劉恩智 邵曉光 盛巍 李勐

膠質(zhì)瘤(glioma)是常見的原發(fā)性顱內(nèi)惡性腫瘤，其中膠質(zhì)母細胞瘤是最惡性的形式(WHO IV級)，并以治療耐藥性而臭名昭著[1]。發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)瘤的抑制基因，開發(fā)更為個性化的精準靶向治療方法對膠質(zhì)瘤患者的治療具有重要意義[2]。研究表明，長鏈非編碼RNA(long non-coding RNAs,lncRNAs)可能與微小RNA(microRNA，miRNA)相關(guān)作用，通過MAPK、p53、Wnt/β-catenin、PI3K/AKT/mTOR和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)等信號通路的激活參與了膠質(zhì)瘤的生長和進展[3]。研究表明，長基因間非編碼RNA00087(LINC00087)在神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中高表達，可能是疾病的預后指標或治療靶點[4]。本研究通過TargetScan預測發(fā)現(xiàn)，miR-519d-3p與LINC00087存在結(jié)合位點。miR-519d-3p在膠質(zhì)瘤組織和細胞系中的表達顯著降低，miR-519d-3p的過表達抑制細胞增殖并誘導細胞周期G0/G1期阻滯[5]。但LINC00087和miR-519d-3p在膠質(zhì)瘤中的關(guān)系目前還尚不清楚。本研究檢測膠質(zhì)瘤組織中LINC00087的水平，然后以人膠質(zhì)瘤細胞系U251為主要研究對象，檢測LINC00087和miR-519d-3p對膠質(zhì)瘤細胞增殖和凋亡的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 一般情況：選取2018年1～12月于我院病理檢查確診為膠質(zhì)瘤的患者手術(shù)切除的膠質(zhì)瘤組織共45例，其中男25例，女20例；年齡19～69歲，平均年齡(46.0±12.2)歲；病理級別：WHO Ⅰ～Ⅱ級24例，Ⅲ～Ⅳ級21例。患者術(shù)前未接受放療和化療。同時選擇40例志愿者(腦外傷行顱內(nèi)減壓手術(shù)患者)正常腦組織作為對照。

1.1.2 儀器與試劑：人膠質(zhì)瘤細胞株U251購自美國ATCC；胰蛋白酶、RNA提取試劑Trizol購自美國Sigma-Aldrich公司；DMEM高糖培養(yǎng)液培養(yǎng)基、胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)購自美國Gibco公司；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen公司，Real-time PCR 試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(RT-PCR)購自寶生物工程(大連)有限公司；CCK8檢測試劑盒和細胞凋亡檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；引物、LINC00087抑制物(si-LINC00087)、miR-519d-3p模擬物(miR-519d-3p)、miR-519d-3p抑制劑(anti-miR-519d-3p)、陰性對照(si-NC、miR-NC和anti-miR-NC)、LINC00087野生型和突變型雙熒光素酶報告載體均購自上海吉瑪制藥有限公司；Ki67、Caspase3和GAPDH抗體購自美國Santa cruz公司；雙熒光素酶報告系統(tǒng)(Dual-Luciferase Reporter Assay System)購自美國Promega公司；Real-time PCR儀購自美國Bio-Rad公司；流式細胞儀購自美國BD公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng):將膠質(zhì)瘤細胞U251常規(guī)復蘇，然后接種培養(yǎng)在含10% FBS的DMEM高糖培養(yǎng)液中，培養(yǎng)液中添加100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素，然后置于37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，消化傳代。

1.2.2 Real-time PCR檢測LINC00087和miR-519d-3p的表達:用Trizol試劑提取膠質(zhì)瘤組織樣本、正常腦組織及U251細胞總RNA，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，再以cDNA為模板按照Real-time PCR的說明書進行反應(yīng)，合成lncRNA LINC00087和miR-519d-3p。引物如下：LINC00087上游： 5’-GTCCCAAGTCTCCTGAGAAC-3’,下游5’-CCAGCTCTGTATCACTCTTG-3’；GAPDH上游：5’-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3’,下游：5’-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3’；miR-519d-3p上游：5’-GACCAAAGTGCCTCCCTTTA-3’，下游：5’-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3’；U6上游：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游： 5’-AACGCTTACGAATTTGCGT-3’。應(yīng)用2-ΔΔCt方法進行分析。

