羅曉成，曹存巍，麻秋英，磨立達(dá)，羅曉璐

馬爾尼菲籃狀菌（Talaromycemarneffei, TM）是一種溫度依賴的雙相型真菌，在體內(nèi)呈酵母相，易導(dǎo)致血流播散性感染從而引起馬爾尼菲籃狀菌?。╰alaromycosis marneffei, TSM）。該病在東南亞及我國(guó)南方地區(qū)的廣西、廣東兩省呈區(qū)域性流行，多見(jiàn)于免疫力低下的人群，尤其是AIDS患者。據(jù)統(tǒng)計(jì)，廣西有16%的AIDS患者合并TSM，且合并TSM的病死率是所有AIDS并發(fā)癥中最高的[1]，AIDS合并TSM患者的臨床表現(xiàn)無(wú)特異性，約38.1%的患者被誤診為肺結(jié)核并接受了抗結(jié)核治療[2]，因此早期正確診斷具有重要意義。臨床工作中發(fā)現(xiàn)，根據(jù)白細(xì)胞散點(diǎn)圖信息提示，結(jié)合血涂片鏡檢，有助于本病的早期診斷。因此，本研究收集了AIDS合并TSM患者、單純HIV感染者和AIDS合并其他并發(fā)癥患者，分析3類患者的白細(xì)胞散點(diǎn)圖、白細(xì)胞手工分類計(jì)數(shù)、外周血涂片特點(diǎn)及其他實(shí)驗(yàn)室檢查指標(biāo)，尋找早期診斷播散性TM感染的特征，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象 選取2019年3月—2020年6月南寧市第四人民醫(yī)院通過(guò)外周血涂片診斷的27例AIDS合并TSM患者作為AIDS合并TSM組；另隨機(jī)選取同時(shí)期我院收治的80例單純HIV感染者（單純HIV感染組）及27例AIDS合并其他并發(fā)癥（細(xì)菌性肺炎、肺結(jié)核、口腔真菌感染）患者（AIDS合并其他并發(fā)癥組）分別作為對(duì)照。所有患者均經(jīng)過(guò)廣西壯族自治區(qū)疾病預(yù)防控制中心或我院HIV確證實(shí)驗(yàn)室確證為HIV感染。3組的年齡、性別、婚姻狀況、感染途徑比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05），在是否規(guī)律抗病毒治療及治療結(jié)局方面相比，3組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。見(jiàn)表1。該研究通過(guò)南寧市第四人民醫(yī)院倫理委員會(huì)審核并獲得參與者的知情同意。

表1 研究對(duì)象的一般資料[例（%）]Table 1 Baseline date of included patients[cases(%)]

1.2 方法

1.2.1 使用邁瑞B(yǎng)C-6900全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀進(jìn)行血常規(guī)檢測(cè)，得到白細(xì)胞散點(diǎn)圖信息及白細(xì)胞、紅細(xì)胞、血紅蛋白和血小板等參數(shù)。

1.2.2 血涂片制備和染色 參照全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程并結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室操作手冊(cè)進(jìn)行。血涂片要厚薄均勻，頭體尾分明。鏡檢時(shí)先用低倍鏡瀏覽全片，觀察細(xì)胞分布和染色情況，估計(jì)白細(xì)胞、血小板數(shù)量是否與儀器檢驗(yàn)相符，然后選擇體尾交界處，用油鏡鑒定細(xì)胞并進(jìn)行分類，尤其注意涂片尾端、兩側(cè)有無(wú)巨大及異常細(xì)胞。有核紅細(xì)胞數(shù)量通過(guò)鏡檢分類100個(gè)白細(xì)胞時(shí)計(jì)數(shù)所得。并按公式：校正前白細(xì)胞數(shù)/L×[100/（100+有核紅細(xì)胞數(shù)）]=校正后的白細(xì)胞數(shù)/L，對(duì)白細(xì)胞總數(shù)進(jìn)行校正。

