高瑞平，梁 琪*，白莉莉

（甘肅農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，甘肅省功能乳品工程實驗室，甘肅 蘭州 730070）

干酪生產(chǎn)過程中會產(chǎn)生副產(chǎn)物乳清廢液[1]，而廢液中的乳清蛋白是一種營養(yǎng)價值極高、具有多種功能特性的蛋白源[2]。這種生產(chǎn)干酪得到的乳清稱為甜乳清，另一種通過酸沉淀得到的乳清稱為酸乳清，也稱原乳清。商業(yè)化乳清蛋白產(chǎn)品主要以乳清蛋白濃縮物（whey protein concentrate，WPC）和乳清蛋白分離物（whey protein isolation，WPI）為主，超濾是目前用于生產(chǎn)WPC和WPI的核心技術(shù)手段，可以制備出不同蛋白含量的產(chǎn)品[3]。WPC由于其具有較好的功能特性，例如乳化性、起泡性等，已成為現(xiàn)代食品加工中重要的蛋白來源[4]。

國內(nèi)外學者對各類WPC的功能特性進行了相關(guān)研究。Heino等[5]對原乳清蛋白濃縮物（native whey protein concentrate，NWPC）和甜乳清蛋白濃縮物（sweet whey protein concentrate，SWPC）功能特性的研究結(jié)果表明，干燥方式對WPC功能特性無顯著影響，SWPC溶解性、持水性和乳化性較好。Svanborg等[6]研究通過膜處理原乳清液得到WPC的起泡性和乳化性，結(jié)果表明，原乳清液可能是生產(chǎn)WPC的潛在來源，具有與通過干酪生產(chǎn)獲得的WPC相同的組成和功能性質(zhì)。早期有學者對乳清蛋白純品以及乳清蛋白混入其他體系后乳化性進行研究[7]，結(jié)果表明決定其乳化特性的重要因素是蛋白質(zhì)濃度、pH值、離子強度、鈣和乳糖濃度，以及加工條件和儲存條件[8]。Gazi等[9]對蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)在35%～87%的WPC的溶解性研究結(jié)果表明，WPC具有較好的溶解特性，隨著蛋白含量增加，溶解性也隨之提高。Sodini等[10]研究pH值和熱處理對酸奶中WPC功能特性的影響，結(jié)果表明熱處理的WPC可以提高酸奶的持水性能。

在工業(yè)生產(chǎn)過程中的熱處理環(huán)節(jié)，牛乳蛋白的物化性質(zhì)及分子結(jié)構(gòu)都會發(fā)生相應(yīng)改變，從而影響產(chǎn)品質(zhì)量，主要是由于在70 ℃以上溫度加熱時，引起乳清蛋白的熱變性，特別是β-乳球蛋白（β-lactoglobulin，β-Lg）與κ-酪蛋白形成二硫鍵發(fā)生聚合附著在膠束表面[11]。楊楠等[12]研究對比了牦牛脫脂乳、純酪蛋白溶液經(jīng)過不同溫度（30～90 ℃）的熱處理，兩者相關(guān)功能特性（熱穩(wěn)定性、乳化性）的變化。結(jié)果表明隨著熱處理溫度的上升，由于乳清蛋白與酪蛋白的相互作用及酪蛋白自身發(fā)生離解、聚集過程，導(dǎo)致脫脂乳和酪蛋白溶液的熱穩(wěn)定性下降、乳化性降低、濁度增大。

牦牛乳是青藏高原地區(qū)的優(yōu)質(zhì)乳源，近年來，隨著我國牦牛乳乳品企業(yè)的相繼建立，在加大乳產(chǎn)量的同時，產(chǎn)生的乳清廢液的利用管理成為牦牛乳品企業(yè)面臨的一大難題。目前市售荷斯坦牛乳的WPC產(chǎn)品，蛋白含量越高，價值也越高，廣泛應(yīng)用于嬰兒配方奶粉、酸奶以及健身食品中，尤其嬰兒配方奶粉需要高蛋白含量的WPC，我國還依靠國外進口為主。對牦牛WPC的功能特性分析具有很高的研究價值。本實驗對不同截留分子質(zhì)量膜處理獲取的牦牛WPC溶解性、持水性、持油性、乳化性和起泡性等功能特性進行系統(tǒng)性比較研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮牦牛乳采自甘肅天?？h抓喜秀龍鄉(xiāng)。所有有機溶劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

