姚宏,鄭玉才,李志雄,談永萍,王云浩，陳宇星,徐亞歐，向方成，饒開晴*

(1.西南民族大學生命科學與技術(shù)學院，四川 成都 610041;2.成都美麗田園農(nóng)業(yè)公司，四川 彭州 611930)

甜菜堿(三甲銨乙內(nèi)脂)廣泛存在于動植物中，具有無毒、無害、無殘留的優(yōu)點，且有較強的抗氧化性能[1]。自芬蘭科學家發(fā)現(xiàn)甜菜堿具有獨特的誘食功能后，其在水生動物中被廣泛應用[2]。研究發(fā)現(xiàn)，甜菜堿不僅具有提供甲基、調(diào)節(jié)體內(nèi)脂肪代謝、緩解應激、調(diào)節(jié)滲透壓等功能[3-4]，還能提高肉雞的生長性能[5-6],降低肉雞腹脂率并提高其胴體品質(zhì)[7]，改善體內(nèi)脂肪代謝、促進磷脂和載脂蛋白合成的功能，它是一種新的營養(yǎng)再分配劑[8]。甜菜堿通過提供肉堿合成所必須的甲基從而提高生長育肥豬肝臟游離肉堿的含量，促進長鏈脂肪酸進入肌肉線粒體進行β-氧化，減少皮下脂肪含量，同時增加肌肉脂肪含量，發(fā)揮體脂重新分配的作用[1]。研究表明，甜菜堿減少脂肪沉積的機理主要是通過為蛋氨酸的合成以及為脂肪的代謝提供甲基、參與卵磷脂合成、促進肝脂遷移，降低肝臟和血清中甘油三酯的含量；其次，甜菜堿通過促進肌肉和肝臟中肉堿的合成提高線粒體中脂肪的氧化，從而減少畜禽體內(nèi)脂肪的沉積[9-11]。

藏雞覓食能力強，耐粗放，是我國高寒、低壓及缺氧高海拔地區(qū)養(yǎng)禽業(yè)的重要品種資源[12]。但由于藏雞繁殖力弱，產(chǎn)蛋量低制約著藏雞的開發(fā)利用。雞蛋形成過程中，卵黃的生成需要大量的脂質(zhì)沉積。我們之前的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)飼糧中添加甜菜堿能提高藏雞產(chǎn)蛋率，以及提高蛋黃中粗脂肪的含量[13]，這與脂肪代謝的改變有著密切的關(guān)系。甜菜堿可能通過影響藏雞肝臟脂肪代謝，降低體內(nèi)脂肪沉積，進而促進蛋內(nèi)脂肪沉積，改善藏雞的產(chǎn)蛋性能。

目前關(guān)于甜菜堿調(diào)節(jié)動物脂肪代謝的研究多集中于豬、肉雞[14-18]，但關(guān)于藏雞飼糧中添加甜菜堿能否通過促進脂肪酸β-氧化，調(diào)控藏雞肝臟上脂蛋白脂肪酶(liportein lipase，LPL)、乙酰輔酶A羧化酶(acetyl CoA carboxylase，ACC)和脂肪酸合成酶(fatty acid synthase，F(xiàn)AS)以及過氧化物酶體增殖物激活受體α(peroxisome proliferators-activated receptors，PPARα)等關(guān)鍵基因的表達，從而影響藏雞體脂沉積尚未見報道。因此，本試驗擬研究飼糧中添加不同水平甜菜堿對藏雞脂肪代謝及其相關(guān)基因表達的影響，從而為甜菜堿作為添加劑在藏雞飼糧中更科學地應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗設計和飼養(yǎng)管理

