金前躍，郭永剛，李俊朋，秦保亮，王寅彪，郭振華，杜永坤，萬(wàn)博，邢廣旭，張改平,*

(1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450002；2.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院中英禽病國(guó)際研究中心，河南 鄭州 450002；3.江蘇高校動(dòng)物重要疾病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 揚(yáng)州 225009；4.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院動(dòng)物醫(yī)藥學(xué)院，河南 鄭州 450046；5.平頂山市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究中心，河南 平頂山 467001；6.新鄉(xiāng)市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，河南 新鄉(xiāng) 453003；7.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003；8.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450002)

鵝星狀病毒(goose astrovirus，GAstV)屬于星狀病毒科(Astrovirus)、禽星狀病毒屬(Avastrovirus)，是一種無(wú)囊膜、單股正鏈RNA病毒，呈二十面體結(jié)構(gòu)；基因組大小約6.1～7.9 kb，由1個(gè)5′非翻譯區(qū)、3個(gè)開(kāi)放閱讀框(ORF)、1個(gè)3′非翻譯區(qū)和1個(gè)Poly A尾組成[1-3]。病毒主要編碼3種蛋白:ORF1a、ORF1b分別編碼蛋白酶和RNA聚合酶；ORF2編碼衣殼蛋白(capsid)，是病毒主要結(jié)構(gòu)蛋白[4-5]。

禽星狀病毒主要感染鴨、火雞、雞等，引起腸道疾病、肝炎、腎炎等[6-8]。當(dāng)前流行的鵝星狀病毒以雛鵝痛風(fēng)為特征病變，該病主要發(fā)生于2～25日齡雛鵝，常年可見(jiàn)，患病雛鵝精神沉郁、采食量減少、嚴(yán)重者死亡，死亡率最高可達(dá)50%，剖檢可見(jiàn)內(nèi)臟器官尿酸鹽沉積、腎炎、腳關(guān)節(jié)充滿(mǎn)白色漿液等病理變化[9-12]。

2017年以來(lái)，鵝星狀病毒感染引起的雛鵝痛風(fēng)在國(guó)內(nèi)多個(gè)省份如山東、江蘇、安徽、河南、黑龍江、廣東等地區(qū)暴發(fā)[13-16]，嚴(yán)重制約了當(dāng)?shù)仞B(yǎng)鵝產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

本研究借助分子生物學(xué)手段，對(duì)河南地區(qū)鵝星狀病毒疑似病料進(jìn)行了RT-PCR檢測(cè)、序列測(cè)定、同源性及系統(tǒng)進(jìn)化分析，獲得了河南地區(qū)鵝星狀病毒流行病學(xué)相關(guān)信息，為鵝痛風(fēng)病的有效防控提供了思路和線索。

1 材料與方法

1.1 病料

病料采自2018年河南省12個(gè)發(fā)病養(yǎng)鵝場(chǎng)患有痛風(fēng)的病鵝肝臟組織，主要分布在鄭州、焦作、新鄉(xiāng)、鶴壁、開(kāi)封、商丘、許昌、平頂山、周口、漯河、駐馬店、信陽(yáng)等地市(表1)。

1.2 主要試劑

青鏈霉素混合液購(gòu)自Solarbio公司；DL2000 DNA Marker、DL5000 DNA Marker、病毒基因組提取試劑盒(MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScript RT Master Mix)購(gòu)自TaKaRa公司；Q5超保真DNA聚合酶、dNTPs購(gòu)自New England Biolabs；pEASY-Blunt Cloning Kit購(gòu)自Transgen Biotech；通用型DNA純化回收試劑盒(Universial DNA Purificiation Kit)購(gòu)自Tiangen。

表1 臨床樣品信息

1.3 病料的處理

無(wú)菌條件下取適量病料，以1∶3的質(zhì)量體積比加入含青鏈霉素的無(wú)菌磷酸鹽緩沖液(PBS)徹底研磨。將組織研磨液收集于無(wú)菌Eppendorf管中，在-80 ℃和室溫間反復(fù)凍融3次，10 000 r/mim離心15 min，使用0.22 μm的濾器過(guò)濾上清液并凍存于-80 ℃冰箱。

