周翔 成平 陸衡程 賀理宇

局灶節(jié)段性腎小球硬化(focal segmental glomerulosclerosis，F(xiàn)SGS)是臨床上常見的一種腎臟疾病的病理形態(tài)學(xué)診斷定義，以部分腎小球及(或)其毛細(xì)血管袢發(fā)生局灶化病變?yōu)橹饕±肀憩F(xiàn)[1，2]。蛋白尿、血尿是其主要的臨床表現(xiàn)，各種治療方案的效果不一，導(dǎo)致病情呈慢性進(jìn)行性發(fā)展，最終可進(jìn)展成終末期腎病(ESRD)。FSGS可見于任何年齡，但兒童及青少年更加多見，而且近年來其發(fā)生率有增高趨勢(shì)[3，4]。既往研究顯示，遺傳背景、氧化應(yīng)激、炎性反應(yīng)、免疫紊亂等都與其發(fā)病有關(guān)，但發(fā)病機(jī)制尚不完全明確[1,2,4,5]。所以探索和闡明其發(fā)病機(jī)制，找到其新的治療靶點(diǎn)，對(duì)全球衛(wèi)生健康和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)都有重大意義[6]。哺乳動(dòng)物不育系20樣激酶(MST1)是Hippo通路中的核心成員之一，在調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞中活性氧的產(chǎn)生和細(xì)菌殺傷中起到重要的作用，核因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)通過促進(jìn)下游抗氧化基因及解毒酶基因表達(dá),發(fā)揮抗氧化作用。Mst1-Nrf2通路參與細(xì)胞氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)等多種生物學(xué)反應(yīng)。Nrf2基因激活后能夠抑制線粒體活性氧(ROS)和炎性因子的產(chǎn)生，Mst1缺乏可以減輕細(xì)胞氧化應(yīng)激，但Mst-Nrf2通路在FSGS作用尚不十分明確[7-11]。鞣花酸(ellagic acid，EA)是一種廣泛存在于多種軟果、堅(jiān)果類植物中的一種天然多酚，國內(nèi)外既往研究證明，EA具有清除自由基、抑制脂質(zhì)過氧化等抗氧化、抗炎及激活自噬抑制癌細(xì)胞增殖等生物活性功能[11-14]。但EA作用的確切的分子機(jī)制尚不明確，EA是否可能通過Mst-Nrf2通路參與氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)而發(fā)揮腎臟保護(hù)作用尚未有研究證實(shí)。故本實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)建阿霉素誘導(dǎo)的經(jīng)典FSGS 大鼠模型，進(jìn)而研究EA在阿霉素誘導(dǎo)的FSGS大鼠中是否存在調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激的腎臟保護(hù)作用及分析可能的分子機(jī)制，以期在臨床治療FSGS時(shí)提供新的治療思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 購自長(zhǎng)沙斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司的SD雄性大鼠30只[合格證號(hào)：SCXK(湘)2019-0004]，200～250 g，動(dòng)物房常規(guī)環(huán)境，標(biāo)準(zhǔn)飼料飼養(yǎng)，自由攝食及飲水。試劑：鞣花酸購買自美國Sigma 公司，阿霉素針劑購自于美國輝瑞制藥有限公司。

1.2 模型建立及實(shí)驗(yàn)分組 將健康SD大鼠30只隨機(jī)編為對(duì)照組(6只)、模型組(12只)、實(shí)驗(yàn)組(12只)3組。對(duì)照組大鼠尾靜脈一次按10 ml/kg注射0.9%氯化鈉溶液，模型組和實(shí)驗(yàn)組大鼠尾靜脈一次按10 mg/kg劑量注射阿霉素(阿霉素1 mg/ml溶于0.9%氯化鈉溶液)，實(shí)驗(yàn)組再每日按200 mg/kg 的劑量注射鞣花酸，模型組每日注射同等量0.9%氯化鈉溶液，注射時(shí)間均持續(xù)6 周[15-17]。6周后處死所有組別大鼠，并收集腎臟、血液、尿液標(biāo)本并按實(shí)驗(yàn)常規(guī)要求保存。3組大鼠血尿標(biāo)本復(fù)融離心后采用全自動(dòng)生化儀檢測(cè)并分析血肌酐、尿素氮、血漿白蛋白、可溶性尿激酶、24 h尿總蛋白及血膽固醇的結(jié)果。將各組大鼠腎組織取出勻漿離心取上清液后，采用硫代巴比妥酸法檢測(cè)各組大鼠腎組織丙二醛的含量，采用Sedlak和Lindsay的方法測(cè)定腎組織中還原型谷胱甘肽的含量，采用Lawrence和Burk的方法測(cè)定GSH過氧化物酶活性、采用Aebi的方法測(cè)定腎組織過氧化氫酶活性。

