備細胞轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染步驟如下：①用50 μl不含血清的RPMI1640把4 μg質(zhì)粒稀釋，混勻，放在室溫中結(jié)合5 min；②用50 μl不含血清的RPMI1640把5 μl的轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000稀釋，混勻，放在室溫中結(jié)合5 min；③將步驟①和②中的試劑混合，在室溫條件下孵育20 min；④收集步驟③中的混合物，添加到6孔板內(nèi)，放在培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)6 h。更換細胞培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)12 h。將pcDNAPCED1B-AS1、pcDNA轉(zhuǎn)染巨噬細胞后，用H37Rv感染（感染復數(shù)為5），設(shè)置為PCED1BAS1+H37Rv組、Vector+H37Rv組，Control+H37Rv組處理方法同1.2。收集Control+H37Rv、PCED1BAS1+H37Rv、Vector+H37Rv組細胞，按照1.3中方法利用qRT-PCR檢測PCED1B-AS1和TNF-α、IL-6 mRNA表達水平，同時用于1.5和1.6中檢測。

1.5 巨噬細胞清除結(jié)核分枝桿菌檢測 巨噬細胞感染后繼續(xù)培養(yǎng)72 h，收集細胞裂解物，然后將裂解物種植在含有10% OADC的瓊脂板上，培養(yǎng)24 d，計數(shù)結(jié)核分枝桿菌菌落量。

1.6 Western blot檢測NLRP3蛋白表達 收集巨噬細胞感染48 h以后的Control+H37Rv組、PCED1B-AS1+H37Rv組、Vector+H37Rv組細胞，在細胞中添加PBS溶液將細胞反復洗滌2次，最后加入RIPA裂解溶液，放在冰上充分裂解20 min，以4 ℃，1000×g離心10 min，將上清轉(zhuǎn)移到新的EP管中，經(jīng)過BCA方法檢測蛋白濃度以后，在蛋白樣品中添加5×Loading Buffer充分混合，用于SDS-PAGE電泳。將玻璃板清洗干凈并組裝，制備10%的SDS-PAGE凝膠，在加樣孔內(nèi)按照每個孔40 μg蛋白添加樣品。把電泳電壓設(shè)置為80 V，觀察溴酚藍前端部分進入到分離膠以后，將電泳儀的電壓設(shè)置為100 V，等到溴酚藍進入到玻璃板的底部以后，關(guān)閉電源，將凝膠取出。根據(jù)需要將NC膜裁剪，然后浸泡在轉(zhuǎn)移緩沖液中備用。轉(zhuǎn)膜的電壓設(shè)置在50 V，轉(zhuǎn)膜裝置放在冰上進行，轉(zhuǎn)膜持續(xù)40 min之后，將電源關(guān)閉。將NC膜浸泡在5%脫脂奶粉中，把非特異性的結(jié)合位點封閉。然后將NC膜放在抗體孵育袋中，然后添加按照1∶1000稀釋以后的NLRP3抗體孵育液，在4 ℃的環(huán)境中結(jié)合過夜。最后將NC膜置于1∶2000稀釋以后的二抗孵育液中，在室溫條件下結(jié)合2 h。ECL方法顯色以后，分析目的蛋白的表達水平。NLRP3蛋白水平=NLRP3條帶灰度值÷GAPDH灰度值。

1.7 NLRP3 siRNA影響PCED1B-AS1的作用檢測 在巨噬細胞中共轉(zhuǎn)染NLRP3 siRNA、pcDNAPCED1B-AS1 和 siRNA Control、pcDNA-PCED1BAS1，然后用H37Rv感染（感染復數(shù)為5），設(shè)置為PCED1B-AS1+si-NLRP3+H37Rv組和PCED1BAS1+si-NC+H37Rv組，按照1.3、1.5、1.6中方法檢測細胞中TNF-α、IL-6 mRNA水平和細胞清除結(jié)核桿菌水平、NLRP3蛋白表達水平。

1.8 統(tǒng)計學處理 實驗重復3次，每組設(shè)置3個復孔。用SPSS 21.0軟件統(tǒng)計分析實驗數(shù)據(jù)，符合正態(tài)分布的定量數(shù)據(jù)用±s表示，2組間的比較用t檢驗，多組間的比較用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 H37Rv感染對巨噬細胞中PCED1B-AS1和TNF-α、IL-6 mRNA表達影響 與Control組比較，Control+H37Rv組巨噬細胞中PCED1B-AS1水平降低，TNF-α、IL-6 mRNA水平升高（P均＜0.05）。詳見表1。

