金前躍，郭永剛，李俊朋，秦保亮，王寅彪，郭振華，杜永坤，萬博，邢廣旭，張改平,*

(1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物免疫學(xué)重點實驗室，河南 鄭州 450002；2.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院中英禽病國際研究中心，河南 鄭州 450002；3.江蘇高校動物重要疾病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 揚州 225009；4.河南牧業(yè)經(jīng)濟學(xué)院動物醫(yī)藥學(xué)院，河南 鄭州 450046；5.平頂山市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究中心，河南 平頂山 467001；6.新鄉(xiāng)市動物疫病預(yù)防控制中心，河南 新鄉(xiāng) 453003；7.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003；8.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450002)

鵝星狀病毒(goose astrovirus，GAstV)屬于星狀病毒科(Astrovirus)、禽星狀病毒屬(Avastrovirus)，是一種無囊膜、單股正鏈RNA病毒，呈二十面體結(jié)構(gòu)；基因組大小約6.1～7.9 kb，由1個5′非翻譯區(qū)、3個開放閱讀框(ORF)、1個3′非翻譯區(qū)和1個Poly A尾組成[1-3]。病毒主要編碼3種蛋白:ORF1a、ORF1b分別編碼蛋白酶和RNA聚合酶；ORF2編碼衣殼蛋白(capsid)，是病毒主要結(jié)構(gòu)蛋白[4-5]。

禽星狀病毒主要感染鴨、火雞、雞等，引起腸道疾病、肝炎、腎炎等[6-8]。當(dāng)前流行的鵝星狀病毒以雛鵝痛風(fēng)為特征病變，該病主要發(fā)生于2～25日齡雛鵝，常年可見，患病雛鵝精神沉郁、采食量減少、嚴(yán)重者死亡，死亡率最高可達50%，剖檢可見內(nèi)臟器官尿酸鹽沉積、腎炎、腳關(guān)節(jié)充滿白色漿液等病理變化[9-12]。

2017年以來，鵝星狀病毒感染引起的雛鵝痛風(fēng)在國內(nèi)多個省份如山東、江蘇、安徽、河南、黑龍江、廣東等地區(qū)暴發(fā)[13-16]，嚴(yán)重制約了當(dāng)?shù)仞B(yǎng)鵝產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

本研究借助分子生物學(xué)手段，對河南地區(qū)鵝星狀病毒疑似病料進行了RT-PCR檢測、序列測定、同源性及系統(tǒng)進化分析，獲得了河南地區(qū)鵝星狀病毒流行病學(xué)相關(guān)信息，為鵝痛風(fēng)病的有效防控提供了思路和線索。

1 材料與方法

1.1 病料

病料采自2018年河南省12個發(fā)病養(yǎng)鵝場患有痛風(fēng)的病鵝肝臟組織，主要分布在鄭州、焦作、新鄉(xiāng)、鶴壁、開封、商丘、許昌、平頂山、周口、漯河、駐馬店、信陽等地市(表1)。

1.2 主要試劑

青鏈霉素混合液購自Solarbio公司；DL2000 DNA Marker、DL5000 DNA Marker、病毒基因組提取試劑盒(MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScript RT Master Mix)購自TaKaRa公司；Q5超保真DNA聚合酶、dNTPs購自New England Biolabs；pEASY-Blunt Cloning Kit購自Transgen Biotech；通用型DNA純化回收試劑盒(Universial DNA Purificiation Kit)購自Tiangen。

表1 臨床樣品信息

1.3 病料的處理

無菌條件下取適量病料，以1∶3的質(zhì)量體積比加入含青鏈霉素的無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)徹底研磨。將組織研磨液收集于無菌Eppendorf管中，在-80 ℃和室溫間反復(fù)凍融3次，10 000 r/mim離心15 min，使用0.22 μm的濾器過濾上清液并凍存于-80 ℃冰箱。

1.4 RT-PCR檢測及測序

根據(jù)AstV/SDPY/Goose/1116/17毒株(GenBank登錄號：MH052598.1)的RNA聚合酶基因ORF1b序列分別設(shè)計檢測和測序引物。

檢測引物：上游序列為5′-ACCCCTGGTTATCCAAAATTTAAGT-3′，下游序列為5′-CCGCCAGAAGAGAGGCTTGGGCAAC-3′，預(yù)期片段大小為420 bp。測序引物：上游序列為5′-AAAAAACTAGATAAGGGGGACGATG-3′，下游序列為5′-TCACCAGATTTGAGAAAAGAAGTCG-3′，預(yù)期片段大小1 551 bp。

按照病毒核酸提取試劑盒說明書提取病毒總RNA，使用PrimeScript RT Master Mix進行反轉(zhuǎn)錄，獲取病毒cDNA作為PCR模板。PCR反應(yīng)為20 μL體系：模板、上下游引物各1 μL，DNA聚合酶10 μL，雙蒸水7 μL。

PCR檢測反應(yīng)條件為：頂蓋溫度99 ℃，預(yù)變性95 ℃ 5 min；變性95 ℃ 30 s，退火58 ℃ 30 s，延伸72 ℃、1 min，循環(huán)30次；72 ℃延伸10 min，4 ℃停止反應(yīng)。GAstV ORF1b陽性質(zhì)粒與PBS分別作為陽性對照及陰性對照。采用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳對PCR產(chǎn)物進行鑒定。

