陳依林 李光才

轉錄因子是抗氧化反應的重要的上游調(diào)節(jié)劑，它可以維持細胞氧化還原穩(wěn)態(tài)并減少嚴重的氧化損傷[1]。在最近的20年中，核因子-E2相關因子2(Nuclear factor-E2-related factor 2，Nrf2)的發(fā)現(xiàn)與氧化應激在許多關鍵疾病的發(fā)病機制中作用的證據(jù)不斷增加[2]。Nrf2穩(wěn)態(tài)受細胞質(zhì)抑制劑Kelch樣ECH相關蛋白1的調(diào)節(jié)，以響應內(nèi)部清潔蛋白需求或氧化劑，異源生物、致癌物、抗氧化劑和化學預防劑的外源刺激，不僅有助于維持細胞氧化還原平衡，而且還有助于調(diào)節(jié)細胞周期和死亡、免疫力、新陳代謝、選擇性蛋白質(zhì)降解、發(fā)育和致癌作用[3]。小腸缺血/再灌注(intestinal ischemia/reperfusion，IIR)術中并發(fā)癥可引起繼發(fā)性血管疾病和許多相關的生理狀況，主要與缺血組織和炎性介質(zhì)釋放的細胞毒性物質(zhì)有關[4]。因此，IIR可能導致敗血癥，全身性炎性反應綜合征和多器官功能障礙綜合征[5]。已知Nrf2可以激活各種抗氧化反應元件依賴性基因響應氧化應激[6]。Nrf2也參與調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜和其他組織床的缺血性血管新生[7]。Nrf2被認為在缺氧時會增加炎癥和損傷，從而在與氧化應激相關的肺損傷中起保護作用[8]。Sirt1是依賴煙酰胺腺嘌呤二核苷酸的脫乙酰酶蛋白酶，被認為通過脫酰作用以及與幾個轉錄因子和信號分子的相互作用而參與了許多調(diào)控過程[9]。上調(diào)Sirt1的水平會增加Nrf2的核易位，進而抑制絲裂原激活的蛋白激酶磷酸化，并提供針對氧化應激引起的細胞損傷的保護作用[10]。本研究探討Nrf2/Sirt1通路在調(diào)節(jié)氧-葡萄糖剝奪/復氧(Oxygen-glucose deprivation/reoxygenation，OGD/R)后肺損傷后inNrf2缺乏的Nrf2敲低人肺微血管內(nèi)皮細胞(Pulmonary microvascular endothelial cells，PMVEC)的血管重建和急性肺損傷的調(diào)節(jié)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 實驗大鼠:在實驗中使用C57BL/6J小鼠(周齡10周左右)和Nrf2基因敲除(Nrf2-/-)的小鼠，所有小鼠具有相同的遺傳背景。使用日本MEXT的Project進行體內(nèi)實驗。以12 h的明/暗周期將小鼠保持在受控溫度(21±2)℃和濕度(60±5)%下。小鼠可隨意獲取標準食物。

1.1.2 小鼠肺損傷模型構建:用戊巴比妥鈉(50 mg/kg，腹腔注射)麻醉，并在手術過程中自發(fā)呼吸。通過中線切口打開麻醉小鼠的腹壁。腸系膜上動脈暴露并被動脈瘤夾夾住。到腸的血流中斷90 min，釋放以重新建立血流。假手術組進行相同的手術，除了夾住腸系膜上動脈。手術后腹膜內(nèi)注射0.9%氯化鈉溶液(1.0 ml)使所有小鼠復蘇。再灌注6 h后處死動物并收獲組織。將組織在液氮中速凍并保存在-80℃直至分析。

1.1.3 實驗分組:將實驗小鼠隨機分配到以下四組(每組n=10)：WT小鼠對照組(野生型小鼠不做手術處理)；WT小鼠損傷組(該組小鼠進行腸缺血/再灌注手術處理，進行肺損傷模型構建)；Nrf2-/-小鼠損傷組(Nrf2-/-小鼠進行腸缺血/再灌注手術處理)；Nrf2 siRNA轉染組(Nrf2抑制表達)；Sirt1過表達組(用Sirt1慢病毒載體轉染PMVEC)。