表 1 Control組 和 Control+H37Rv組 中 PCED1B-AS1和 TNF-α、IL-6 mRNA 水平比較（±s）Table 1 Comparison of PCED1B-AS1, TNF-α and IL-6 mRNA levels in Control group and Control+H37Rv group(±s)

表 1 Control組 和 Control+H37Rv組 中 PCED1B-AS1和 TNF-α、IL-6 mRNA 水平比較（±s）Table 1 Comparison of PCED1B-AS1, TNF-α and IL-6 mRNA levels in Control group and Control+H37Rv group(±s)

組別 nPCED1B-AS1 TNF-α mRNA IL-6 mRNA Control組 9 1.00±0.15 1.00±0.11 1.00±0.12 Control+H37Rv 組 9 0.45±0.05 3.84±0.22 2.15±0.16 t值 10.436 34.639 17.250 P值 0.000 0.000 0.000

2.2 pcDNA-PCED1B-AS1對H37Rv感染的巨噬細胞中PCED1B-AS1和TNF-α、IL-6 mRNA表達影響 pcDNA-PCED1B-AS1轉(zhuǎn)染后，PCED1B-AS1表達水平升高。與Control+H37Rv組、Vector+H37Rv組相比，PCED1B-AS1+H37Rv組巨噬細胞中TNF-α、IL-6 mRNA水平明顯升高，差異均具有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05）。詳見表2。上調(diào)PCED1B-AS1促進H37Rv感染的巨噬細胞中TNF-α、IL-6 mRNA 表達。

表2 Control+H37Rv組、Vector+H37Rv組及PCED1BAS1+H37Rv組 中 PCED1B-AS1和 TNF-α、IL-6 mRNA水平比較（±s）Table 2 Comparison of PCED1B-AS1, TNF-α and IL-6 mRNA levels in Control+H37Rv group, Vector+H37Rv group and PCED1B-AS1+H37Rv group(±s)

表2 Control+H37Rv組、Vector+H37Rv組及PCED1BAS1+H37Rv組 中 PCED1B-AS1和 TNF-α、IL-6 mRNA水平比較（±s）Table 2 Comparison of PCED1B-AS1, TNF-α and IL-6 mRNA levels in Control+H37Rv group, Vector+H37Rv group and PCED1B-AS1+H37Rv group(±s)

注：*.與Control+H37Rv組、Vector+H37Rv組相比，P均＜0.05

組別 n PCED1B-AS1 TNF-α mRNA IL-6 mRNA Control+H37Rv 組 9 1.00±0.13 1.00±0.12 1.00±0.12 Vector+H37Rv 組 9 1.00±0.09 1.00±0.10 1.00±0.10 PCED1B-AS1+H37Rv組 9 2.54±0.19* 3.11±0.25* 2.85±0.20*F值 349.336 461.092 478.300 P值 0.000 0.000 0.000

2.3 過表達PCED1B-AS1對巨噬細胞清除結(jié)核分枝桿菌的影響 與Control+H37Rv組、Vector+H37Rv組相比，PCED1B-AS1+H37Rv組巨噬細胞中結(jié)核分枝桿菌菌落量明顯降低，差異均具有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05）。詳見表3。過表達PCED1BAS1促進巨噬細胞清除結(jié)核分枝桿菌。

表3 Control+H37Rv組、Vector+H37Rv組及PCED1BAS1+H37Rv組中結(jié)核分枝桿菌菌落量比較（±s）Table 3 Comparison of Mycobacterium tuberculosis colonies in Control+H37Rv group, Vector+H37Rv group and PCED1B-AS1+H37Rv group(±s)

表3 Control+H37Rv組、Vector+H37Rv組及PCED1BAS1+H37Rv組中結(jié)核分枝桿菌菌落量比較（±s）Table 3 Comparison of Mycobacterium tuberculosis colonies in Control+H37Rv group, Vector+H37Rv group and PCED1B-AS1+H37Rv group(±s)

注：*.與Control+H37Rv組、Vector+H37Rv組相比，P均＜0.05

組別 n 菌落量(×105)(CFU)Control+H37Rv 組 9 3.26±0.25 Vector+H37Rv 組 9 3.34±0.36 PCED1B-AS1+H37Rv 組 9 2.23±0.14*F值 48.877 P值 0.000

