胡居吾

（江西省科學(xué)院應(yīng)用化學(xué)研究所，江西南昌 330096）

高尿酸血癥（Hyperuricemia，HUA）是指在正常嘌呤飲食狀況下，血液中尿酸（Uric Acid，UA）含量異常升高的異質(zhì)性疾病。流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，HUA與痛風(fēng)、高血壓、高血脂、動(dòng)脈硬化、冠心病、糖尿病、肥胖癥等疾病密切相關(guān)。

蔓三七（Gynura procumbens (Lour.) Merr.），又名平臥菊三七，是菊科（Compositae）千里光族（Senecioneae-Cass）菊三七屬（GynuraCass），多年生草本藥食兩用植物，分布于我國廣東、海南、貴州、云南等地，越南、泰國、印度尼西亞和非洲也有分布，具有清熱解毒、止血止咳、活血通絡(luò)、提高人體免疫力和抗病毒能力、補(bǔ)鈣、抗感冒、降三高、提高免疫力等功效[1]，是一種無毒級(jí)的藥食兼可的植物。有研究表明，蔓三七具有抗高尿酸作用[2]，但沒有文獻(xiàn)報(bào)道，蔓三七對(duì)急性高尿酸血癥是否具有治療效果。

本文選擇腹腔注射氧嗪酸鉀，建立一個(gè)穩(wěn)定可靠的小鼠急性高尿酸血癥模型，考察蔓三七提取物對(duì)急性高尿酸血癥的影響，通過測(cè)定血清中尿酸值的變化來評(píng)價(jià)蔓三七提取物對(duì)急性高尿酸血癥的治療情況。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級(jí)KM 小鼠100 只，雄性，體重18～22 g（合格證號(hào)：0002448），由江西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技中心提供[生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（贛）2018-0003]。動(dòng)物飼養(yǎng)于江西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技中心屏障系統(tǒng)動(dòng)物房（使用許可證號(hào)：SYXK（贛）2017-0004）。每籠5 只，食水自取。

動(dòng)物房溫度21～24 ℃；相對(duì)濕度55%～62%。任何疑似非健康小鼠在試驗(yàn)前均已剔除。

1.2 藥品與試劑

氧嗪酸鉀：上海凜恩科技發(fā)展有限公司，批號(hào)RH206114，用生理鹽水配制成300 mg/kg、600 mg/kg。別嘌醇：爵葉生物，98%，批號(hào)X27J10Y9，用0.5%羧甲基纖維素鈉稀釋。羧甲基纖維素鈉：索萊寶生物科技有限公司，化學(xué)純。

1.3 主要儀器

尿酸試劑盒：南京建成生物工程研究所公司，批號(hào)C012-2-1；3001 型號(hào)酶標(biāo)儀：上海賽默飛世爾公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 蔓三七提取物制備

蔓三七干葉10 kg，加入65%乙醇200 kg，用檸檬酸調(diào)節(jié)提取液pH=3.0，提取1.5 h 后過濾，再加入65%乙醇200 kg，用檸檬酸調(diào)節(jié)提取液pH=3.0，提取時(shí)間為1.0 h，合并兩次提取液，回收乙醇，濃縮液進(jìn)行噴霧干燥（進(jìn)風(fēng)溫度120 ℃，出風(fēng)溫度82 ℃），得蔓三七提取物（MSQ）。

1.4.2 MSQ 制劑

分別按照10 倍、20 倍成人日推薦劑量（3 g/50 kg 人體質(zhì)量）配制為低高劑量，用0.5%羧甲基纖維素鈉稀釋。

1.4.3 模型建立

按1 mL/100 g 的劑量將氧嗪酸鉀進(jìn)行小鼠腹腔注射，構(gòu)建高尿酸血癥（HUA）模型。如果SUA 水平明顯升高，即表明模型復(fù)制成功。

1.4.3.1 造模時(shí)間及造模劑量的摸索

60 只雄性KM 小鼠，隨機(jī)分為5 組，每組12 只。各組動(dòng)物腹腔注射300 mg/kg、400 mg/kg、450 mg/kg、500 mg/kg、600 mg/kg 氧嗪酸鉀建立高尿酸血癥模型；給藥后1 h、2 h、3 h、4 h，小鼠眼眶靜脈取血0.5 mL，室溫放置1 h，以3 500 r/min 離心，取血清；按照尿酸試劑盒說明書檢測(cè)血清尿酸（SUA）水平。通過比較SUA 水平，篩選出最佳造模劑量及取樣時(shí)間。

1.4.3.2 陽性藥劑量摸索

40 只雄性KM 小鼠，隨機(jī)分為4 組，每組10 只；分別灌胃0.5%羧甲基纖維素鈉、5 mg/kg 別嘌醇、10 mg/kg 別嘌醇、20 mg/kg 別嘌醇（0.5%羧甲基纖維素鈉），每天給藥1 次，連續(xù)5 d；末次給藥前1 h，各組動(dòng)物腹腔注射氧嗪酸鉀建立高尿酸血癥模型；給藥后，小鼠眼眶靜脈取血0.5 mL，室溫放置1 h，以3 500 r/min 離心，取血清；按照尿酸試劑盒說明書檢測(cè)血清尿酸（SUA）水平。通過比較SUA 水平，篩選出最佳陽性藥劑量。