1.1.4 醫(yī)學倫理學問題:所有實驗程序均經(jīng)動物保護和使用委員會批準的方案下進行，并根據(jù)實驗動物護理和使用指南進行實驗。

1.2 實驗方法

1.2.1 CCK-8測定細胞增殖:細胞計數(shù)試劑盒8(Sigma，日本)用于檢測NSCLC細胞的增殖。將細胞以每孔5 000個細胞的密度接種在96孔板中，并在5%CO2中于37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h以粘附細胞。向每個孔中添加10 μl細胞增殖試劑CCK-8，混合，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h。雙波長酶標儀用于測量450～490 nm 的檢測波長和600～650 nm的參考波長(貝克曼庫爾特，美國)。每個實驗都設置了3個平行重復。

1.2.2 細胞培養(yǎng)及轉染:人肺微血管內(nèi)皮細胞的氧葡萄糖剝奪和復氧人PMVEC從科學細胞研究實驗室(目錄號：3 000)購買。為了進行OGD/R，將細胞在無葡萄糖的DMEM中培養(yǎng)。將它們在補充有0.5 mmol/L CaCl2和1 mmol/L MgCl2的PBS中洗滌，并置于厭氧室(5%CO2、95%N2； Memmert； Schwabach，德國)中以誘導OGD。8 h后，將培養(yǎng)基替換為ECM，并使平板在常氧室(37℃，5%CO2)中生長，進行24 h的復氧。Sirt1載體對PMVEC的瞬時轉染，如先前所述，用Sirt1慢病毒載體轉染PMVEC。將PMVECs以每孔2×105的密度鋪在6孔板中，感染感染復數(shù)(MOI)為20的慢病毒載體。通過在10 ml的分選緩沖液(含2%FBS，1 mmol/L EDTA的D-PBS)和50 U/ml DNAse中上下吸打，將肺組織解離。樣品在搖動下于37℃孵育10 min，通過100 μm，70 μm和40 μm細胞過濾器轉移到50 ml管中。將過濾后的懸浮液轉移至15 ml試管中，并在4℃下以550×g的轉速離心5 min以沉淀細胞。除去上清液，并將細胞重懸于10 ml分選緩沖液中，并通過在37℃下振蕩孵育1 h使其恢復。

1.2.3 組織學檢查:在4 mm蘇木精和曙紅(HE)染色的石蠟包埋切片中確定缺血-再灌注損傷。根據(jù)肺泡充血、出血、水腫和炎性細胞在空域或血管壁浸潤的綜合評估，使用五點量表對急性肺損傷進行評分。盲目使用0-4(最低至最高嚴重性)評分系統(tǒng)。肺纖維化是通過使用Image Pro-Plus 6.0軟件對Masson的Trichrome陽性染色區(qū)域進行定量分析來測量的。圖像是用連接與數(shù)碼相機(Optronics DEI-470；加利福尼亞州戈萊塔)捕獲的。使用評分系統(tǒng)評估肺損傷程度。根據(jù)該評分系統(tǒng)，將肺泡和間充質(zhì)的水腫，肺泡內(nèi)炎性細胞浸潤，肺泡出血和肺不張的等級分為0～4級。等級：0級，正常，<所占空間的15%被組織和> 85%的肺泡間隙占據(jù)；1級，15%～25%的空間被組織占據(jù)，而76%～85%的空間被肺泡占據(jù)；2級，組織占26%～50%，肺泡間隙占51%～75%；3級，組織占51%～75%，肺泡間隙占26%～50%；4級，組織占76%～100%，肺泡間隙占0～25%。