2.4 過表達PCED1B-AS1對H37Rv感染的巨噬細胞中NLRP3蛋白表達影響 與Control+H37Rv組、Vector+H37Rv組相比，PCED1B-AS1+H37Rv組巨噬細胞中NLRP3蛋白水平明顯升高，差異均具有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05）。詳見圖1和表4。過表達PCED1B-AS1促進H37Rv感染的巨噬細胞中NLRP3蛋白表達。

圖1 Western blot檢測pcDNA-PCED1B-AS1轉(zhuǎn)染后經(jīng)H37Rv感染的巨噬細胞中NLRP3蛋白表達變化Figure 1 Change of NLRP3 protein expression in H37Rvinfected macrophages after pcDNA-PCED1B-AS1 transfection detected by Western blot detection

表4 Control+H37Rv組、Vector+H37Rv組及PCED1BAS1+H37Rv組中NLRP3 mRNA和蛋白表達水平比較（±s）Table 4 Comparison of NLRP3 mRNA and protein expression levels in Control+H37Rv group, Vector+H37Rv group and PCED1B-AS1+H37Rv group(±s)

表4 Control+H37Rv組、Vector+H37Rv組及PCED1BAS1+H37Rv組中NLRP3 mRNA和蛋白表達水平比較（±s）Table 4 Comparison of NLRP3 mRNA and protein expression levels in Control+H37Rv group, Vector+H37Rv group and PCED1B-AS1+H37Rv group(±s)

注：*.與Control+H37Rv組、Vector+H37Rv組相比，P均＜0.05

組別 n NLRP3 mRNA NLRP3蛋白Control+H37Rv 組 9 1.00±0.10 0.45±0.04 Vector+H37Rv 組 9 0.97±0.09 0.47±0.06 PCED1B-AS1+H37Rv 組 9 3.23±0.03* 0.95±0.09*F值 2387.700 162.677 P值 0.000 0.000

2.5 siRNA NLRP3對過表達PCED1B-AS1影響巨噬細胞清除結(jié)核分枝桿菌以及表達TNF-α、IL-6 mRNA的作用 與PCED1B-AS1+si-NC+H37Rv組比較，PCED1B-AS1+si-NLRP3+H37Rv組巨噬細胞中NLRP3蛋白表達水平降低，NLRP3 mRNA、TNF-α、IL-6 mRNA水平降低，細胞裂解物中結(jié)核分枝桿菌菌落量升高（P均＜0.05），見圖2和表5。siRNA NLRP3減弱過表達的PCED1B-AS1巨噬細胞中TNF-α、IL-6 mRNA表達水平，并且siRNA NLRP3可削弱過表達的PCED1B-AS1巨噬細胞清除結(jié)核分枝桿菌功能。

圖2 pcDNA-PCED1B-AS1以及NLRP3 siRNA轉(zhuǎn)染以后經(jīng)H37Rv感染的巨噬細胞中NLRP3蛋白表達差異Figure 2 Difference of NLRP3 protein expression levels after transfection with pcDNA-PCED1B-AS1 and NLRP3 siRNA in H37Rv-infected macrophages

表5 PCED1B-AS1+si-NC+H37Rv組和PCED1B-AS1+si-NLRP3+H37Rv組中NLRP3 mRNA和蛋白水平、TNF-α、IL-6 mRNA水平和結(jié)核分枝桿菌菌落量比較（±s）Table 5 Comparison of NLRP3 mRNA and protein expression levels, TNF-α, IL-6 mRNA levels and Mycobacterium tuberculosis colonies in PCED1B-AS1+si-NC+H37Rv group and PCED1B-AS1+si-NLRP3+H37Rv group(±s)

表5 PCED1B-AS1+si-NC+H37Rv組和PCED1B-AS1+si-NLRP3+H37Rv組中NLRP3 mRNA和蛋白水平、TNF-α、IL-6 mRNA水平和結(jié)核分枝桿菌菌落量比較（±s）Table 5 Comparison of NLRP3 mRNA and protein expression levels, TNF-α, IL-6 mRNA levels and Mycobacterium tuberculosis colonies in PCED1B-AS1+si-NC+H37Rv group and PCED1B-AS1+si-NLRP3+H37Rv group(±s)

組別 n NLRP3 mRNA NLRP3蛋白 TNF-α mRNA IL-6 mRNA 菌落量(×105)(CFU)PCED1B-AS1+si-NC+H37Rv 組 9 1.00±0.11 0.96±0.11 1.00±0.08 1.00±0.11 2.21±0.20 PCED1B-AS1+si-NLRP3+H37Rv 組 9 0.31±0.03 0.46±0.05 0.64±0.06 0.52±0.05 2.89±0.14 t值 18.155 12.414 10.800 11.918 8.356 P值 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

