葉必成，繆夏曄，劉樹(shù)青

1徐州醫(yī)科大附屬淮安醫(yī)院消化內(nèi)科，江蘇淮安223001；2揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院

肝癌全球發(fā)病率在惡性腫瘤中居第六位，是腫瘤相關(guān)死亡的第四大原因［1］。肝細(xì)胞癌（HCC）是最常見(jiàn)的原發(fā)性肝癌，早期HCC患者的主要治療手段為外科手術(shù)切除，然而大部分患者在診斷時(shí)已為晚期，其對(duì)應(yīng)的治療手段非常局限，因此預(yù)后極差。對(duì)于HCC患者預(yù)后的預(yù)測(cè)及治療方案的確定，臨床通常用AJCC分期、肝功能指標(biāo)及AFP進(jìn)行評(píng)估［2-3］，然而相同分期的HCC患者預(yù)后也可能不同，且分子遺傳學(xué)也證明不同亞群的HCC患者預(yù)后有差異［4］。因此，有必要探尋一種新型的生物學(xué)標(biāo)志物以有效評(píng)估HCC患者預(yù)后。CTL作為T(mén)細(xì)胞的重要組成部分，其表面受體主要為CD8，是抵抗腫瘤進(jìn)展的主要免疫細(xì)胞［5］。先前一項(xiàng)研究通過(guò)規(guī)律間隔成簇短回文重復(fù)序列在小鼠癌細(xì)胞株（腎癌、乳腺癌、黑色素細(xì)胞瘤、結(jié)直腸癌）中確定了182個(gè)與CTL相關(guān)的基因（CRG），CRG增強(qiáng)或減弱了CTL對(duì)癌細(xì)胞的殺傷［6］。然而，CRG在HCC中的作用尚未被系統(tǒng)研究。本研究旨在觀察CRG在HCC的表達(dá)情況以及探索其與預(yù)后的關(guān)系，并基于這些基因構(gòu)建預(yù)后預(yù)測(cè)模型，以期有助于評(píng)估患者預(yù)后及臨床精準(zhǔn)化治療。

1 資料與方法

1.1 資料來(lái)源 從TCGA（https：//portal.gdc.cancer.gov/repository）下載371例HCC患者共424個(gè)樣本（包含50個(gè)癌旁樣本）的資料，其中3例HCC組織重復(fù)測(cè)序2次。下載時(shí)間：2017年6月—2021年1月。排除生存時(shí)間為0患者6例，共納入HCC患者365例?；颊吣?46例、女119例；年齡16～90歲，中位年齡61歲；腫瘤分級(jí)G1級(jí)55例、G2級(jí)175例、G3級(jí)118例、G4級(jí)12例、未知5例；腫瘤分期Ⅰ期170例、Ⅱ期84例、Ⅲ期83例、Ⅳ期4例、未知24例；存在血管浸潤(rùn)106例、無(wú)血管浸潤(rùn)205例、未知54例；AFP≤200 ng/mL 201例、AFP＞200 ng/mL 75例、AFP未知89例。

從ICGC（https：//dcc.icgc.org/projects/LIRI-JP）下載231例HCC患者的RNA-seq數(shù)據(jù)和臨床資料，用作模型驗(yàn)證。下載時(shí)間：2019年3月—2021年1月。該隊(duì)列患者未存在重復(fù)測(cè)序以及生存資料缺失，既往有乙型肝炎或丙型肝炎病史?；颊吣?70例、女61例；年齡31～89歲，中位年齡69歲；腫瘤分期Ⅰ期36例、Ⅱ期105例、Ⅲ期71例、Ⅳ期19例。對(duì)于重復(fù)測(cè)序的HCC組織，取其基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)的平均值。若有多個(gè)探針對(duì)應(yīng)同一個(gè)基因，則該基因的表達(dá)量為這些探針的均值。以上數(shù)據(jù)均為公開(kāi)數(shù)據(jù)。

1.2 差異表達(dá)CRG的篩選 應(yīng)用“base”R軟件包中的“wilcox.test”函數(shù)對(duì)371例HCC組織和50例癌旁組織的CRG進(jìn)行表達(dá)差異分析，篩選標(biāo)準(zhǔn)：錯(cuò)誤發(fā) 現(xiàn) 率（FDR）＜0.05且|log2Fold Change|≥1，F(xiàn)oldChange為差異倍數(shù)。