AL204電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；SP-723紫外-可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司；PHS-3C型pH計 上海儀電科學儀器股份有限公司；SH220N石墨消解儀 濟南海能儀器有限公司；SKD-200凱氏定氮儀 上海沛歐分析儀器有限公司；SCIENTZ-10ND冷凍干燥機、XHF-D高速分散器 寧波新芝生物科技股份有限公司；QL-866旋渦混合器 海門市其林貝爾儀器制造有限公司；L500醫(yī)用離心機 湘儀離心機儀器有限公司；WTM-1812G卷式膜設(shè)備 杭州沃騰膜工程有限公司；再生纖維素RC型透析袋 上海源葉生物有限公司。

1.3 方法

1.3.1 牦牛乳主要成分及理化指標測定

蛋白質(zhì)：參考GB 5009.5—2016《食品中蛋白質(zhì)的測定》中凱氏定氮法；乳脂肪：GB 5413.3—2010《嬰幼兒食品和乳品中脂肪測定》中蓋勃氏乳脂計法測定；乳糖：SN/T 0871—2012《出口乳及乳制品中乳糖的測定》中的分光光度計法；酸度：pH計進行測定。

1.3.2 樣品制備

1.3.2.1 牦牛乳NWPC的制備

采用陳婷[13]和Macedo[14]等的方法作適當修改。鮮牦牛乳10 000 r/min離心30 min脫脂，調(diào)節(jié)pH 4.6等電點沉淀，3 500 r/min離心20 min，收集上清液，即為原乳清液，經(jīng)截留分子質(zhì)量3 500 Da的卷式膜超濾濃縮得到NWPC，直接真空冷凍干燥制取的粉制品即為NWPC1；濃縮液經(jīng)5 000 Da的透析袋透析過夜，凍干得到NWPC2；濃縮液經(jīng)10 000 Da的透析袋透析過夜，凍干得到NWPC3。

1.3.2.2 牦牛乳SWPC的制備

在實驗室條件下手工制作牦牛乳硬質(zhì)干酪生產(chǎn)過程中收集的乳清廢液，經(jīng)截留分子質(zhì)量3 500 Da的卷式膜超濾濃縮得到SWPC，直接真空冷凍干燥制取的粉制品即為SWPC1；按照NWPC2和NWPC3相同步驟分布制取SWPC2、SWPC3。

1.3.3 WPC主要成分測定

蛋白質(zhì)：參考GB 5009.5—2016中凱氏定氮法；乳糖：參考SN/T 0871—2012中的分光光度計法；酸度：pH計進行測定。

1.3.4 WPC功能指標測定

1.3.4.1 持水性和持油性的測定

采用Palatnik等[15]的方法作適當修改。持水性：用預(yù)先稱量過的離心管準確稱取2.0 g樣品，緩慢加水，每加幾滴水，用旋渦混合器混合幾分鐘，直至樣品呈漿狀且無水析出時為止，于10 000 r/min離心3 min，倒去上層清液，稱量。離心后若無上清液，再加水攪勻離心，直至離心后有少量上清液為止。持水性表示每克樣品中吸收水并保持水的質(zhì)量，計算公式如下：

式中：m1為空試管的質(zhì)量/g；m2為試管加樣品的質(zhì)量/g；m3為沉淀物加試管的質(zhì)量/g。

持油性：1 g（精確到0.001 g）樣品溶于含25 mL大豆色拉油的離心管，用旋渦混合器混合30 s。油混合物在4 200 r/min離心30 min。測定分離出的油體積，持油性表示為每克蛋白質(zhì)樣品吸收油的體積，計算公式如下：

式中：V0為25 mL；V1為離心出油的體積/mL；m為樣品質(zhì)量/g。

1.3.4.2 乳化性的測定

采用Pearce等[16]的方法作適當修改。取0.02 g/mL樣品溶液21 mL，邊攪拌邊加入純大豆色拉油9 mL，然后以10 000 r/min高速勻漿1 min制成乳狀液，乳狀液放置10 min，從玻璃容器底部取100 μL乳化液加入到5 mL、0.1%的十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）溶液中混勻，利用紫外-可見分光光度計于波長500 nm處測吸光度，用0.1%的SDS溶液為空白調(diào)零。乳化活性指數(shù)（emulsifying activity index，EAI）和乳化穩(wěn)定指數(shù)（emulsifying stability index，ESI）計算公式如下：

式中：C為樣品溶液濃度；φ為油相所占的體積分數(shù)（2%）；A500nm為500 nm波長處的吸光度；D為樣品稀釋倍數(shù)；A0為0時刻的吸光度；A10為10 min后的吸光度。