1.4 RT-PCR檢測(cè)及測(cè)序

根據(jù)AstV/SDPY/Goose/1116/17毒株(GenBank登錄號(hào)：MH052598.1)的RNA聚合酶基因ORF1b序列分別設(shè)計(jì)檢測(cè)和測(cè)序引物。

檢測(cè)引物：上游序列為5′-ACCCCTGGTTATCCAAAATTTAAGT-3′，下游序列為5′-CCGCCAGAAGAGAGGCTTGGGCAAC-3′，預(yù)期片段大小為420 bp。測(cè)序引物：上游序列為5′-AAAAAACTAGATAAGGGGGACGATG-3′，下游序列為5′-TCACCAGATTTGAGAAAAGAAGTCG-3′，預(yù)期片段大小1 551 bp。

按照病毒核酸提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取病毒總RNA，使用PrimeScript RT Master Mix進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲取病毒cDNA作為PCR模板。PCR反應(yīng)為20 μL體系：模板、上下游引物各1 μL，DNA聚合酶10 μL，雙蒸水7 μL。

PCR檢測(cè)反應(yīng)條件為：頂蓋溫度99 ℃，預(yù)變性95 ℃ 5 min；變性95 ℃ 30 s，退火58 ℃ 30 s，延伸72 ℃、1 min，循環(huán)30次；72 ℃延伸10 min，4 ℃停止反應(yīng)。GAstV ORF1b陽(yáng)性質(zhì)粒與PBS分別作為陽(yáng)性對(duì)照及陰性對(duì)照。采用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行鑒定。

測(cè)序片段擴(kuò)增條件為：頂蓋溫度99 ℃，預(yù)變性95 ℃ 5 min；變性95 ℃ 30 s，退火52 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 1 min 40 s，循環(huán)30次；72 ℃延伸10 min，4 ℃停止反應(yīng)。GAstV ORF1b陽(yáng)性質(zhì)粒與PBS分別作為陽(yáng)性對(duì)照及陰性對(duì)照。采用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行鑒定。擴(kuò)增產(chǎn)物使用DNA純化回收試劑盒回收后，連接pEASY-Blunt載體送上海生工測(cè)序。

1.5 同源性及系統(tǒng)進(jìn)化分析

利用DNAStar MegAlign軟件中的Clustal W method模塊，分析測(cè)序片段與GenBank中GAstV ORF1b片段的同源性；利用MEGA 6.06軟件中的Clustal W程序完成序列比對(duì)，并采用鄰接法(Neighbor-Joining tree)構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹(shù)，步長(zhǎng)值(Bootstrap value)設(shè)置為1 000。

2 結(jié)果

2.1 臨床剖檢

患病雛鵝解剖后可見(jiàn)明顯的全身性?xún)?nèi)臟痛風(fēng)癥狀，腎臟腫大、發(fā)白，輸尿管、膽囊內(nèi)均有尿酸鹽沉積，心臟、肝臟、腺胃、腸道也不同程度附著有白色尿酸鹽。

2.2 RT-PCR檢測(cè)

對(duì)來(lái)自河南省12個(gè)地市養(yǎng)鵝場(chǎng)的36份發(fā)病鵝肝臟樣品進(jìn)行處理，分別提取核酸并反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，最后進(jìn)行PCR檢測(cè)，結(jié)果均能擴(kuò)增得到大小420 bp的條帶(圖1)，符合預(yù)期大小。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示(表2)，36份樣品均為陽(yáng)性，陽(yáng)性率達(dá)100%。