1.2.3 細胞轉(zhuǎn)染:將U251細胞稀釋為2×106個/ml，以100 μl細胞/孔的密度接種于6孔板中，細胞培養(yǎng)至融合度達到70%時，根據(jù)轉(zhuǎn)染說明書轉(zhuǎn)染U251細胞。將si-NC、si-LINC00087、miR-NC、miR-519d-3p、si-LINC00087+anti-miR-NC、si-LINC00087+anti-miR-519d-3p分別轉(zhuǎn)染至U251細胞，分別為：si-NC組、si-LINC00087組、miR-NC組、miR-519d-3p組、si-LINC00087+anti-miR-NC組、si-LINC00087+anti-miR-519d-3p組。轉(zhuǎn)染48 h，收集細胞進行驗證。

1.2.4 CCK8實驗檢測細胞增殖:收集并稀釋對數(shù)生長期的U251細胞，以2×103個細胞/孔(以100 μl細胞)接種于96孔板中，在37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在培養(yǎng)至48h時每孔加入10 μl CCK8溶液，培養(yǎng)2 h，酶標儀測定450 nm 吸光度(A)值。存活率%=實驗組A組/對照組A值×100%。

1.2.5 Western Blot實驗檢測蛋白:收集轉(zhuǎn)染后的各組U251細胞，裂解后提取細胞總蛋白，檢測蛋白濃度。用SDS-PAGE分離蛋白樣本，轉(zhuǎn)PVDF膜，然后將膜室溫封閉1 h，洗膜后分別加入稀釋的一抗，Ki67抗體(1∶1 000)、Caspase3抗體(1∶2 000)和GAPDH抗體(1∶4 000)，4℃過夜孵育。洗膜2次，然后加入稀釋的酶標二抗，室溫孵育2 h，顯影，拍照。以GAPDH為內(nèi)參照，分析蛋白表達水平。

1.2.6 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率:收集各組轉(zhuǎn)染的U251細胞，稀釋為1×106個細胞/管，按照凋亡試劑盒說明書進行操作，加入5 μl Annexin V-FITC 和5 μl碘化丙啶(PI)混勻，室溫避光15 min，上流式細胞儀檢測檢測細胞凋亡率。

1.2.7 雙熒光素酶報告實驗:根據(jù)1.2.3的方法進行細胞轉(zhuǎn)染，將構(gòu)建好的LINC00087的野生型(WT-LINC00087)和突變型(MUT-LINC00087)雙熒光素酶報告載體，分別與miR-NC或miR-519d-3p共轉(zhuǎn)染U251細胞，轉(zhuǎn)染48 h后，收集并裂解細胞，離心收集裂解上清，根據(jù)試劑盒說明書檢測熒光素酶相對活性。

2 結(jié)果

2.1 LINC00087在膠質(zhì)瘤組織中的表達 與正常腦組織相比，膠質(zhì)瘤組織組中的LINC00087水平顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 lncRNA LINC00087在膠質(zhì)瘤組織中的表達

2.2 抑制LINC00087對U251增殖的影響 膠質(zhì)瘤U251細胞中轉(zhuǎn)染si-LINC00087抑制LINC00087的表達，si-LINC00087組的膠質(zhì)瘤U251細胞中LINC00087含量降低，細胞存活率和增殖蛋白Ki67含量顯著降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。說明抑制LINC00087可以抑制U251細胞增殖。見表2，圖1。

表2 抑制LINC00087對U251增殖的影響

圖1 Ki67蛋白的表達

2.3 抑制LINC00087表達對膠質(zhì)瘤U251細胞凋亡的影響 si-LINC00087組的U251細胞中Caspase3蛋白表達量增多，細胞凋亡率升高，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。說明抑制LINC00087可促進U251細胞凋亡。見圖2，表3。

圖2 抑制LINC00087對U251凋亡(A)及Caspase3蛋白表達(B)的影響

表3 抑制LINC00087對U251凋亡的影響

2.4 LINC00087靶向調(diào)控miR-519d-3p的表達 TargetScan預測發(fā)現(xiàn)，lncRNA LINC00087與miR-519d-3p之間存在互補的位點。雙熒光素酶報告實驗結(jié)果表明，過表達miR-519d-3p組共轉(zhuǎn)染野生型WT-LINC00087報告載體的細胞熒光素酶相對活性顯著降低(P<0.05)；而共轉(zhuǎn)染突變型MUT-LINC00087的細胞熒光素酶相對活性無顯著變化。qRT-PCR結(jié)果表明，抑制lncRNA LINC00087可上調(diào)miR-519d-3p含量(P<0.05)。說明lncRNA LINC00087靶向負調(diào)控miR-519d-3p的表達。見表4、5，圖3。

