姜姣姣，汪正翔，朱亞寧，董雄軍

蕪湖市第二人民醫(yī)院腎臟內(nèi)科，安徽蕪湖241000

腎病綜合征是較常見的一種臨床綜合征，主要由多種原因?qū)е碌哪I小球基底膜通透性增加，造成大量血漿白蛋白從尿液中流失，進(jìn)而導(dǎo)致機(jī)體發(fā)生一系列病理生理改變的疾?。?］。該病的主要臨床特征為水腫、大量蛋白尿、高脂血癥、低蛋白血癥等，隨著病情的發(fā)展，可導(dǎo)致各種并發(fā)癥如急性腎功能衰竭等，給患者的生命健康造成重大影響［2］。然而，目前對(duì)腎病綜合征病因和發(fā)病機(jī)制尚未完全明確。微小RNA（miRNA）是廣泛存在于生物體內(nèi)的一種非編碼小RNA，經(jīng)轉(zhuǎn)錄后可調(diào)控基因的表達(dá)，且在細(xì)胞增殖、分化、凋亡等多種生物學(xué)過程中發(fā)揮重要作用［3-4］。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，多種miRNA在腎病綜合征的發(fā)生及發(fā)展中發(fā)揮重要作用。然而，有關(guān)微小RNA-21（miR-21）對(duì)腎病綜合征的影響尚不清楚?；诖?，本研究擬通過檢測(cè)腎病綜合征患者血清miR-21的表達(dá)，探究其在腎病綜合征中的作用，以期為臨床診治腎病綜合征提供參考。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2018年5月—2020年3月在本院腎病內(nèi)科確診并治療的腎病綜合征患者150例為腎病綜合征組。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合2008年出版的《內(nèi)科學(xué)》中有關(guān)腎病綜合征的相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)［5］，并經(jīng)病理檢查確診；入院前未接受其他藥物治療；臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：狼瘡性腎炎、乙肝病毒相關(guān)性腎炎、銀屑病相關(guān)腎炎等繼發(fā)性腎病綜合征；嚴(yán)重內(nèi)分泌疾病；嚴(yán)重心肝等功能障礙；感染性疾病。150例患者中，男84例，女 66例；年齡18～75（42.83 ±5.27）歲；體質(zhì)量指數(shù)（BMI）21.83～22.49 kg/m2。同期選取在本院進(jìn)行常規(guī)體檢的健康志愿者150例作為對(duì)照組，男79例，女 71例；年齡17～76（43.11 ±5.23）歲；BMI 21.25～22.38 kg/m2。兩組臨床資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。該研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)；患者及家屬簽署知情同意書。

1.2 樣品采集及保存 于清晨采集兩組空腹靜脈血5 mL，用JIDI-16R型離心機(jī)（廣州吉迪儀器有限公司）以3 000 r/min離心15 min（離心半徑8 cm），收集上層血清，置于-20℃冰箱保存待測(cè)。

1.3 腎功能指標(biāo)檢測(cè) 用全自動(dòng)生化儀檢測(cè)兩組血尿素氮、血肌酐及尿酸水平。

1.4 血清miR-21表達(dá)檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）法。取出待測(cè)血清，按照RNA提取試劑盒說明書步驟提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄得cDNA。RNA提取試劑盒購于北京甘棠飛華生物科技有限公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購于上海伯易生物科技有限公司。以上述逆轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板，進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)，V115896實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購于美國Applied Biosystems公司。PCR反應(yīng)體系20 μL。反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，60 ℃ 35 s，72℃20 s，共35個(gè)循環(huán)。miR-21及U6引物均由蘇州鴻訊生物科技有限公司合成。miR-21正向引物5'-GTTAGCTTATCAGACTGA-3'，反向引物 5'-GTGCAGGGTCCGAGGTAT-3'；U6 正 向 引 物 5'-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3'，反 向 引 物 5'-GGAACGCTTCACGAATTTA-3'。 采 用 2-ΔΔCT法 計(jì) 算血清miR-21相對(duì)表達(dá)量。