測序片段擴增條件為：頂蓋溫度99 ℃，預(yù)變性95 ℃ 5 min；變性95 ℃ 30 s，退火52 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 1 min 40 s，循環(huán)30次；72 ℃延伸10 min，4 ℃停止反應(yīng)。GAstV ORF1b陽性質(zhì)粒與PBS分別作為陽性對照及陰性對照。采用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳對PCR產(chǎn)物進行鑒定。擴增產(chǎn)物使用DNA純化回收試劑盒回收后，連接pEASY-Blunt載體送上海生工測序。

1.5 同源性及系統(tǒng)進化分析

利用DNAStar MegAlign軟件中的Clustal W method模塊，分析測序片段與GenBank中GAstV ORF1b片段的同源性；利用MEGA 6.06軟件中的Clustal W程序完成序列比對，并采用鄰接法(Neighbor-Joining tree)構(gòu)建遺傳進化樹，步長值(Bootstrap value)設(shè)置為1 000。

2 結(jié)果

2.1 臨床剖檢

患病雛鵝解剖后可見明顯的全身性內(nèi)臟痛風(fēng)癥狀，腎臟腫大、發(fā)白，輸尿管、膽囊內(nèi)均有尿酸鹽沉積，心臟、肝臟、腺胃、腸道也不同程度附著有白色尿酸鹽。

2.2 RT-PCR檢測

對來自河南省12個地市養(yǎng)鵝場的36份發(fā)病鵝肝臟樣品進行處理，分別提取核酸并反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，最后進行PCR檢測，結(jié)果均能擴增得到大小420 bp的條帶(圖1)，符合預(yù)期大小。統(tǒng)計結(jié)果顯示(表2)，36份樣品均為陽性，陽性率達100%。

M. DNA Marker；1～36.36份臨床樣品；P. 陽性對照；N. 陰性對照

表2 臨床樣品檢測結(jié)果

2.3 ORF1b基因擴增及測序

本研究從12個不同地市的陽性養(yǎng)鵝場各取1份樣品，提取核酸并反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，通過RT-PCR擴增獲得目的片段，瓊脂糖凝膠電泳鑒定結(jié)果顯示，片段條帶約1 551 bp(圖2)，符合預(yù)期大小。擴增產(chǎn)物連接pEASY-Blunt載體并測序，獲得的ORF1b 全長序列上傳至GenBank數(shù)據(jù)庫(表3)。

M. DNA Marker；1～12.12份臨床樣品；13.陽性對照；14. 陰性對照

2.4 同源性分析

將12個毒株ORF1b測序片段與GenBank中分離毒株的ORF1b片段進行同源性分析，結(jié)果顯示12個毒株間的核苷酸同源性為98.7%～99.9%，與河南地區(qū)的XX(MN337323)、AstV/HN01/Goose/0103/18(MN307114)、AstV/HB01/Goose/0123/19(MN307118)、AstV/AH01/Goose/0512/18(MN307115)等代表毒株核苷酸同源性為97.9%～99.5%，與國內(nèi)其他地區(qū)的GD(MG934571)、AstV/SDPY/Goose/1116/17(MN052598)、AAstV/Goose/CHN/2017/SD01(MF772821)等代表毒株核苷酸同源性為98.4%～99.7%(圖3)。

表3 測序毒株ORF1b信息

圖3 基于GAstV ORF1b基因的核苷酸同源性分析

2.5 系統(tǒng)進化分析

選取12個測序毒株ORF1b基因序列及61個參考序列(表4)，利用MEGA 6.06軟件構(gòu)建了遺傳進化樹(圖4)。系統(tǒng)進化分析顯示，測序分析的12份臨床樣品毒株，與河南省其他分離毒株及國內(nèi)當(dāng)前流行毒株，處于同一進化分支，屬于禽星狀病毒1群。

表4 構(gòu)建進化樹所用毒株信息

●本研究測序毒株

3 討論

鵝星狀病毒感染引起的雛鵝痛風(fēng)是一種新發(fā)傳染病，主要表現(xiàn)為雛鵝腎腫、全身臟器尿酸鹽沉積等癥狀，發(fā)病率和死亡率高，已成為養(yǎng)鵝產(chǎn)業(yè)的“頭號殺手”[9-16]。本研究對河南地區(qū)12個地市的疑似樣品進行檢測，結(jié)果顯示陽性率為100%，表明河南地區(qū)鵝星狀病毒感染較為廣泛，主要養(yǎng)殖區(qū)域需進一步加強防控力度。

本研究中的12個測序毒株與河南地區(qū)代表毒株核苷酸同源性在97%以上，與國內(nèi)其他地區(qū)代表毒株核苷酸同源性在98%以上，表明當(dāng)前河南地區(qū)流行的毒株較為一致，并且與國內(nèi)其他地區(qū)毒株相似。系統(tǒng)進化分析顯示，12份臨床樣品毒株，與河南省其他分離毒株及國內(nèi)當(dāng)前流行毒株，處于同一進化分支，屬于禽星狀病毒1群。由此可見，當(dāng)前流行的鵝星狀病毒傳播迅速，具有共同的遺傳學(xué)特征。

本研究的分子流行病學(xué)調(diào)查，明確了河南地區(qū)鵝星狀病毒流行情況，并對毒株進行了測序、同源性及系統(tǒng)進化分析，從分子水平分析了河南流行毒株的遺傳學(xué)特征，為有效開展鵝痛風(fēng)病的防控提供了參考。