1.3.4.3 起泡性的測定

采用Motoi等[17]的方法作適當修改。取40 mL 0.02 g/mL的樣品，用內(nèi)切式高速分散器在10 000 r/min攪打1 min，快速將泡沫轉(zhuǎn)移至量筒中，測量攪打后的泡沫體積和靜置10 min的泡沫體積。起泡能力用經(jīng)攪打后蛋白質(zhì)分散物的體積增加量表示。泡沫穩(wěn)定性按下式計算：

式中：V0為攪打后泡沫的體積/mL；V10為放置10 min后的泡沫體積/mL；V為攪打前樣品溶液的體積/mL。

1.3.4.4 溶解性的測定

采用Luo等[18]的方法作適當修改。配制0.05 g/mL的乳清蛋白溶液，25 ℃恒溫振蕩1 h，10 000 r/min離心5 min，得上清液。用凱氏定氮法測定上清液的蛋白含量，每個樣品重復(fù)實驗3 次，溶解性按下式計算：

1.3.4.5 熱穩(wěn)定性的測定

采用Meng等[19]的方法作適當修改，測定依據(jù)是在熱處理時蛋白在溶液中的溶解程度。將質(zhì)量濃度為0.02 g/mL的乳清蛋白溶液分別在60、65、70、75、80、85、90、95 ℃水浴加熱30 min。取出后立即冰浴2 min，恢復(fù)至室溫。然后稱取熱處理后的溶液于2 500 r/min離心10 min，倒出上層溶液，稱取下層沉淀物質(zhì)量，計算比較沉淀量與蛋白溶液的比例。沉淀量越大，穩(wěn)定性越差。沉淀率計算公式如下：

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

數(shù)據(jù)采用Origin 8.0與SPSS 17.0軟件進行處理，采用Duncan多重比較方法進行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 牦牛乳主要成分含量及理化指標分析

由表1可看出，牦牛乳蛋白含量和脂肪含量較高，其pH值約為6.55。

表1 牦牛乳中主要成分含量及理化指標Table 1Major components and physicochemical characteristics of yak milk

2.2 牦牛WPC主要成分分析

根據(jù)膜對不同蛋白質(zhì)分子質(zhì)量的截留程度選擇性過濾乳糖、礦物質(zhì)、水分和低分子質(zhì)量化合物等物質(zhì)[20]。由表2可知，經(jīng)同一膜處理的牦牛WPC乳糖含量無顯著差異（P＞0.05），pH值差異顯著（P＜0.05），蛋白質(zhì)含量差異顯著（P＜0.05），牦牛NWPC1、NWPC2、NWPC3總蛋白質(zhì)量分數(shù)分別為14.708%、31.778%、81.432%，牦牛SWPC1、SWPC2、SWPC3總蛋白質(zhì)量分數(shù)分別為22.905%、38.680%、84.898%，經(jīng)10 000 Da膜截留得到的牦牛NWPC3蛋白含量約為NWPC1的5.5 倍，NWPC2的2.6 倍，牦牛SWPC3蛋白含量約為SWPC1的3.7 倍，SWPC2的2.2 倍。Alsaed等[21]研究指出，產(chǎn)生這種蛋白差異主要原因是牦牛甜乳清液通過生產(chǎn)酶凝型硬質(zhì)干酪獲得，添加的凝乳酶促進凝乳，凝乳酶切割κ-酪蛋白的Phe105-Met106鍵，產(chǎn)生p-κ-酪蛋白和糖巨肽，p-κ-酪蛋白附著在酪蛋白膠束的表面進入干酪中，而糖巨肽則留在乳清液中，因此經(jīng)同一規(guī)格膜處理的牦牛SWPC總蛋白含量高于牦牛NWPC總蛋白含量；不同膜處理的牦牛WPC其乳糖含量、蛋白含量存在顯著性差異（P＜0.05），隨著膜截留分子質(zhì)量的增大，牦牛WPC乳糖呈顯著下降（P＜0.05），WPC3中均不含乳糖，蛋白質(zhì)含量呈現(xiàn)上升的趨勢，說明蛋白純化效果顯著。