選擇體重相近的180只30周齡藏雞，隨機分為3組，每組6個重復，每個重復10只。參照《中國飼料成分及營養(yǎng)價值表》(第26版)配制玉米-豆粕型基礎(chǔ)飼糧(表1)，對照組飼喂基礎(chǔ)飼糧，試驗組分別在基礎(chǔ)飼糧中添加1 000 mg/kg(低劑量組)和3 000 mg/kg(高劑量組)的甜菜堿(純度為98%，購于天石生物有限公司)。試驗在四川彭州市叢林藏雞種雞場進行，采用籠養(yǎng)，每籠2～3只。飼養(yǎng)全期為56 d，前期1～7 d為預飼期，后期8～56 d為試驗期，建立嚴格的飼養(yǎng)管理制度。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風干基礎(chǔ))

1.2 樣品采集

飼養(yǎng)56 d后每個重復選取2只藏雞，頸靜脈采集血液于離心管內(nèi)，經(jīng)4 000 r/min離心10 min，分離血漿，置于-20 ℃冰箱中保存。采血后屠宰，分離肝臟，液氮速凍后于-80 ℃保存。

1.3 檢測指標和測定方法

1.3.1 生產(chǎn)性能的測定

于試驗第1、56天以重復為單位稱藏雞空腹體質(zhì)量，每天記錄藏雞飼料消耗量，用于計算其平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI)和料重比(F/G)。

1.3.2 腹脂率的測定

打開腹腔分離腹部脂肪，脂肪重量由電子天平測量，腹脂率(%)=腹脂重/活體重×100%。

1.3.3 血脂及肝脂含量的測定

利用ELx800酶標儀(BioTek)使用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒檢測肝臟、血漿中甘油三酯(triglyceride,TG)、總膽固醇(total cholesterol,TC)含量和血漿中高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoproteins,HDL-C)以及低密度脂蛋白膽固醇(low-dendity lipoproteins, LDL-C)、游離脂肪酸(non-esterified fatty acid,NEFA)含量，具體方法參照試劑盒說明書。

1.3.4 肝臟中ACC、FAS、PPARα和LPL基因表達的測定

采用TRIzol試劑(Invitrogen公司)提取肝臟組織總RNA，反轉(zhuǎn)錄酶(TaKaRa公司)進行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。引物由金唯智生物有限公司合成，引物信息見?。以上述cDNA為模版，進行實時熒光定量PCR(qPCR)分析，使用TaKaRa(大連寶成生物有限公司)的TB Green TM PremixExTaqTMⅡ(Til RNase Plus)試劑盒建議的反應體系，混合反應物，總體積為10 μL，利用熒光定量PCR儀(Thermo Fisher Scientific-Q3)進行擴增，qPCR反應采用兩步法，反應程序：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性10 s，退火30 s，循環(huán)40次，采用2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量。

表2 實時熒光定量PCR引物序列

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

使用SPSS(18.0)統(tǒng)計軟件中單一方差分析對生產(chǎn)性能、腹脂率、TG、TC、LDL-C、HDL-C和NEFA進行統(tǒng)計學分析；用2-ΔΔCt法對基因做相對定量表達分析，基因數(shù)據(jù)先進行正態(tài)性檢驗，如果數(shù)據(jù)不服從正態(tài)分布，統(tǒng)計分析前需要用Log10進行數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化，再用單一方差分析對轉(zhuǎn)化后的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學處理，所有數(shù)值以“平均值±標準誤”表示。P>0.05表示無顯著差異，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 甜菜堿對藏雞生產(chǎn)性能的影響

由表3可見，甜菜堿添加對藏雞的平均日采食量(ADFI)、平均日增重(ADG)、料重比(F/G)以及終末重均無顯著影響(P>0.05)。

表3 甜菜堿對藏雞生產(chǎn)性能的影響

2.2 甜菜堿對藏雞腹脂率的影響

與對照組相比，飼糧中添加1 000 mg/kg和3 000 mg/kg的甜菜堿均顯著降低了藏雞腹脂率(P<0.05)，且高劑量組腹脂率顯著低于低劑量組(P<0.05)。見圖1。