M. DNA Marker；1～36.36份臨床樣品；P. 陽(yáng)性對(duì)照；N. 陰性對(duì)照

表2 臨床樣品檢測(cè)結(jié)果

2.3 ORF1b基因擴(kuò)增及測(cè)序

本研究從12個(gè)不同地市的陽(yáng)性養(yǎng)鵝場(chǎng)各取1份樣品，提取核酸并反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增獲得目的片段，瓊脂糖凝膠電泳鑒定結(jié)果顯示，片段條帶約1 551 bp(圖2)，符合預(yù)期大小。擴(kuò)增產(chǎn)物連接pEASY-Blunt載體并測(cè)序，獲得的ORF1b 全長(zhǎng)序列上傳至GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)(表3)。

M. DNA Marker；1～12.12份臨床樣品；13.陽(yáng)性對(duì)照；14. 陰性對(duì)照

2.4 同源性分析

將12個(gè)毒株ORF1b測(cè)序片段與GenBank中分離毒株的ORF1b片段進(jìn)行同源性分析，結(jié)果顯示12個(gè)毒株間的核苷酸同源性為98.7%～99.9%，與河南地區(qū)的XX(MN337323)、AstV/HN01/Goose/0103/18(MN307114)、AstV/HB01/Goose/0123/19(MN307118)、AstV/AH01/Goose/0512/18(MN307115)等代表毒株核苷酸同源性為97.9%～99.5%，與國(guó)內(nèi)其他地區(qū)的GD(MG934571)、AstV/SDPY/Goose/1116/17(MN052598)、AAstV/Goose/CHN/2017/SD01(MF772821)等代表毒株核苷酸同源性為98.4%～99.7%(圖3)。

表3 測(cè)序毒株ORF1b信息

圖3 基于GAstV ORF1b基因的核苷酸同源性分析

2.5 系統(tǒng)進(jìn)化分析

選取12個(gè)測(cè)序毒株ORF1b基因序列及61個(gè)參考序列(表4)，利用MEGA 6.06軟件構(gòu)建了遺傳進(jìn)化樹(shù)(圖4)。系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示，測(cè)序分析的12份臨床樣品毒株，與河南省其他分離毒株及國(guó)內(nèi)當(dāng)前流行毒株，處于同一進(jìn)化分支，屬于禽星狀病毒1群。

表4 構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)所用毒株信息

●本研究測(cè)序毒株

3 討論

鵝星狀病毒感染引起的雛鵝痛風(fēng)是一種新發(fā)傳染病，主要表現(xiàn)為雛鵝腎腫、全身臟器尿酸鹽沉積等癥狀，發(fā)病率和死亡率高，已成為養(yǎng)鵝產(chǎn)業(yè)的“頭號(hào)殺手”[9-16]。本研究對(duì)河南地區(qū)12個(gè)地市的疑似樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示陽(yáng)性率為100%，表明河南地區(qū)鵝星狀病毒感染較為廣泛，主要養(yǎng)殖區(qū)域需進(jìn)一步加強(qiáng)防控力度。

本研究中的12個(gè)測(cè)序毒株與河南地區(qū)代表毒株核苷酸同源性在97%以上，與國(guó)內(nèi)其他地區(qū)代表毒株核苷酸同源性在98%以上，表明當(dāng)前河南地區(qū)流行的毒株較為一致，并且與國(guó)內(nèi)其他地區(qū)毒株相似。系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示，12份臨床樣品毒株，與河南省其他分離毒株及國(guó)內(nèi)當(dāng)前流行毒株，處于同一進(jìn)化分支，屬于禽星狀病毒1群。由此可見(jiàn)，當(dāng)前流行的鵝星狀病毒傳播迅速，具有共同的遺傳學(xué)特征。

本研究的分子流行病學(xué)調(diào)查，明確了河南地區(qū)鵝星狀病毒流行情況，并對(duì)毒株進(jìn)行了測(cè)序、同源性及系統(tǒng)進(jìn)化分析，從分子水平分析了河南流行毒株的遺傳學(xué)特征，為有效開(kāi)展鵝痛風(fēng)病的防控提供了參考。