1.5 血清TGF-β1、IL-18檢測(cè) 采用ELISA法檢測(cè)血清TGF-β1、IL-18（ELISA試劑盒購于上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司）。步驟：將已配制好的100μL標(biāo)準(zhǔn)樣品分別加入標(biāo)準(zhǔn)孔和空白孔，于37℃溫育30 min后洗滌。將酶標(biāo)板內(nèi)液體棄去，拍干后加入酶標(biāo)試劑，再37℃溫育30 min，洗滌后加入顯色劑并混合均勻，使其進(jìn)行顯色。最后加入終止液，用酶標(biāo)儀測(cè)定其吸光度（OD值），然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品濃度和OD值畫出標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用Curve Expert軟件制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算TGF-β1、IL-18濃度。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以xˉ±s表示，比較采用t檢驗(yàn)；用Pearson相關(guān)分析法分析腎病綜合征患者血清miR-21與TGF-β1、IL-18的相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)（r）0.1～0.3為弱相關(guān)，0.3～0.5為中等相關(guān)，0.5～1.0為強(qiáng)相關(guān)；用受試者工作特征（ROC）曲線評(píng)估血清miR-21對(duì)腎病綜合征的診斷價(jià)值；用Logistic回歸分析腎病綜合征發(fā)生的影響因素。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組腎功能指標(biāo)比較 與對(duì)照組比較，腎病綜合征組血尿素氮、血肌酐、尿酸水平高（P均＜0.05）。見表1。

表1 兩組腎功能指標(biāo)比較（μmol/L，±s）

組別腎病綜合征組對(duì)照組t P n 150 150血尿素氮20.35±2.13 4.14±1.12 82.497＜0.05血肌酐326.48±32.16 38.72± 6.81 107.21＜0.05尿酸315.42±73.41 279.47±60.52 4.628＜0.05

2.2 兩組miR-21、TGF-β1、IL-18比較 與對(duì)照組比較，腎病綜合征組miR-21及TGF-β1、IL-18水平高（P均＜0.05）。見表2。

表2 兩組miR-21、TGF-β1、IL-18比較（-x± s）

2.3 腎病綜合征患者血清miR-21與TGF-β1、IL-18表達(dá)的相關(guān)性 Pearson法分析結(jié)果顯示，腎病綜合征患者血清miR-21與細(xì)胞因子TGF-β1、IL-18表達(dá)均呈正相關(guān)（r分別為0.418、0.452，P均＜0.05）。

2.4 血清miR-21對(duì)腎病綜合征的診斷價(jià)值 血清miR-21診斷腎病綜合征的曲線下面積為0.852（95%CI：0.809～0.894），最佳截?cái)嘀禐?.91，此時(shí)對(duì)應(yīng)靈敏度和特異度分別為77.3%、78.7%。

2.5 腎病綜合征發(fā)病的影響因素 以腎病綜合征是否發(fā)生為因變量（0=否，1=是），血清miR-21、血尿素氮、血肌酐及尿酸為自變量，采用Logistic回歸分析，結(jié)果顯示：血清 miR-21（OR=3.652，95%CI：1.684～7.921，P＜0.05）、血尿素氮（OR=2.869，95%CI：1.395～5.902，P＜0.05）、血 肌 酐（OR=2.928，95%CI：1.592～5.386，P＜0.05）是腎病綜合征發(fā)生的影響因素。見表3。

表3 腎病綜合征發(fā)生的危險(xiǎn)因素分析

3 討論

腎病綜合征是慢性腎臟病中的常見類型，研究顯示該疾病約占腎活檢病例的40%，具有發(fā)病率高、病情復(fù)雜、患者預(yù)后差等特點(diǎn)。腎病綜合征的典型特征為大量蛋白尿、高脂血癥和低蛋白血癥，而患者大量蛋白尿長期得不到有效控制，可導(dǎo)致發(fā)展為終末期腎?。?］。流行病學(xué)研究顯示，近年來隨著環(huán)境、生活方式的變化及人口老齡化問題越來越嚴(yán)重，腎病綜合征呈逐年增加的趨勢(shì)，嚴(yán)重危害患者的健康，且給患者家庭生活帶來很大影響。然而，目前對(duì)該疾病的發(fā)病機(jī)制并不完全明確。因此，對(duì)腎病綜合征進(jìn)行深入研究，以尋找有效的疾病標(biāo)志物，對(duì)早期診斷和治療具有重要臨床意義。