2.3 甜菜堿對藏雞血漿及肝臟中脂類相關(guān)指標含量的影響

與對照組相比，低、高劑量試驗組藏雞肝臟和血漿中TG(圖2A)、TC(圖2B)的含量均顯著降低(P<0.05)，且高劑量組肝臟中TG和TC的含量顯著低于低劑量組(P<0.05)；2個試驗組藏雞血漿中LDL-C含量(圖2C)顯著降低(P<0.05)，但低、高劑量組之間沒有顯著差異(P>0.05)；高劑量組血漿中HDL-C含量(圖2D)較對照組顯著增加(P<0.05)，而低劑量的甜菜堿對藏雞血漿中HDL-C含量沒有顯著影響(P>0.05)，不同添加水平之間也無顯著差異(P>0.05)；甜菜堿提高了藏雞血漿中NEFA含量(圖2E)，且呈現(xiàn)劑量效應(P<0.05)。

注：相同字母或無字母為差異不顯著(P>0.05)，不同字母為差異顯著(P<0.05)。下同

A. TG; B. TC; C. LDL-C; D. HDL-C; E. NEFA

2.4 甜菜堿對藏雞肝臟中脂肪代謝關(guān)鍵基因表達的影響

與對照組相比，高劑量組甜菜堿顯著降低了藏雞肝臟中ACC基因表達量(P<0.05)(圖3A)；低劑量組與高劑量組均顯著降低了藏雞肝臟中FAS基因表達量(P<0.05)，但低劑量組與高劑量組間沒有顯著差異(P>0.05)(圖3B)；甜菜堿的添加顯著上調(diào)了藏雞肝臟中PPARα基因的表達且有劑量效應(P<0.05)(圖3C)；LPL基因的表達量在各組間均沒有顯著差異(P>0.05)(圖3D)。

A. ACC; B. FAS;C. PPARα; D. LPL

3 討論

目前，甜菜堿對藏雞生產(chǎn)性能影響的研究除了本實驗室外尚未見其他的研究報道。胡旭進等[18]研究表明，飼糧中添加甜菜堿能提高金華豬的ADG。本試驗研究結(jié)果表明，飼糧中添加甜菜堿對藏雞ADG、ADFI、F/G以及終末重均無顯著影響，這可能與藏雞對飼料的轉(zhuǎn)化率以及獨特的生存環(huán)境有關(guān)。

肉雞腹部相對于其他部位是脂肪沉積最快的地方[19]，腹脂是評判機體脂肪沉積的關(guān)鍵指標，因其在體脂中占較大比例，直接影響體脂沉積量[20]。本試驗中，甜菜堿降低了藏雞腹脂率，這與Saunderson等[21]報道的甜菜堿顯著降低肉雞腹脂沉積的結(jié)果較一致。Wang等[22]研究也發(fā)現(xiàn)甜菜堿顯著降低了肉鴨腹脂沉積，而且高劑量的甜菜堿減少腹部脂肪沉積效果更佳。

血清中血脂含量(TC、TG、LDL-C、HDL-C、NEFA等)可反映機體總體脂代謝狀況，如血清中TG、TC含量降低，NEFA含量升高，表明機體脂肪分解增強，合成減弱[23]。本試驗中，甜菜堿降低了藏雞血漿中TC、TG、LDL-C含量，增加了藏雞血漿中NEFA含量，這與馬建爽等[24]、張冬梅等[25]的報道一致，且在本試驗中高劑量甜菜堿的添加效果更加明顯。甜菜堿通過自身代謝循環(huán)，促進動物體內(nèi)磷脂的合成，促進肝臟中載脂蛋白的合成，使TG的遷移速度加快，降低了血清TG的含量[26]。本試驗中高劑量的甜菜堿組中血漿HDL-C含量升高，說明血液運輸膽固醇的能力增加，使血漿TC含量下降，這表明甜菜堿能夠影響肝臟的脂質(zhì)代謝，從而改變脂蛋白的比例，起到降低或重新分配體內(nèi)脂肪的作用。