1.3 采用Western blot法檢測(cè)檢測(cè)腎組織纖維化相關(guān)指標(biāo)表達(dá) 取腎臟皮質(zhì)組織，快速放于液氮急凍，保存于-80℃冰箱中。取部分腎組織按照按Western blot標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)操作步驟操作，一抗二抗購置于美國Cell Signaling Technology 公司，抗體稀釋比例按照說明書建議操作。以β-actin 作為內(nèi)參照，采用上海天能儀器機(jī)器自帶系統(tǒng)分析圖像。

1.4 采用實(shí)時(shí)熒光PCR(RT-PCR)檢測(cè)腎組織中Mst1-Nrf2通路蛋白mRNA的表達(dá) 腎組織用Trizol處理提取總RNA，并用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA，并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再采用熒光定量PCR試劑盒在ABI 7300機(jī)器檢測(cè)，以GAPDH為內(nèi)參，ΔΔct 法進(jìn)行相對(duì)定量。每樣本至少重復(fù)3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。

1.5 采用PAS染色觀察腎組織腎小球硬化和間質(zhì)纖維化情況 取腎組織按免疫組化福爾馬林固定、梯度酒精脫水并浸入石蠟等步驟后，使用石蠟切片機(jī)切片后染色觀察。免疫組化所使用的一抗購自美國Cell Signaling Technology 公司。

2 結(jié)果

2.1 3組大鼠肌酐、尿素氮、血清白蛋白、24 h尿蛋白、血膽固醇、可溶性尿激酶受體檢測(cè)結(jié)果 3組大鼠血清肌酐Scr、尿素氮、血清白蛋白、可溶性尿激酶受體、24 h尿蛋白定量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組和相對(duì)于對(duì)照組的所檢測(cè)指標(biāo)均有惡化加重(P<0.5)。而實(shí)驗(yàn)組較模型組各項(xiàng)指標(biāo)均有緩解。見表1。

表1 3組大鼠肌酐、尿素氮、血清白蛋白、24 h尿蛋白、血膽固醇、可溶性尿激酶受體檢測(cè)結(jié)果

2.2 3組大鼠腎組織丙二醛、谷胱甘肽、谷胱甘肽過氧化物酶和過氧化氫酶活性比較 模型組大鼠腎組織丙二醛含量明顯高于對(duì)照組(P<0.01)。實(shí)驗(yàn)組丙二醛水平較模型組明顯降低。對(duì)照組和模型組GSH水平無顯著性差異，而實(shí)驗(yàn)組GSH水平高于其他各組。與對(duì)照組相比，模型組腎組織GSH過氧化物酶和過氧化氫酶活性顯著降低。而實(shí)驗(yàn)組腎組織GSH過氧化物酶和過氧化氫酶活性降低程度小于模型組。見表2。

表2 3組大鼠腎組織丙二醛、還原型谷胱甘肽、谷胱甘肽過氧化物酶、過氧化氫酶活性結(jié)果

2.3 采用RT-PCR檢測(cè)腎組織中Mst1和Nrf2的mRNA表達(dá) 相比對(duì)照組，模型組的Mst1的mRNA表達(dá)上調(diào)，Nrf2的mRNA表達(dá)下調(diào)。而實(shí)驗(yàn)組較模型組Mst1的mRNA表達(dá)減少，而Nrf2的mRNA表達(dá)增加。見表3。

表3 RT-PCR檢測(cè)腎組織中Mst1和Nrf2的mRNA表達(dá)