1.2.4 蛋白質(zhì)印跡分析:通過先前描述的方法從PMVEC制備核提取物。通過刮擦在含有磷酸酶抑制劑的冰冷的PBS中收集細胞，并通過離心沉淀在1 000×g下5 min。將沉淀重懸于500 ml 1×低滲緩沖液中，在冰上孵育15 min，添加去污劑(25 ml)并高速渦旋30 s。將懸浮液在4℃離心(14 000×g，20 min)；將核沉淀重懸于裂解緩沖液中(50 ml)，并在冰上孵育15 min。將該懸浮液進一步離心(14 000×g)10 min，將等分的上清液(核提取物)儲存在-80℃進行進一步分析。通過BCA蛋白質(zhì)測定法定量核提取物中的蛋白質(zhì)含量。蛋白質(zhì)印跡分析蛋白質(zhì)印跡通過標準規(guī)程進行。通過SDS-PAGE分離總細胞裂解液或肺組織中的蛋白質(zhì)(30 mg)，并轉移到硝酸纖維素膜上。通過化學發(fā)光(ECL;Amersham)觀察條帶，暴露于X射線膠片并使用ImageJ進行光密度測定定量。

1.2.5 肺膠原定量:切斷腹主動脈后，用無菌0.9%氯化鈉溶液(15 ml)灌注肺血管，在肺門切開左肺，勻漿，在65%三氯乙酸中孵育(Fisher Scientific，賓夕法尼亞州匹茲堡)在冰上。離心并吸出上清液后，將組織沉淀重懸于12 N HCl中，并在110℃下烘烤過夜。將變性的組織在ddH2O中重新配制，將等分試樣(200 ml)與在10%異丙醇和0.5 mmol/L乙酸鈉中的1.4%氯胺T于室溫孵育20 min。加入1 mmol/L 4-(二甲基氨基)-苯甲醛(500 ml； Sigma-Aldrich)，并將該懸浮液在65℃下溫育15 min。對于每個樣品，一式三份地測量540 nm處的吸光度。 從氯胺反應開始，同時使用0～500 mg/ml反式4-羥基-L-脯氨酸(Sigma-Aldrich)同時生成標準曲線。

1.2.6 RNA提取和實時PCR:使用RNeasy minikit(QIAGEN，德國漢堡)提取總RNA。對于實時PCR，將RNA(2 mg)反轉錄成互補DNA(40 ng)的模板。放大循環(huán)反應(40個循環(huán))如下進行：在95℃下5 s和在60℃下30 s。根據(jù)比較閾值循環(huán)(2-DDCT)標準化靶基因的相對定量值。見表1。

表1 RT-PCR引物序列

2 結果

2.1 肺損傷后Nrf2的表達 通過免疫熒光染色確定肺傷后Nrf2的表達，WT小鼠損傷組較WT小鼠對照組Nrf2的熒光染色增加(P<0.05)。說明在肺損傷后Nrf2在肺組織的細胞核中大量積聚。見表2。

表2 免疫熒光染色確定Nrf2的表達

2.2 蛋白質(zhì)印跡分析 通過蛋白質(zhì)印跡分析實驗小鼠的HIF-1α、VEGF和CD31的蛋白表達，WT小鼠損傷組較Nrf2-/-小鼠損傷組HIF-1α、VEGF和CD31的蛋白表達升高(P<0.05)。表明Nrf2有利于改善血管生成。見表3。

表3 蛋白印跡分析

2.3 Nrf2對肺損傷后的調(diào)節(jié) WT小鼠損傷組較Nrf2-/-小鼠損傷組白細胞浸潤量降低(P<0.05)，Nrf2-/-小鼠損傷組較WT小鼠損傷組肺損傷評分升高(P<0.05)，WT小鼠損傷組較Nrf2-/-小鼠損傷組膠原蛋白沉淀降低(P<0.05)。見表4。

表4 實驗小鼠的肺損傷指標檢

2.4 細胞增殖檢測 第12小時 Sirt1過表達組較Nrf2 siRNA轉染組細胞增殖升高(P<0.05)，第24小時Nrf2 siRNA轉染組較 Sirt1過表達組細胞增殖降低(P<0.05)。見表5。

表5 細胞增殖檢測

2.5 RT-PCR分析 通過PCR實時分析細胞的CD31、NOX4和Nrf2的mRNA表達，Sirt1過表達組較Nrf2 siRNA轉染組CD31、NOX4和Nrf2的mRNA表達升高(P<0.05)。表明 Sirt1的過表達可誘導Nrf2上調(diào)，促進NOX4介導的基因調(diào)控促進人類PMVEC中的血管生成。見表6，圖1。