表4 雙熒光素酶報告實驗

表5 lncRNA LINC00087調(diào)控miR-519d-3p的表達

圖3 LINC00087靶向miR-519d-3p

2.5 抑制miR-519d-3p表達逆轉(zhuǎn)了抑制LINC00087表達對膠質(zhì)瘤U251細胞增殖和凋亡的作用 為確認LINC00087通過調(diào)控miR-519d-3p影響膠質(zhì)瘤細胞U251的增殖和凋亡，在抑制LINC00087的同時抑制miR-519d-3p。與si-LINC00087+anti-miR-NC組相比，si-LINC00087+anti-miR-519d-3p組的U251細胞中miR-519d-3p的含量降低，細胞存活率顯著升高，細胞凋亡率顯著降低，Ki67蛋白含量升高，Caspase3蛋白含量降低，均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。說明抑制miR-519d-3p可逆轉(zhuǎn)抑制LINC00087對U251細胞增殖和凋亡的影響。見表6，圖4。

表6 抑制miR-519d-3p表達逆轉(zhuǎn)了抑制LINC00087對細胞U251增殖和凋亡的影響

圖4 U251凋亡(A)及Caspase3蛋白表達(B)的影響

3 討論

膠質(zhì)瘤是是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最具侵襲性的腦腫瘤，轉(zhuǎn)移和擴散能力較高，高級膠質(zhì)瘤患者總生存期大約只有15個月[6]。大量研究表明，包括lncRNA和miRNA在內(nèi)的非編碼RNA在膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展及腫瘤分型中發(fā)揮關(guān)鍵作用[4-8]。

有研究表明，基因間lncRNA LINC00087在膠質(zhì)瘤組織中表達呈現(xiàn)顯著上調(diào)，且其表達水平在高級別膠質(zhì)瘤組織中明顯高于低級別膠質(zhì)瘤組織，說明LINC00087可能是與患者預后有關(guān)的生物標志物[4]。但是筆者發(fā)現(xiàn)其在膠質(zhì)瘤中的作用機制尚不清楚，在別的癌癥中的研究較少。本研究通過檢測45例膠質(zhì)瘤組織和正常腦組織發(fā)現(xiàn)，與正常腦組織相比，LINC00087在膠質(zhì)瘤組織中含量顯著升高，與上述結(jié)果[4]一致；在膠質(zhì)瘤U251細胞中轉(zhuǎn)染si-LINC00087抑制LINC00087表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LINC00087含量降低后，膠質(zhì)瘤U251細胞中增殖蛋白Ki67含量降低，細胞存活率降低，細胞凋亡率和凋亡蛋白Caspase3水平均升高，說明抑制LINC00087可抑制U251細胞增殖并促進細胞凋亡。

此外，本研究通過TargetScan預測發(fā)現(xiàn)，miR-519d-3p與LINC00087存在互補的位點，說明LINC00087與miR-519d-3p之間可能是靶向結(jié)合關(guān)系。雙熒光素酶報告系統(tǒng)和qRT-PCR實驗結(jié)果表明，LINC00087靶向負調(diào)控miR-519d-3p的表達。miR-519d-3p在乳腺癌[7]、胃癌[8]、前列腺癌[9]、結(jié)直腸癌[10]和胰腺癌[11]等組織或細胞中表達顯著下調(diào)，發(fā)揮腫瘤抑制因子的作用，上調(diào)其表達可靶向不同的基因抑制癌細胞的增殖和侵襲。研究發(fā)現(xiàn)，miR-519d-3p在膠質(zhì)瘤中表達下調(diào)，靶向細胞周期蛋白D1(CCND1)調(diào)控癌細胞的增殖和細胞周期進程[5]。本研究中還發(fā)現(xiàn)，抑制LINC00087可上調(diào)miR-519d-3p含量，說明miR-519d-3p和LINC00087在膠質(zhì)瘤細胞中表達呈負向關(guān)系。進一步實驗發(fā)現(xiàn)，抑制miR-519d-3p可逆轉(zhuǎn)抑制LINC00087對U251細胞增殖和凋亡的影響，間接驗證了在膠質(zhì)瘤U251細胞中LINC00087對miR-519d-3p的調(diào)控關(guān)系。

綜上所述，在膠質(zhì)瘤組織中LINC00087上調(diào)，在膠質(zhì)瘤U251細胞中，LINC00087靶向miR-519d-3p調(diào)控U251細胞增殖和凋亡。 LINC00087是膠質(zhì)瘤的潛在分子靶點。