徐立新，陳秋陽，史嘉雯，孫曉婷，宋小凱，嚴(yán)若峰，李祥瑞

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210095)

堆型艾美耳球蟲(Eimeriaacervulina)是引起雞球蟲病常見球蟲種之一，其主要寄生于十二指腸的腸道上皮細(xì)胞內(nèi)。球蟲蟲體在腸上皮細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行裂殖生殖和配子生殖，使腸道組織受到損傷和破壞，導(dǎo)致對營養(yǎng)物質(zhì)及鋅等的吸收障礙，增重減少，機體細(xì)胞的抗氧化能力和免疫功能下降，嚴(yán)重的可導(dǎo)致雞死亡[1-3]。目前商業(yè)養(yǎng)殖中防治雞球蟲病的主要方法仍然是使用藥物或球蟲疫苗進(jìn)行免疫防治，但均不能取得理想效果。

鋅是機體的重要微量元素之一，是多種酶和蛋白的組成成分[4-5]，在促進(jìn)機體生長、傷口愈合和增強機體免疫力等方面具有重要作用[6-7]。在動物飼養(yǎng)過程中，常以氧化鋅的形式經(jīng)飼料添加。氧化鋅能夠維護(hù)腸道的完整、促進(jìn)腸道健康生長，提高營養(yǎng)物質(zhì)的消化利用[8]；但氧化鋅大部分會被胃酸分解成Zn2+，僅有少部分能進(jìn)入腸道，導(dǎo)致氧化鋅的生物利用率低[9-10]。納米氧化鋅(ZnO nanoparticles，ZnO NPs)可以以完整的氧化鋅顆粒經(jīng)胃后進(jìn)入腸道，從而發(fā)揮其抗菌活化緩解細(xì)胞損傷、修復(fù)腸道黏膜、增強抗氧化損傷和機體免疫的能力[11-12]。

本研究擬通過口服納米氧化鋅抗堆型艾美耳球蟲感染的試驗，探討納米氧化鋅作為添加劑在抗球蟲病中使用的可行性，為提高抗球蟲藥物、活球蟲疫苗或基因工程疫苗防治雞球蟲病的效果提供新的輔助方法。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

1日齡白羽雛公雞，購自海安縣雙利孵禽場，飼養(yǎng)于無球蟲的環(huán)境中，飼喂不含抗球蟲藥物的全價顆粒日糧，自由采食和飲水。

1.2 堆型艾美耳球蟲卵囊

本實驗室保存的孢子化卵囊，用前經(jīng)傳代擴增。孢子化卵囊置于10倍體積的重鉻酸鉀溶液中，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 主要試劑

胃蛋白酶(S10028-100 g，源葉生物)；納米氧化鋅分散液(上海麥克林生化科技有限公司)。

1.4 試驗動物分組

將飼養(yǎng)至14日齡的雞逐個稱重，選擇體重相近雞360羽，隨機分成12組(A至L組)，每組30羽，每組分3個重復(fù)，每個重復(fù)10羽。分別為空白對照組；納米氧化鋅劑量篩選試驗：10×104個孢子化卵囊感染雞，分別口服去離子水對照和5、10、20、30 mg納米氧化鋅5組；納米氧化鋅抗不同劑量球蟲感染試驗：口服20 mg納米氧化鋅，分別用5×104、2.5×104、1×104孢子化卵囊進(jìn)行感染及對應(yīng)口服去離子水對照6組。試驗動物分組、卵囊感染量和口服納米氧化鋅劑量見表1。

表1 試驗動物分組及處理

1.5 球蟲孢子化卵囊感染方法和納米氧化鋅的口服方法

取試驗所需劑量的孢子化卵囊，離心，加去離子水重懸，重復(fù)數(shù)次確保洗凈重鉻酸鉀后，加去離子水稀釋并進(jìn)行卵囊計數(shù)。按表1所示卵囊數(shù)量，用1 mL注射器吸取相應(yīng)劑量卵囊混勻液，經(jīng)口腔注入雞嗉囊。