miRNA是一類廣泛存在于真核生物中的長度為19～25 nt的單鏈非編碼小分子RNA，它能以特定方式抑制蛋白質(zhì)合成，誘發(fā)RNA降解，調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，并參與機(jī)體多種生物學(xué)過程［7］。大量研究已證實(shí)，miRNA在多種疾病如癌癥、心血管疾病及腎臟疾病的發(fā)生及發(fā)展中發(fā)揮重要作用［8］。朱媛媛等［9］研究發(fā)現(xiàn)，miR-150在兒童腎病綜合征患者血清中表達(dá)水平顯著升高，且與患兒腎功能損傷、血脂指標(biāo)密切相關(guān)。駱峻等［10］研究發(fā)現(xiàn)，腎病綜合征患兒腎組織中miR-191表達(dá)水平升高，miR-151-3p表達(dá)水平降低，且其表達(dá)水平與臨床血清指標(biāo)肌酐、總膽固醇等密切相關(guān)。以上研究表明miRNA在腎病綜合征患者中異常表達(dá)，與腎病綜合征的發(fā)生有關(guān)。miR-21是較早發(fā)現(xiàn)的一種在人體細(xì)胞及組織中廣泛存在的miRNA，位于17q23.2染色體的FRA17B脆性區(qū)域上，并具有自主轉(zhuǎn)錄單位。研究證實(shí)，miR-21與多種疾病發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［11］。鐘開義等［12］研究發(fā)現(xiàn)，miR-21在急性腎損傷患者血清中表達(dá)水平升高，且其表達(dá)水平與患者病情嚴(yán)重程度相關(guān)。王雪艷等［13］研究發(fā)現(xiàn)，miR-21是多種腎臟病變的調(diào)節(jié)因子，在慢性腎臟病、多囊腎、急性腎損傷、腎性腫瘤、糖尿病腎病中表達(dá)水平升高，因此下調(diào)miR-21的表達(dá)可作為一種潛在的治療策略。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，腎病綜合征組血清miR-21表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組，提示血清miR-21可能參與腎病綜合征的發(fā)展進(jìn)程。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，多種疾病的發(fā)生發(fā)展與機(jī)體內(nèi)各種細(xì)胞因子的異常變化密切相關(guān)。TGF-β1是機(jī)體內(nèi)一種較常見的細(xì)胞因子，可調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化，參與炎癥反應(yīng)，并可導(dǎo)致多臟器官纖維化［14］。IL-18是IL家族的重要成員之一，是一種重要的內(nèi)環(huán)境調(diào)節(jié)因子，可參與炎癥反應(yīng)及免疫應(yīng)答等［15］。程力平等［16］研究發(fā)現(xiàn)，兒童原發(fā)性腎病綜合征患兒血清TGF-β1和IL-18 mRNA水平升高，且活動(dòng)期患兒二者水平均高于緩解期，監(jiān)測(cè)兩者水平有助于鑒別疾病類型。本研究發(fā)現(xiàn)，腎病綜合征組血清細(xì)胞因子TGF-β1、IL-18水平均顯著高于對(duì)照組，提示血清細(xì)胞因子TGF-β1、IL-18可能參與腎病綜合征的發(fā)展進(jìn)程。且腎病綜合征患者血清miR-21與細(xì)胞因子TGF-β1、IL-18表達(dá)均呈正相關(guān)，提示二者可能參與調(diào)控腎病綜合征的發(fā)生發(fā)展。另外，該研究中ROC曲線分析表明，血清miR-21診斷腎病綜合征的曲線下面積為0.852，提示血清miR-21可作為評(píng)估腎病綜合征發(fā)生的指標(biāo)。Logistic回歸分析結(jié)果顯示，血清miR-21、血尿素氮、血肌酐是腎病綜合征發(fā)生的影響因素。提示監(jiān)測(cè)三者水平，對(duì)臨床評(píng)估腎病綜合征發(fā)生有一定價(jià)值。

綜上所述，miR-21在腎病綜合征患者血清中表達(dá)明顯升高，且與疾病發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，具有一定的診斷價(jià)值，提示血清miR-21可作為腎病綜合征早期診斷及病情評(píng)估的潛在生物學(xué)指標(biāo)。但對(duì)其具體的作用機(jī)制尚未完全清晰，有待深入研究。