1.3 與總生存期（OS）相關(guān)CRG的篩選 將具有生存信息的365例HCC患者與各個(gè)CRG的表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行合并，并用“base”R軟件包中的“coxph”函數(shù)對(duì)CRG進(jìn)行基于OS以及生存狀態(tài)的單因素回歸分析，計(jì)算各個(gè)CRG的P值以及風(fēng)險(xiǎn)比（HR），P＜0.05為與OS相關(guān)CRG。

1.4 預(yù)后預(yù)測(cè)模型的構(gòu)建與驗(yàn)證 利用R軟件“base”包中的“intersect”函數(shù)確定既為差異表達(dá)又與OS相關(guān)的CRG，并使用“glmnet”R軟件包中的“glmnet”函數(shù)和“cv.glmnet”函數(shù)對(duì)這些基因進(jìn)行基于OS以及生存狀態(tài)的Lasso-Cox回歸分析，其中maxit=1 000。計(jì)算經(jīng)Lasso-Cox回歸所確定的各個(gè)基因的系數(shù)，并乘以這些基因?qū)?yīng)的表達(dá)水平，所得結(jié)果之和為風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分。以風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的中位數(shù)為截?cái)嘀?，將TCGA隊(duì)列以及ICGC隊(duì)列的患者分為高危組和低危組。利用“survival”包的“survdiff”對(duì)高、低危組患者進(jìn)行基于Kaplan-Meier法的生存分析，并進(jìn)行Log-rank檢驗(yàn)評(píng)估兩組的預(yù)后差異。利用“Rtsne”的“prcomp”和“Rtsne”函數(shù)對(duì)Lasso-Cox回歸所確定的基因進(jìn)行PCA及t-SNE分析，以探索高、低危組患者分布情況。利用“timeROC”R軟件包的“timeROC”函數(shù)進(jìn)行時(shí)間相關(guān)的ROC曲線分析，計(jì)算曲線下面積（AUC）。

1.5 基因本體（GO）富集分析、京都基因與基因組百科全書(shū)（KEGG）富集分析及單樣本基因集富集分析（ssGSEA） 利用“clusterProfiler”R軟件包的“enrichGO”函數(shù)以及“enrichKEGG”函數(shù)對(duì)TCGA隊(duì)列的高、低危組之間的差異表達(dá)基因進(jìn)行GO以及KEGG富集分析，其中GO富集分析包括生物學(xué)過(guò)程（BP）、細(xì)胞組成（CC）以及分子功能（MF）。利用“gsva”R軟件包的“gsva”函數(shù)對(duì)TCGA隊(duì)列的高、低危組進(jìn)行ssGSEA，以量化免疫細(xì)胞浸潤(rùn)及免疫相關(guān)功能激活情況。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用R4.0.2軟件。差異表達(dá)基因（DEG）的鑒定采用Wilcoxon檢驗(yàn)，并用BH法對(duì)P值進(jìn)行矯正，篩選標(biāo)準(zhǔn)為FDR＜0.05且|log2 Fold Change|≥1。如上文無(wú)特殊規(guī)定，則P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 與OS相關(guān)的差異表達(dá)CRG 共篩選出37個(gè)與OS相關(guān)的差異表達(dá)DRG。見(jiàn)圖1。

圖1 與OS相關(guān)差異表達(dá)CRG的篩選

2.2 基于TCGA隊(duì)列建立預(yù)后模型 Lasso-Cox回歸將上述37個(gè)DRG進(jìn)行再次篩選，并使用交叉驗(yàn)證建立模型，最終建立了基于6個(gè)CRG（ATG10、HDAC1、PIGU、AHSA1、CAD、CEP55）的預(yù)后預(yù)測(cè)模型，其風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的計(jì)算公式為0.384×ATG10表達(dá)值+0.076×HDAC1表 達(dá)值+0.270×PIGU 表 達(dá) 值+0.153×AHSA1表達(dá)值+0.208×CAD表達(dá)值+0.169×CEP55表達(dá)值。

2.3 預(yù)后預(yù)測(cè)模型的外部驗(yàn)證結(jié)果 上述公式計(jì)算ICGC隊(duì)列的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分，并以風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的中位數(shù)作為截?cái)嘀祵CGC隊(duì)列的患者分為高危組和低危組?？紤]到OS超過(guò)5年的患者僅2例，因此僅評(píng)估該模型對(duì)患者術(shù)后1～4年生存率的預(yù)測(cè)價(jià)值。ROC曲線顯示，該模型對(duì)患者術(shù)后1～4年預(yù)后預(yù)測(cè)的曲線下面積分別為0.70、0.70、0.74、0.74。