同時，按表1所示將相應(yīng)劑量的納米氧化鋅分散于600 μL去離子水中，用1 mL注射器吸取相應(yīng)劑量納米氧化鋅經(jīng)口腔注入雞嗉囊，每日1次，直至感染后第7天剖殺。

所有試驗雞，按每個重復(fù)飼養(yǎng)于一個自制的飼養(yǎng)盒中，自由采食和飲水。

1.6 增重和存活率

在感染E.acervulina孢子化卵囊前和宰殺前分別逐個雞稱重，計算平均增重和相對增重率。試驗期間每天觀察雞只生活情況，對死亡雞，及時剖檢，判斷是否為球蟲感染引起的死亡，并記錄死亡數(shù)，計算存活率。

平均增重=宰殺前平均體重-感染卵囊前平均體重；

相對增重率(%)=試驗組平均增重/不感染不口服納米氧化鋅組平均增重×100%；

存活率(%)=組內(nèi)存活雞數(shù)/組內(nèi)總的雞數(shù)×100%。

1.7 排出卵囊數(shù)和卵囊值

收集感染后第4～7天排出的糞便，用麥克馬斯特法計算糞便卵囊數(shù)。宰殺后取十二指腸用消化液消化計算十二指腸中卵囊數(shù)。

排出卵囊數(shù)=試驗期排出糞便中卵囊數(shù)總和+十二指腸中卵囊數(shù)；

卵囊減少率(%)=(試驗組內(nèi)排出卵囊數(shù)-組內(nèi)感染不口服納米氧化鋅組排出卵囊數(shù))/組內(nèi)感染不口服納米氧化鋅組排出卵囊數(shù)×100%；

卵囊比數(shù)(%)=試驗組內(nèi)排出卵囊數(shù)/組內(nèi)感染不口服納米氧化鋅組排出卵囊數(shù)×100%；

如果卵囊比數(shù)為0%～1%時，則卵囊值為0；相應(yīng)卵囊比數(shù)為1%～25%、26%～50%、51%～75%、76%～100%，卵囊值分別記為5、10、20、40。

1.8 十二指腸病變記分

感染卵囊后第7天，宰殺全部試驗雞，逐個剖檢并觀察十二指腸病變，并按Johnson等[13]設(shè)計的病變記分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行病變記分。

病變值=病變記分×10。

1.9 抗球蟲指數(shù)

抗球蟲指數(shù)(anticoccidial indes，ACI)按下列公式進(jìn)行計算：

ACI=(存活率+相對增重率)-(病變值+卵囊值)。

1.10 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

各組試驗數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，經(jīng)SPSS軟件運行方差分析(One-way ANOVA)對各組數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果

2.1 增重和存活率

從雞只的增重方面來看，納米氧化鋅劑量篩選試驗結(jié)果顯示，口服5、10、20和30 mg的納米氧化鋅都能使10×104個孢子化卵囊感染的雞的增重顯著高于感染未口服納米氧化鋅組(P<0.05)，其中口服20 mg納米氧化鋅中的增重效果最好，相對增重率達(dá)到70.36%，與預(yù)試驗結(jié)果一致。口服20 mg納米氧化鋅抗不同感染劑量結(jié)果顯示，隨著感染劑量從1×104、2.5×104、5×104到10×104個卵囊的增加引起雞增重?fù)p失增加，而在口服20 mg納米氧化鋅后，其增重?fù)p失都能得到一定的減少，對超過5×104個卵囊的感染劑量減少增重的效果顯著(P<0.05)，甚至對低劑量的1×104個孢子化卵囊感染雞增重有一定促進(jìn)增重的作用，其相對增重率為101.73%，超過了空白對照組(表2)。增重結(jié)果說明，口服納米氧化鋅能明顯減少由于E.acervulina感染引起的增重?fù)p失，提高相對增重率。