1.4.3.3 正式實(shí)驗(yàn)的分組及給藥

50 只雄性KM 小鼠，隨機(jī)分為5 組：正常組、模型組、別嘌醇組（10 mg/kg）和MSQ 組（300 mg/kg，600 mg/kg），每組10 只，正常組和模型組灌胃0.5%羧甲基纖維素鈉，給藥組灌胃相應(yīng)的藥液，10 mL/kg，每天給藥1 次，連續(xù)5 d；末次給藥后1 h，除正常組外，其余各組動(dòng)物腹腔注射氧嗪酸鉀建立高尿酸血癥模型，正常組注射等體積的0.5%羧甲基纖維素鈉；給藥后1 h，小鼠眼眶靜脈取血0.5 mL，室溫放置1 h，以3 500 r/min 離心，取血清。

1.4.3.4 指標(biāo)測(cè)定

本實(shí)驗(yàn)UA 濃度均由尿酸檢測(cè)試劑盒測(cè)定，檢測(cè)原理是尿酸在水和氧氣的存在下通過尿酸酶形成尿囊素，過氧化氫和4-APP 及TOOS 在過氧化物酶的作用下形成醌系色素，在特定波長處比色，可計(jì)算出尿酸的濃度。按操作說明書將小鼠血清5 μL 加入至96 孔板里，超純水5 μL 作為空白品，試劑盒中的標(biāo)準(zhǔn)液5 μL 作為標(biāo)準(zhǔn)品，底液250 μL 后混勻，37 ℃孵育10 min，波長510 mm，放入酶標(biāo)儀讀取吸光度，通過計(jì)算公式測(cè)定尿酸濃度。

式中：A測(cè)為測(cè)定管吸光值；A標(biāo)為標(biāo)準(zhǔn)管吸光值；C標(biāo)為標(biāo)準(zhǔn)品濃度，500 μmol/L。

1.4.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用Graphpad prism 8.0 比較進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以（±s）表示，采用t檢驗(yàn)，以p＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 模型建立實(shí)驗(yàn)

采用氧嗪酸鉀進(jìn)行小鼠腹腔注射，構(gòu)建HUA 模型。如果SUA 水平明顯升高，即表明模型復(fù)制成功。由圖1 可知，造模后，不同濃度氧嗪酸鉀對(duì)小鼠血清中尿酸值與正常組相比，血清中尿酸值濃度顯著升高（p＜0.001），表明氧嗪酸鉀可成功復(fù)制大鼠急性HUA 模型。

圖1 不同濃度氧嗪酸鉀造模后小鼠血清中尿酸值的變化

2.2 陽性對(duì)照物的選擇及其劑量的研究

選擇0.5%羧甲基纖維素鈉和別嘌醇作為陽性對(duì)照物并通過比較UA 水平，篩選出最佳陽性藥劑量。由表2 可知，選擇別嘌醇作為陽性對(duì)照物，別嘌醇組明顯降低由氧嗪酸鉀引起的高尿酸值（p≤0.05）。

表2 別嘌醇對(duì)小鼠血清中尿酸值的影響（±s，n=10）

表2 別嘌醇對(duì)小鼠血清中尿酸值的影響（±s，n=10）

組別UA 濃度/（μmol/L）0.5% CMC-Na53.13±29.64 5 mg/kg 別嘌醇43.13±25.76 10 mg/kg 別嘌醇24.38±7.48 20 mg/kg 別嘌醇33.75±14.49

2.3 MSQ 對(duì)氧嗪酸鉀致小鼠急性高尿酸血癥的影響

由圖2 可知，造模后，不同濃度MSQ 對(duì)小鼠血清中尿酸值與模型組相比，血清中尿酸值濃度基本無變化，表明MSQ 無抗急性高尿酸作用。

圖2 不同藥物對(duì)急性高尿酸模型小鼠血清中尿酸值的影響

氧嗪酸鉀是一種競爭性尿酸酶抑制劑，可阻斷肝臟尿酸酶的作用，并在嚙齒類動(dòng)物中產(chǎn)生尿酸，是合適嚙齒類動(dòng)物的高尿酸造模用藥[3]。氧嗪酸鉀不溶于水，采用腹腔注射氧嗪酸鉀造模，采用合適的溶劑是成功的關(guān)鍵。0.5%羧甲基纖維素鈉是脂溶性物質(zhì)的常用助懸溶劑，可作為灌胃的輔料，不能作為腹腔注射溶液。因此，本文采用生理鹽水進(jìn)行溶解氧嗪酸鉀，效果良好，可供借鑒使用。

由于前期實(shí)驗(yàn)表明，性別不同的小鼠對(duì)氧嗪酸鉀所致的高尿酸狀態(tài)差異較大，雄性小鼠相對(duì)較為穩(wěn)定，因此本文采用單一性別的雄性小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。急性高尿酸血癥模型的另一個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)是，造模后的尿酸測(cè)定時(shí)間的控制。氧嗪酸鉀造模1 h 后尿酸顯著升高，并隨后逐漸下降，因此實(shí)驗(yàn)中應(yīng)保證各組取樣時(shí)間一致。

目前高尿酸的治療多以化學(xué)藥為主，但長期服用會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重副作用。中藥具有多成分、多靶點(diǎn)、副作用小的特點(diǎn)，是新藥篩選的寶庫，采用簡單有效的動(dòng)物模型進(jìn)行藥效學(xué)驗(yàn)證，是一個(gè)有效的中藥新藥篩選途徑[4]。本文采用急性高尿酸血癥模型評(píng)價(jià)蔓三七提取物的抗尿酸作用，可知該部分蔓三七干葉無抗急性高尿酸作用。

3 結(jié)論

通過腹腔注射氧嗪酸鉀建立高尿酸血癥模型，將造模成功的雄性KM 小鼠采用不同劑量的MSQ 灌胃治療5 d 后，MSQ 未表現(xiàn)出對(duì)氧嗪酸鉀致小鼠急性高尿酸模型具有抗尿酸作用。