1.2.3 白細(xì)胞散點(diǎn)圖分析原理 邁瑞B(yǎng)C-6900全自動(dòng)血液分析儀，使用激光散射結(jié)合熒光染色多維分析技術(shù)，根據(jù)前向散射光（FSC：細(xì)胞體積）、側(cè)向散射光（SSC：細(xì)胞內(nèi)部復(fù)雜程度）、側(cè)向熒光（SFL：細(xì)胞核酸含量）3種信號(hào)在三維立體空間中的分布，產(chǎn)生各種散點(diǎn)圖來(lái)區(qū)分白細(xì)胞各群，同時(shí)可檢出有核紅細(xì)胞、異常細(xì)胞或幼稚細(xì)胞等。正常各細(xì)胞成分在散點(diǎn)圖的分布如圖1A所示，各細(xì)胞團(tuán)粒子間分界清楚。

1.2.4 實(shí)驗(yàn)室檢測(cè) AST、ALT使用日立全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)；1，3-β-D真菌葡聚糖（BDG）檢測(cè)使用廣東省湛江安度斯生物有限公司生產(chǎn)的試劑及LKM動(dòng)態(tài)試管檢測(cè)儀檢測(cè)。CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)采用美國(guó)BD公司FACSCalibur流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.5 血培養(yǎng)鑒定 無(wú)菌采集外周血進(jìn)行血培養(yǎng)，血培養(yǎng)瓶報(bào)陽(yáng)后及時(shí)轉(zhuǎn)種血培養(yǎng)基和2個(gè)沙保羅培養(yǎng)基，分別于25 ℃、35 ℃培養(yǎng)。根據(jù)25 ℃培養(yǎng)2～3 d就產(chǎn)生絨狀的菌絲相菌落，有特征性的紅色色素溶解于培養(yǎng)基中，并經(jīng)棉蘭染色鏡檢，觀察到特異帚狀枝等特性鑒定是否為T(mén)M。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 本研究所有數(shù)據(jù)采用Excel 2007、SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和百分?jǐn)?shù)表示，組間比較用四格表χ2檢驗(yàn)或者R×Cχ2檢驗(yàn)；非正態(tài)分布的計(jì)量資料數(shù)據(jù)使用中位數(shù)和四分位數(shù)[M（P25，P75）]表示，組間比較采用Kruskal-WallisH檢驗(yàn)分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 散點(diǎn)圖結(jié)果 單純HIV感染組（n=80）的散點(diǎn)圖均表現(xiàn)為圖1A（80例）；AIDS合并TSM組（n=27）的白細(xì)胞散點(diǎn)圖表現(xiàn)有圖1B（16例）、圖1C（5例）、圖1D（6例），分別表現(xiàn)為在有核紅細(xì)胞區(qū)域出現(xiàn)散點(diǎn)，有核紅細(xì)胞區(qū)域散點(diǎn)合并幼稚粒細(xì)胞散點(diǎn)，出現(xiàn)有核紅細(xì)胞及細(xì)胞亞群不能區(qū)分的散點(diǎn)；AIDS合并其他并發(fā)癥組（n=27）的散點(diǎn)圖表現(xiàn)有圖1A（18例）、圖1E（9例），圖1E表現(xiàn)為粒細(xì)胞散點(diǎn)稍上移。

圖1 3組白細(xì)胞散點(diǎn)圖A.正常散點(diǎn)圖；B.出現(xiàn)有核紅細(xì)胞的散點(diǎn)圖；C.出現(xiàn)有核紅細(xì)胞及幼稚粒細(xì)胞的散點(diǎn)圖；D.出現(xiàn)有核紅細(xì)胞及細(xì)胞亞群不能分類的散點(diǎn)圖；E.粒細(xì)胞散點(diǎn)稍上移的散點(diǎn)圖Figure 1 White blood cell scatter diagrams in 3 groups

2.2 外周血有核細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果 AIDS合并TSM組的白細(xì)胞分類以中性粒細(xì)胞增多為主，且均出現(xiàn)不同程度的核左移；AIDS合并TSM組在分類時(shí)可見(jiàn)有核紅細(xì)胞8個(gè)/100個(gè)白細(xì)胞～510個(gè)/100個(gè)白細(xì)胞不等，該組有核紅細(xì)胞水平與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 3組白細(xì)胞分類結(jié)果及有核紅細(xì)胞比較[M（P25，P75）]Table 2 Comparison of white blood cell classification and nucleated red blood cells in 3 groups[M(P25, P75)]