從存活率方面來看，納米氧化鋅劑量篩選試驗結(jié)果顯示，口服5 mg的納米氧化鋅能將雞的存活率從87.5%增加到96.43%，20 mg以上時存活率達(dá)100%?？共煌腥緞┝吭囼灲Y(jié)果顯示，感染劑量達(dá)到2.5×104個卵囊以上就能引起試驗雞死亡(存活率96.67%)，說明E.acervulina對雞有致死作用，而口服20 mg納米氧化鋅能夠使雞的存活率達(dá)到100%，即減少雞只的死亡，增加了存活率。

表2 試驗雞增重、存活率、卵囊排出量、病變記分和ACI結(jié)果

2.2 排出卵囊數(shù)

納米氧化鋅劑量篩選試驗結(jié)果顯示，口服每種劑量的納米氧化鋅都能顯著減少卵囊排出數(shù)(P<0.05)，其中口服10 mg的效果最好，卵囊排出減少率36.45%，卵囊比數(shù)是4種劑量中最低為63.55；從卵囊值比較來看，每種劑量比未口服的卵囊值降低1個等級，從40降為20，但每種劑量間的卵囊值無影響。

抗不同感染劑量試驗結(jié)果顯示，口服納米氧化鋅能顯著降低1×104和10×104個孢子化卵囊感染雞排出卵囊數(shù)(P<0.05)，其中感染1×104個組的卵囊排出減少率為50.9%，卵囊值降低了2個等級，從40降為10；而對2.5×104和5×104個感染組的卵囊排出數(shù)(P>0.05)、卵囊排出減少率和卵囊值沒有明顯影響。

從排出卵囊數(shù)的結(jié)果說明，口服納米氧化鋅能夠降少感染雞的卵囊排出量，減少卵囊排出率，降低卵囊值。從感染而未口服納米氧化鋅各組排出卵囊數(shù)量來看，平均每個感染卵囊的產(chǎn)量會隨著感染卵囊的劑量降低逐漸增加。

2.3 十二指腸病變記分

納米氧化鋅劑量篩選試驗結(jié)果顯示，口服每種劑量的納米氧化鋅比未口服納米氧化鋅組十二指腸病變記分顯著降低(P<0.05)，其中口服30 mg的效果最好，病變記分降低最多，從平均2.71降為1.12分，而與口服20 mg納米氧化鋅間十二指腸病變記分差異不顯著(P>0.05)。

抗不同感染劑量試驗結(jié)果顯示，口服納米氧化鋅能使10×104、5×104和2.5×104個孢子化卵囊感染雞的十二指腸病變記分顯著減少(P<0.05)，其中對10×104感染雞組減輕的病變記分值最多，從2.71降為1.26分。

十二指腸病變記分結(jié)果說明，口服納米氧化鋅能減輕E.acervulina孢子化卵囊感染引起的雞十二指腸腸道損傷。

2.4 抗球蟲指數(shù)

根據(jù)試驗雞的相對增重率、存活率、卵囊值和病變值計算得到ACI，見表2。納米氧化鋅劑量篩選試驗結(jié)果顯示，隨著口服納米氧化鋅的劑量增加，對E.acervulina感染的防治效果越好，在20、30 mg/羽時效果較強，ACI值達(dá)到137.75和138.04，且每種劑量的ACI值都超過了120，說明口服納米氧化鋅雖然對控制球蟲的效果不滿意但仍可以用于抗球蟲感染?？共煌腥緞┝吭囼灲Y(jié)果顯示，隨著感染孢子化卵囊數(shù)量的減少，抗球蟲感染的效果有愈加明顯的趨勢；在感染劑量為1×104個卵囊時，ACI可達(dá)到180以上，起到了很好的防治球蟲效果，說明可用作抗球蟲藥。