3 討 論

結(jié)核病是一種十分常見的傳染病，其發(fā)生和結(jié)核分枝桿菌的感染有關(guān)[6]。結(jié)核分枝桿菌誘發(fā)結(jié)核病的過程較為復雜，主要通過寄生在巨噬細胞內(nèi)達到在體內(nèi)長期存在的目的[7]。當機體免疫力較強時，巨噬細胞被活化，分泌大量炎癥因子，促進免疫反應，細胞凋亡增加，結(jié)核分枝桿菌被清除[8]。而當機體免疫力較低時，巨噬細胞免疫反應水平下降，結(jié)核分枝桿菌則長期且大量存在于巨噬細胞內(nèi)[9]。研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)核分枝桿菌促進巨噬細胞中炎癥因子的表達，這些炎癥因子包括TNF-α、IL-6等[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)核分枝桿菌感染的巨噬細胞中TNF-α、IL-6 mRNA表達水平升高，這與上述的研究結(jié)果相符合，說明結(jié)核分枝桿菌誘導巨噬細胞分泌炎癥因子。

LncRNA長度＞200 nt，在人體內(nèi)的多種組織如腦、肝、肺、腎中均有表達，并且對不同類型的細胞分化、衰老、氧化應激、炎癥因子分泌等有調(diào)節(jié)作用[11]。很多研究顯示，lncRNA在人類疾病中發(fā)揮作用，如心肌病、關(guān)節(jié)炎、糖尿病等[12-14]。近些年也有很多實驗發(fā)現(xiàn)lncRNA與結(jié)核病的進展有關(guān)，結(jié)核病患者體內(nèi)有著與健康人差異較大的基因表達譜，而且這些基因多數(shù)被證明與結(jié)核病的惡性進展有關(guān)[15-16]。PCED1B-AS1是近些年發(fā)現(xiàn)的調(diào)控因子，參與腫瘤進展，能夠促進膠質(zhì)瘤、膠質(zhì)母細胞瘤細胞的惡性生物學行為[17-18]。在結(jié)核病患者中發(fā)現(xiàn)PCED1B-AS1異常低表達，敲除PCED1B-AS1可降低巨噬細胞凋亡水平，增加細胞自噬，而上調(diào)PCED1B-AS1則有相反的作用，PCED1B-AS1可能通過促進細胞凋亡發(fā)揮抗肺結(jié)核的作用[5]。本研究發(fā)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌感染以后的巨噬細胞中PCED1B-AS1表達水平下降，并且上調(diào)PCED1B-AS1可加強巨噬細胞對結(jié)核分枝桿菌的清除作用，提高巨噬細胞中TNF-α、IL-6 mRNA的表達水平，這證明PCED1B-AS1可能通過促進巨噬細胞免疫反應和清除結(jié)核分枝桿菌發(fā)揮抗結(jié)核作用。

進一步研究PCED1B-AS1的可能機制，發(fā)現(xiàn)上調(diào)PCED1B-AS1可促進巨噬細胞中NLRP3蛋白表達。NLRP3是NLR蛋白家族成員，被激活后可促進NLRP3炎癥小體作用發(fā)揮[19-21]。NLRP3在慢性阻塞性肺疾病、急性肺損傷、支氣管哮喘等過程中發(fā)揮作用[22-24]。在肺結(jié)核的研究中證實，結(jié)核分枝桿菌能夠激活NLRP3，誘導巨噬細胞抗結(jié)核的免疫反應[25-27]。本研究發(fā)現(xiàn)，下調(diào)NLRP3可以逆轉(zhuǎn)PCED1B-AS1對巨噬細胞分泌炎癥因子和清除結(jié)核分枝桿菌的作用，提示PCED1B-AS1可能通過NLRP3參與巨噬細胞抗結(jié)核過程。

綜上所述，上調(diào)PCED1B-AS1可促進巨噬細胞對結(jié)核分枝桿菌的清除，并且可以誘導巨噬細胞分泌炎癥因子，機制可能與下調(diào)NLRP3有關(guān)，目前對PCED1B-AS1通過何種靶向機制最終影響NLRP3參與巨噬細胞抗結(jié)核分枝桿菌的調(diào)控機制尚不明確，將在后續(xù)的實驗中進行探討。本次實驗為研究PCED1B-AS1在結(jié)核病發(fā)生中的作用和機制提供了參考，為靶向分子治療結(jié)核病提供了可能思路。