2.3 血涂片結(jié)果 AIDS合并TSM組的27例患者均在外周血涂片中見(jiàn)到粒細(xì)胞吞噬1～20個(gè)菌體（見(jiàn)圖2），偶見(jiàn)單核細(xì)胞吞噬。菌體多數(shù)見(jiàn)于細(xì)胞內(nèi)，少部分病例的細(xì)胞外也可見(jiàn)大量散在的菌體。該菌體大小不均，呈類圓形、臘腸形、長(zhǎng)圓形等，部分具有橫膈，胞壁著色欠清晰，胞漿染淡藍(lán)色，有1～2個(gè)紫紅色小核。部分吞噬了菌體的噬菌細(xì)胞體積較大，或在菌體周圍形成較大類圓形空泡，易在低倍鏡下被發(fā)現(xiàn)。血涂片均可見(jiàn)不同程度核左移（出現(xiàn)中、晚幼粒細(xì)胞）、粒細(xì)胞有中毒顆粒、粒細(xì)胞核形畸形等，易見(jiàn)到有核紅細(xì)胞。單純HIV感染組的外周血涂片形態(tài)未見(jiàn)明顯異常。AIDS合并其他并發(fā)癥組的外周血細(xì)胞形態(tài)以核左移、粒細(xì)胞假性Pelger-Huet核多見(jiàn)，少數(shù)有核形畸形表現(xiàn)，未見(jiàn)有核紅細(xì)胞。

圖2 播散性TSM患者的外周血涂片結(jié)果A.散落在細(xì)胞外的TM菌體，有的菌體可見(jiàn)中間的橫膈；B～C.中性粒細(xì)胞吞噬TM菌體和細(xì)胞內(nèi)大的空泡；D.有核紅細(xì)胞，中性粒細(xì)胞吞噬多個(gè)TM菌體Figure 2 Peripheral blood smears findings of patients with disseminated TSM

2.4 其他實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果 3組白細(xì)胞、紅細(xì)胞、血紅蛋白、血小板、AST、ALT、BDG以及CD4+T淋巴細(xì)胞水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。見(jiàn)表3。

表3 3組實(shí)驗(yàn)室結(jié)果比較[M(P25, P75)]Table 3 Comparison of laboratory test results in 3 groups[M(P25, P75)]

2.5 血培養(yǎng)的結(jié)果 AIDS合并TSM組27例患者的血培養(yǎng)均培養(yǎng)出TM。血培養(yǎng)鑒定后報(bào)告陽(yáng)性的時(shí)間最短為4 d，最長(zhǎng)5 d。

3 討 論

AIDS合并TSM病情兇險(xiǎn)，病死率高[3]。有研究表明，AIDS合并TSM患者早期死亡的兩個(gè)獨(dú)立預(yù)測(cè)因子是診斷不及時(shí)和抗真菌治療不及時(shí)[4]。目前TSM的病原學(xué)診斷主要是真菌培養(yǎng)[5]，但真菌培養(yǎng)耗時(shí)長(zhǎng)，無(wú)法滿足臨床快速診斷的需求。PCR技術(shù)、酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)、基因芯片、血清Mp1p抗原檢測(cè)、高通量測(cè)序等，在一定程度上提高了TSM診斷的敏感性和特異性[6-9]，但由于操作步驟繁瑣，對(duì)人員資質(zhì)要求較高及受設(shè)備技術(shù)要求等限制，尚未在臨床中廣泛應(yīng)用。有文獻(xiàn)報(bào)道，在發(fā)生TM血液播散性感染的患者中，可利用血涂片鏡檢，實(shí)現(xiàn)TM感染的快速診斷[10-11]。而如何發(fā)現(xiàn)異常的血涂片，提示檢驗(yàn)醫(yī)師進(jìn)行進(jìn)一步的檢查則未見(jiàn)報(bào)道。