2.4 采用Western Blot 和RT-PCR 檢測(cè)腎臟纖維化指標(biāo)Fibronectin(FN)、α-SMA、TGF-β的表達(dá)來衡量腎小球硬化和間質(zhì)纖維化發(fā)展情況 模型組較對(duì)照組各纖維化指標(biāo)表達(dá)明顯上調(diào)，而實(shí)驗(yàn)組纖維化指標(biāo)的表達(dá)被不同程度抑制。故鞣花酸能有效逆轉(zhuǎn)阿霉素誘導(dǎo)的FSGS 大鼠腎組織纖維化進(jìn)程。見表4，圖1。

表4 RT-PCR檢測(cè)Fibronectin(FN)、α-SMA、TGF-β的mRNA表達(dá)

圖1 鞣花酸對(duì)阿霉素誘導(dǎo)的FSGS大鼠腎臟纖維化指標(biāo)的影響，Western Blot檢測(cè)Fibronectin(FN)、α-SMA、TGF-β蛋白表達(dá)

2.5 PAS染色法可以用來檢測(cè)組織中的糖類使其呈現(xiàn)紫紅色 模型組的腎組織表現(xiàn)為明顯的腎小球硬化和間質(zhì)纖維化，但當(dāng)鞣花酸處理后的實(shí)驗(yàn)組腎小球病理損傷明顯減輕。見圖2。

對(duì)照組模型組實(shí)驗(yàn)組

3 討論

腎小球疾病常因足細(xì)胞損傷而臨床表現(xiàn)為蛋白尿，可引起進(jìn)行性腎小球硬化[1,2]。FSGS是一種常見的原發(fā)性腎小球病變，部分患者最終可進(jìn)展為ESRD，對(duì)患者生存質(zhì)量造成嚴(yán)重不良影響[4]。而FSGS發(fā)病機(jī)制還不明確，目前已有研究證明氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)在其病生理過程中發(fā)揮了重要作用[1]，會(huì)對(duì)足細(xì)胞的組織結(jié)構(gòu)及生理功能產(chǎn)生影響，引起進(jìn)行性腎小球硬化[13]。已有研究證實(shí)Mst1-Nrf2通路參與細(xì)胞氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)[8,9]。

已有研究證實(shí)，F(xiàn)SGS有多種造模方法，比較常用和公認(rèn)的采用尾靜脈注射阿霉素誘導(dǎo)造模，這是因?yàn)榘⒚顾氐哪I毒性較強(qiáng)，能誘導(dǎo)氧化應(yīng)激反應(yīng)、抑制腎小球足細(xì)胞周期，與人FSGS相近，臨床表現(xiàn)為腎病綜合征。在本研究中發(fā)現(xiàn)，鞣花酸在阿霉素誘導(dǎo)的FSGS大鼠通過抑制Mst1蛋白和促進(jìn)Nrf2蛋白的產(chǎn)生，從而減弱腎組織的氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)，延緩FSGS 的病理進(jìn)程，發(fā)揮腎臟保護(hù)作用。

鞣花酸為天然多酚，多項(xiàng)研究證明其具有抗氧化、抗炎等等多種生物活性。本研究結(jié)果證明在使用鞣花酸處理阿霉素誘導(dǎo)的FSGS大鼠模型后，大鼠的腎功

能、血漿白蛋白、24 h尿蛋白定量、血膽固醇水平、可溶性尿激酶受體、腎組織ROS等指標(biāo)均得到改善，腎組織GSH過氧化物酶和過氧化氫酶活性降低，腎小球硬化和間質(zhì)纖維化也在病理損傷上得到減輕，有助于維持機(jī)體的正常生理功能。結(jié)果證明鞣花酸能緩解阿霉素誘導(dǎo)的FSGS大鼠腎臟結(jié)構(gòu)和功能病變情況，且其可能通過Mst1-Nrf2通路抑制炎性反應(yīng)和氧化應(yīng)激而發(fā)揮作用。

綜上，鞣花酸可以緩解阿霉素誘導(dǎo)的FSGS大鼠腎臟病變，在FSGS防治中具備潛在臨床運(yùn)用價(jià)值，詳細(xì)的分子機(jī)制尚不完全明確，有待進(jìn)一步研究。