3 討論

艾美耳球蟲孢子化卵囊進(jìn)入雞體后，釋放出的子孢子主要侵入十二指腸上皮細(xì)胞，子孢子、裂殖子、配子體等在腸道上皮細(xì)胞中反復(fù)大量增殖，從而導(dǎo)致絨毛上皮細(xì)胞變性、壞死，黏膜層萎縮、脫落[14]；使腸黏膜的完整性受到破壞，腸道黏膜受到損傷，黏膜細(xì)胞間連接增寬，通透性增加，進(jìn)而血漿蛋白漏入腸腔[15]；腸道平滑肌收縮蠕動變慢[16]；腸道黏膜損傷，也使得上皮細(xì)胞對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收減少；同時會引起腸道對蛋白[17]、脂肪消化吸收不良[18]，使鈣離子形成不溶性鈣皂，又使腸道對葡萄糖、鈣、鉀、鈉離子吸收能力下降，加之細(xì)胞崩解，使血鉀濃度升高，造成機體電解質(zhì)代謝紊亂等，導(dǎo)致雞的精神不佳，生長停滯，體重增長受到影響，嚴(yán)重感染時甚至引起死亡[19-21]。有研究發(fā)現(xiàn)E.acervulina感染能明顯影響雞的增重，而且隨著E.acervulina感染劑量的增加，增重減少更明顯[22-23]。本試驗研究也證明隨著E.acervulina孢子化卵囊感染劑量從1×104到10×104的增加，相對增重率從99.63%降到47.02%。

雞在感染球蟲的過程中，球蟲還會破壞機體抗氧化體系的平衡，使一些金屬酶類如超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶活性和VA、VC、VE、硒含量顯著降低，而丙二醛、過氧化氫含量升高，加劇了細(xì)胞的損傷[24-25]。若在飼糧中添加抗氧化劑物質(zhì)則可以提高雞體的抗氧化能力，降低丙二醛含量[26]，進(jìn)而改善腸道健康和抗氧化狀態(tài)，促進(jìn)球蟲感染雞的生長性能[27]。試驗結(jié)果也顯示，E.acervulina感染會使腸道病變隨感染劑量增加而加劇，增重效率降低。

為了改善感染雞的生長性能，在飼料中添加氧化鋅來補充因E.acervulina感染使肝臟中的金屬硫蛋白增加致雞體血清和血漿中Zn濃度的降低[28]，而導(dǎo)致的鋅缺乏是可行方法之一。通過飼料中添加鋅或含Zn2+物質(zhì)的方法可以減少腸炎引起的死亡率[10]，縮短藥物治愈球蟲病的時間[29]，改善球蟲感染造成的生長發(fā)育遲緩[30]。有研究顯示，高劑量的氧化鋅可以控制腸道病原微生物的生長[31]，改善腸道吸收率，增強抗氧化狀態(tài)[12]。然而，高劑量的氧化鋅會導(dǎo)致消化道微生態(tài)紊亂，且糞便中排出的鋅含量增加，造成環(huán)境污染危及人類健康[31-32]。納米氧化鋅則具有更高的生物利用率[33]，低濃度的納米氧化鋅就對奶牛小腸上皮細(xì)胞的增殖[34]和小鼠的細(xì)胞能量代謝有促進(jìn)作用，能促進(jìn)細(xì)胞生長，增強細(xì)胞蛋白代謝相關(guān)酶活，提高細(xì)胞蛋白的沉積；并能保護(hù)小鼠腸上皮細(xì)胞的完整性，減少細(xì)胞膜的脂質(zhì)過氧化，維持細(xì)胞的抗氧化酶活性，提高細(xì)胞抗氧化能力，減輕細(xì)胞的氧化損傷[35]。同時研究證實，納米氧化鋅具有通過細(xì)胞毒性作用等機制殺傷白血病細(xì)胞和多種腫瘤細(xì)胞的能力[36]。本試驗結(jié)果也說明飼料中添加納米氧化鋅不僅能提高E.acervulina感染雞的增重，減少腸道病變造成的損傷程度，而且能減少卵囊排出的數(shù)量。推測可能納米氧化鋅還對球蟲各繁殖階段蟲體有一定的殺滅作用。

綜上，本試驗研究證實，口服適量納米氧化鋅能夠改善E.acervulina感染雞的增重，減少死亡率，減少雞排出卵囊的數(shù)量，減輕十二指腸腸道的損傷。因而，飼喂合適劑量的納米氧化鋅可有效防治球蟲病。