本團(tuán)隊(duì)在工作中觀察到AIDS合并TSM組的白細(xì)胞散點(diǎn)圖均出現(xiàn)異常，進(jìn)而開(kāi)展了相關(guān)研究。結(jié)果顯示，AIDS合并TSM組的白細(xì)胞散點(diǎn)圖均在有核紅細(xì)胞區(qū)域出現(xiàn)異常散點(diǎn)、出現(xiàn)幼稚粒細(xì)胞或細(xì)胞亞群不能區(qū)分等現(xiàn)象。有核紅細(xì)胞與淋巴細(xì)胞大小相似，但核酸含量低，內(nèi)部結(jié)構(gòu)復(fù)雜程度也低，因而散點(diǎn)出現(xiàn)在正常淋巴細(xì)胞下方區(qū)域，呈深藍(lán)色，易于識(shí)別。未成熟粒細(xì)胞因其體積較大，核質(zhì)比高，核酸含量高于成熟粒細(xì)胞，熒光染色強(qiáng)，因此在正常粒細(xì)胞區(qū)域的上方出現(xiàn)。當(dāng)細(xì)胞形態(tài)與結(jié)構(gòu)發(fā)生較大變化時(shí)，儀器不能正確識(shí)別，因而出現(xiàn)粒子團(tuán)間分界不清、細(xì)胞不分類的情況。已明確HIV感染對(duì)骨髓造血功能會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重干擾，粒、紅、巨三系均可發(fā)生病態(tài)造血[12]。故AIDS合并TSM組與AIDS合并其他并發(fā)癥組均可見(jiàn)到多種核形異常的粒細(xì)胞及幼稚粒細(xì)胞。但AIDS合并其他并發(fā)癥組不伴有核紅細(xì)胞出現(xiàn)。涂片鏡檢時(shí)，注意用低倍鏡尋找有無(wú)體積較大的、有空泡的粒細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)可疑情況時(shí)轉(zhuǎn)用油鏡仔細(xì)觀察。觀察到細(xì)胞內(nèi)被吞噬的菌體，對(duì)于排除污染有意義；觀察到菌體中部的橫膈是TM裂殖的特征，也是TM與杜氏利什曼小體、組織胞漿菌等鑒別的重要特征。

有核紅細(xì)胞在骨髓中屬于正常細(xì)胞，但在外周血中屬于不成熟細(xì)胞，即為病理狀態(tài)，常見(jiàn)于溶血性貧血、急性大量失血、血液系統(tǒng)惡性腫瘤、骨髓轉(zhuǎn)移性腫瘤、骨髓纖維化、嚴(yán)重組織缺氧等多種疾病。產(chǎn)生的機(jī)制多與髓血屏障破壞、釋放加速及髓外造血和脾切除術(shù)、缺氧有關(guān)[13-14]。在膿毒血癥、重癥監(jiān)護(hù)等患者群體中，有核紅細(xì)胞在血液中的存在明顯增加了死亡風(fēng)險(xiǎn)，日常有核紅細(xì)胞監(jiān)測(cè)可以作為評(píng)價(jià)危重患者存活、出院結(jié)局預(yù)后、膿毒癥嚴(yán)重程度和死亡風(fēng)險(xiǎn)的指標(biāo)。在本研究中，出現(xiàn)了有核紅細(xì)胞的AIDS合并TSM組死亡患者比例明顯高于另外2組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。有文獻(xiàn)報(bào)道，TM感染發(fā)熱患者中，有部分患者出現(xiàn)呼吸困難且均為Ⅰ型呼吸衰竭伴低氧血癥[2]。有核紅細(xì)胞在AIDS合并TSM患者外周血中大量出現(xiàn)，推測(cè)與嚴(yán)重感染、低氧血癥有關(guān)。

研究發(fā)現(xiàn)播散性TSM好發(fā)于CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)＜50個(gè)/μl的AIDS患者[16]，與本研究結(jié)果相似。同時(shí)本研究結(jié)果顯示：AIDS合并TSM組的血小板、CD4+T淋巴細(xì)胞水平明顯降低，中性粒細(xì)胞比例、AST及BDG水平明顯升高，提示中性粒細(xì)胞比例、CD4+T淋巴細(xì)胞、血小板、AST、BDG可作為AIDS合并TSM的觀察指標(biāo)。

綜上所述，AIDS患者血常規(guī)出現(xiàn)血小板水平明顯降低、中性粒細(xì)胞水平明顯增高，散點(diǎn)圖出現(xiàn)有核紅細(xì)胞提示時(shí)，應(yīng)盡早涂片鏡檢尋找有無(wú)TM。此方法簡(jiǎn)單快速、損傷小，易操作，易推廣。