表6 RT-PCR實時分析CD31、NOX4和Nrf2的mRNA表達

3 討論

Nrf2是抗氧化反應元件的基因的關鍵轉錄因子，參與多種宿主防御功能，包括氧化還原平衡，細胞周期，免疫力，線粒體生物發(fā)生，能量代謝和致癌作用[11]。呼吸道中的Nrf2尤其重要，因為呼吸系統(tǒng)會不斷與環(huán)境壓力相接[12]。由于Nrf2被確定為模型急性肺損傷的易感基因，因此在人類疾病的實驗模型中使用易補充呼吸治療(例如高氧血癥，機械通氣)的Nrf2突變小鼠已證明了Nrf2在氣道中的保護能力[13]。Nrf2已參與調(diào)節(jié)多種疾病的缺血性血管新生，例如心血管疾病和缺血性視網(wǎng)膜病[14]。Nrf2也被認為可以保護許多器官免受IIR傷害，包括肺。此外，在幾項研究中，發(fā)現(xiàn)Sirt1的上調(diào)可激活Nrf2[15]。我們研究了Nrf2是否參與了IIR在鼠模型中急性肺損傷的血管形成和調(diào)節(jié)，發(fā)現(xiàn)Sirt1過表達刺激的Nrf2可能在缺血后的血管新生中起重要作用IIR通過NOX4介導的基因調(diào)控。由Sirt1過表達刺激的Nrf2上調(diào)和易位向組織病理學變化的緩解并增強了內(nèi)皮細胞標志物CD31的表達。Nrf2-抗氧化反應元件信號通路是抵抗氧化或親電子應激的主要細胞防御手段[16]。它通過調(diào)節(jié)誘導型和組成型基因的表達與許多抗氧化反應元件依賴基因相互作用[17]。深入了解抗氧化反應元件誘導型/組成型基因的調(diào)控可能會導致以控制所需的質(zhì)量，例如缺血組織的血運重建[18]。我們發(fā)現(xiàn)在小鼠中Nrf2敲低抑制了IIR后的CD31，HIF-1α和VEGF表達，而Sirt1對Nrf2的上調(diào)增強了野生型IIR后的CD31，HIF-1α和VEGF表達。HIF-1α參與VEGF的轉錄，從而刺激缺氧或局部缺血后的新生血管形成[19]。使用視網(wǎng)膜病變的大鼠模型研究了新生血管形成，發(fā)現(xiàn)VEGF激活的NOX4導致了VEGF活化的VEGFR2和NOX4介導內(nèi)皮細胞增殖，并提出Sirt1可以發(fā)揮血管生成的作用，發(fā)現(xiàn)Sirt1通過FOXO3信號通路對IIR誘導的急性肺損傷具有保護作用[20]。為了研究與Nrf2/Sirt1相關的血管生成，本研究評估了OGD/R后人PMVEC中Nrf2和Sirt1的調(diào)控。發(fā)現(xiàn)Sirt1過表達誘導Nrf2上調(diào)并易位到核內(nèi)。Nrf2的核積累與增強的Sirt1介導的CD31、NOX4和Nrf2表達有關。此外，Sirt1在細胞質(zhì)和核區(qū)室之間穿梭，并調(diào)節(jié)對細胞的生長，細胞存活和遷移相關的基因表達，以響應生理和病理性細胞應激。因此，Nrf2/Sirt1我們在鼠模型中觀察到的調(diào)節(jié)血管生成在人肺內(nèi)皮細胞中復制。

總之，我們發(fā)現(xiàn)Sirt1的過表達促進了Nrf2向核的轉運，并增加了鼠和人細胞模型中NOX4、HIF-1α和VEGF的表達。這導致鼠模型中的缺血性血管生成和增加了人類細胞中的細胞活力。當受Sirt1刺激時，Nrf2可能通過NOX4介導的基因調(diào)控在血管生成中發(fā)揮重要作用。