2.4 GO富集分析、KEGG富集分析及ssGSEA結(jié)果

2.4.1 GO富集分析結(jié)果 差異表達(dá)的DRG在淋巴細(xì)胞介導(dǎo)免疫、補(bǔ)體激活、細(xì)胞吞噬、離子通道活性相關(guān)分子功能等生物學(xué)過(guò)程富集。見(jiàn)表1。

表1 GO富集分析結(jié)果（BP、CC及MF的前5位）

2.4.2 KEGG富集分析結(jié)果 差異表達(dá)的DRG基因在細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體的相互作用、細(xì)胞周期及部分癌癥通路顯著富集。見(jiàn)表2。

表2 KEGG富集分析（前10位）

2.4.3 ssGSEA結(jié)果 高危組活化的樹(shù)突細(xì)胞（aDC）、未成熟的樹(shù)突細(xì)胞（iDC）、漿細(xì)胞樣樹(shù)突細(xì)胞（pDC）、抗原提呈細(xì)胞共刺激（APC co-stimulation）、主要組織相容性復(fù)合體Ⅰ型分子（MHC class I）富集評(píng)分（0.62、0.61、0.72、0.98分）高于低危組（中位數(shù)分別為0.60、0.60、0.68、0.97分），比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）；高危組Ⅰ型干擾素反應(yīng)（Type I IFN Reponse）、Ⅱ型干擾素反應(yīng)（TypeⅡIFN Reponse）、NK細(xì)胞富集評(píng)分（0.82、0.77、0.60分）較低危組（0.83、0.80、0.62分）低，高危組調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）富集評(píng)分（0.81分）較低危組（0.80分）高（P＜0.05），比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

3 討論

越來(lái)越多的證據(jù)表明，腫瘤微環(huán)境是影響腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要因素［7］。腫瘤微環(huán)境主要由癌細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞、免疫細(xì)胞、趨化因子和細(xì)胞因子共同構(gòu)成［8］，其中CTL是抵抗腫瘤進(jìn)展的主要免疫效應(yīng)細(xì)胞。然而，由于癌細(xì)胞不具有很強(qiáng)的免疫原性，因此CTL在腫瘤微環(huán)境中是被抑制的［9］。目前已開(kāi)發(fā)了諸如免疫檢查點(diǎn)抑制劑（PD-1、PDL-1和CTLA4）等免疫療法用于促進(jìn)CTL特異性免疫應(yīng)答，然而對(duì)于HCC患者，PD-1及PDL-1的有效應(yīng)答率卻不到20%［10］。因此識(shí)別HCC中影響CTL功能的關(guān)鍵基因至關(guān)重要。本研究綜合分析182個(gè)CRG，最終篩選了6個(gè)與OS顯著相關(guān)的關(guān)鍵CRG，并基于CRG構(gòu)建了HCC預(yù)后預(yù)測(cè)模型。該模型對(duì)患者術(shù)后1～4年預(yù)后預(yù)測(cè)的曲線下面積均≥0.70。提示該模型具有良好的預(yù)測(cè)效能。