FAS是組織脂肪酸合成的關(guān)鍵酶[27], 能直接控制機體脂肪合成，其在肝臟中的活性可作為評判脂肪合成能力的關(guān)鍵指標，且FAS活性與其基因mRNA表達量相關(guān)[28-29]。本試驗中，高、低劑量甜菜堿均降低了肝臟中FAS基因的表達量，與Xing等[14]和Huang等[15]在日糧中添加甜菜堿降低肉雞和豬肝臟中FAS基因表達的研究結(jié)果一致。FAS基因表達降低，表明肝臟脂肪合成代謝減弱，證實了添加甜菜堿降低肝臟脂肪合成的能力。同時FAS基因表達下調(diào)可降低脂肪酸脂化生成TG，進一步降低TG在脂肪組織中沉積的效率[30]。因此，在飼料中添加甜菜堿減少了藏雞腹脂沉積及降低其血漿TG含量與其下調(diào)了藏雞肝臟中FAS基因的表達密切相關(guān)。

動物體脂沉積所需的脂肪酸大多數(shù)來自自身的脂肪酸合成，由脂肪酸合成酶催化乙酰輔酶A和丙二酸單酰輔酶A合成脂肪酸。ACC可以催化乙酰輔酶A生成丙二酸單酰輔酶A的羧化作用，是長鏈脂肪酸從頭合成的限速酶[31]。ACC既是脂肪酸合成的關(guān)鍵酶又是限速酶，是脂肪酸合成與代謝中起重要作用的中間代謝物，是大多數(shù)生物脂肪酸從頭合成的第一個必需酶[32]。本研究結(jié)果顯示，藏雞飼料中添加3 000 mg/kg甜菜堿后，肝臟組織中ACC基因表達量顯著下降，說明高劑量的甜菜堿可在轉(zhuǎn)錄水平上通過抑制肝臟脂肪合成從而控制腹脂沉積，與腹脂率顯著減少的結(jié)果是相一致的。

PPARα是調(diào)節(jié)線粒體脂肪酸β-氧化基因的主要轉(zhuǎn)錄因子[33]，能在心、肝、肌肉和腎臟中表達，調(diào)節(jié)脂肪的分解代謝[34]。本研究中飼糧添加低、高劑量的甜菜堿均顯著上調(diào)了藏雞肝臟中PPARα基因的表達，這與冷智賢[35]報道甜菜堿增加了肉雞肝臟中PPARα基因表達量結(jié)果一致。因此，甜菜堿可能通過提高機體線粒體脂肪酸β-氧化來調(diào)節(jié)脂肪代謝。

LPL主要是由脂肪組織和骨骼肌細胞合成分泌，它是催化脂肪組織中TG代謝的限速酶[36]，在脂蛋白代謝中起著重要作用[37]。它通過將乳糜微粒和極低密度脂蛋白中的三酰甘油分解成脂肪酸和甘油，儲存在脂肪組織中，在不同營養(yǎng)或生理狀態(tài)下根據(jù)組織的代謝需要來指導脂肪酸導入特異部位[38]。本試驗中，高、低劑量甜菜堿的添加對藏雞肝臟中LPL基因表達沒有影響，這可能與甜菜堿的作用時間以及藏雞的發(fā)育階段等有關(guān)，還有待進一步研究。

綜上所述，飼糧中添加高、低劑量的甜菜堿，均能減少藏雞腹脂沉積，這可能與甜菜堿顯著下調(diào)肝臟中FAS基因、上調(diào)肝臟中PPARα基因的表達，從而顯著降低藏雞血漿中TG、TC、LDL-C的含量和增加血漿中NEAF的含量有關(guān)。本試驗中甜菜堿的添加能夠通過抑制藏雞脂肪合成，促進脂肪酸氧化來影響脂肪代謝，其中3 000 mg/kg甜菜堿添加效果更佳。