本研究發(fā)現(xiàn)，近30%的CRG在腫瘤組織與癌旁組織之間差異表達(dá)，單因素Cox回歸分析表明超過(guò)50%的CRG與OS相關(guān)，這進(jìn)一步證明了CTL在HCC發(fā)生發(fā)展中起重要作用。最終篩選出6個(gè)與預(yù)后相關(guān)的關(guān)鍵CRG，即ATG10、HDAC1、PIGU、AHSA1、CAD、CEP55。除AHSA1和CAD以外，均存在相關(guān)研究報(bào)道，這些基因在HCC中高表達(dá)，并且與OS相關(guān)，與本研究的發(fā)現(xiàn)一致。ATG10，位于5q14.1，是細(xì)胞自噬啟動(dòng)的必要條件［11］。JO等［12］報(bào)道ATG10表達(dá)增加與血管侵襲和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。HDAC1是組蛋白去乙?；讣易宄蓡T之一，直接參與調(diào)控細(xì)胞自噬［13］。HDAC1的高表達(dá)促進(jìn)了HCC細(xì)胞增殖并抑制HCC細(xì)胞凋亡［14］。PIGU是GPI-T復(fù)合物的一個(gè)重要亞基［15］，GPI-T復(fù)合物在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起至關(guān)重要的作用。WEI等［16］的研究發(fā)現(xiàn)，PIGU高表達(dá)不但促進(jìn)了HCC細(xì)胞的增殖，遷移和侵襲，而且抑制了細(xì)胞凋亡。此外，他們還發(fā)現(xiàn)，PIGU的下調(diào)顯著增強(qiáng)了NK-92細(xì)胞對(duì)HCC細(xì)胞的敏感性。AHSA1為HSP90的一個(gè)關(guān)鍵分子伴侶，參與致癌蛋白的成熟、穩(wěn)定、激活［17］，其與HSP90構(gòu)成的復(fù)合體也被證實(shí)是細(xì)胞自噬通路的關(guān)鍵蛋白［18］。本研究首次發(fā)現(xiàn)，AHSA1在HCC中高表達(dá)，并且與OS顯著相關(guān)，其在HCC的具體生物學(xué)作用尚未明確，我們將進(jìn)一步研究證實(shí)。CAD是一個(gè)具有三個(gè)酶結(jié)構(gòu)域的多肽，包括氨基甲?；姿岷铣擅浮⑻於彼徂D(zhuǎn)氨甲酰酶及二氫乳清酸酶，為嘧啶從頭合成的關(guān)鍵酶［19］。CAD與腫瘤相關(guān)的報(bào)道較少，本研究首次發(fā)現(xiàn)，CAD在HCC中高表達(dá)，并且與OS相關(guān)。CEP55，又名C10orf3，為中心體蛋白相關(guān)蛋白家族成員，其主要生物學(xué)功能為中心體復(fù)制、細(xì)胞周期及胞質(zhì)分裂［20］。自噬蛋白 NBR1通過(guò)識(shí)別 CEP55，進(jìn)而招募自噬相關(guān)蛋白形成自噬體。LI等［21］發(fā)現(xiàn)，CEP55通過(guò)調(diào)節(jié)JAK2-STAT3-MMPs信號(hào)通路來(lái)促進(jìn)HCC細(xì)胞遷移和侵襲。除PIGU和CAD以外，以上基因均有報(bào)道證明直接或間接參與細(xì)胞自噬，細(xì)胞自噬有助于癌細(xì)胞逃避CTL的攻擊［6］。本研究進(jìn)一步證實(shí)，在HCC中細(xì)胞自噬通路介導(dǎo)CTL相關(guān)免疫逃避的關(guān)鍵性，也揭示了細(xì)胞自噬在HCC在發(fā)生發(fā)展中起重要作用。然而，對(duì)以上CRG在HCC中作用的了解仍然有限，其影響HCC預(yù)后的分子機(jī)制以及對(duì)HCC患者臨床治療的意義有待進(jìn)一步研究。

為進(jìn)一步探索高危組患者預(yù)后差的潛在機(jī)制，本研究基于TCGA隊(duì)列的高、低危組進(jìn)行了GO富集分析、KEGG富集分析及ssGSEA。本研究發(fā)現(xiàn)，免疫相關(guān)通路、離子通道以及一些癌癥通路顯著富集。研究證明離子通道在T細(xì)胞的穩(wěn)定與活化發(fā)揮重要作用［22］，這與本研究的發(fā)現(xiàn)一致。低危組和高危組的抗原提呈相關(guān)細(xì)胞及功能的富集得分存在顯著差異，表明腫瘤相關(guān)抗原在高危組更容易識(shí)別，但高危組患者預(yù)后更差，可能是與高危組的CTL功能下降有關(guān)。高危組的Tregs富集得分相對(duì)于低危組更高。Tregs顯著抑制CTL的功能，進(jìn)一步證明了高危組的CTL功能被抑制。高危組的Ⅰ型干擾素反應(yīng)、Ⅱ型干擾素反應(yīng)及NK細(xì)胞富集得分較低危組低。因此，高危組患者抗腫瘤免疫力的減弱是其預(yù)后不良的主要因素。

綜上所述，本研究構(gòu)建的模型可有效預(yù)測(cè)HCC患者預(yù)后，有助于HCC患者預(yù)后預(yù)測(cè)體系的完善及臨床個(gè)體化治療方案的開(kāi)發(fā)。