表2 WPC主要成分Table 2 Major components of WPCs

2.3 牦牛WPC溶解性分析

由圖1可知，隨著處理膜截留分子質(zhì)量的增大，牦牛WPC的溶解性隨之增高，這主要因為隨著截留分子質(zhì)量的增加，牦牛WPC蛋白質(zhì)含量升高。De Castro-Morel等[22]研究得，同一pH值條件下，蛋白質(zhì)含量的高低影響荷斯坦牛乳WPC的溶解性，WPC80的溶解性顯著高于WPC35。牦牛NWPC和SWPC的溶解性差異顯著（P＜0.05），用3 500 Da卷式膜和5 000 Da再生纖維素膜過濾得到的牦牛NWPC溶解性高于牦牛SWPC，這主要的原因是牦牛SWPC使用的干酪乳清液在制作干酪過程中經(jīng)過了熱處理環(huán)節(jié)。有學者對荷斯坦牛乳蛋白粉的相互作用研究表明[23]，熱處理導(dǎo)致乳清蛋白和酪蛋白發(fā)生不同程度的聚集，聚集物主要是乳清蛋白和κ-酪蛋白之間以二硫鍵形式結(jié)合，形成酪蛋白膠束，使得乳蛋白粉溶解性降低，影響乳蛋白粉功能特性。該研究結(jié)果也闡明牦牛NWPC和牦牛SWPC在溶解性上的差異。用10 000 Da再生纖維素膜透析得到的牦牛WPC因其純度均較高，溶解性顯著增高，牦牛SWPC的溶解性顯著高于牦牛NWPC的溶解性，說明乳清蛋白含量越高，溶解性越高。

圖1 牦牛WPC的溶解性Fig.1 Solubility of yak WPCs

2.4 牦牛WPC持水性分析

由圖2可知，3 種不同截留分子質(zhì)量膜處理獲得的牦牛NWPC持水性顯著高于SWPC，有研究報道[4]熱處理可以降低蛋白質(zhì)和水的結(jié)合能力，同時因乳清蛋白是熱敏性蛋白，部分乳清蛋白變性聚集，降低了蛋白質(zhì)和水的結(jié)合能力，從而降低了蛋白質(zhì)的持水性能，外部因素對WPC內(nèi)部結(jié)構(gòu)和聚集狀態(tài)的影響同時決定其功能特性的變化[24]。隨著處理膜截留分子質(zhì)量的增大，牦牛WPC持水性呈現(xiàn)顯著上升的趨勢，蛋白質(zhì)含量的增高導(dǎo)致蛋白質(zhì)-水作用增強，從而使得持水性增強。持水性是乳產(chǎn)品經(jīng)常被需求的一種功能特性，工業(yè)上利用乳清蛋白的持水性能將其應(yīng)用于肉類食品中，以提高肉類產(chǎn)品的保水性[25]。

圖2 牦牛WPC的持水性Fig.2 WHC of yak WPCs

2.5 牦牛WPC持油性分析

由圖3可知，3 500 Da卷式膜和5 000 Da再生纖維素膜過濾得到的牦牛NWPC和SWPC間無顯著差異（P＞0.05）；隨著處理膜截留分子質(zhì)量的增大，牦牛WPC持油性顯著增高；蛋白質(zhì)的吸油性是指蛋白質(zhì)在一定加工條件下保持油脂的能力，是蛋白質(zhì)的功能特性之一，乳清蛋白常作為脂肪類似物應(yīng)用在肉類、焙烤食品中，WPC良好的持油性和持水性能對改善食品口感，包括硬度、黏度等物性指標有重要意義，有利于完善組織化產(chǎn)品的感官品質(zhì)和功能品質(zhì)[26]，同時這也是WPC的商業(yè)利用途徑之一。

圖3 牦牛WPC的持油性Fig.3 OHC of yak WPCs

2.6 牦牛WPC起泡能力和泡沫穩(wěn)定性分析

由圖4可知，牦牛NWPC和SWPC起泡能力存在顯著差異（P＜0.05），Kamath等[27]研究不同處理溫度下荷斯坦牛乳脫脂乳泡沫界面物質(zhì)組成的結(jié)果指出WPC在生產(chǎn)乳清液環(huán)節(jié)之前，牛乳經(jīng)過巴氏殺菌處理，形成酪蛋白膠束，膠束和變性的乳清蛋白以二硫鍵結(jié)合，分散在氣泡表面，增強WPC的起泡能力。牦牛SWPC起泡能力顯著高于NWPC。隨著獲得的牦牛WPC蛋白含量的增高，起泡能力呈現(xiàn)顯著增高的趨勢，這與界面分散更多的蛋白分子有關(guān)，因此，高蛋白含量的牦牛WPC起泡能力較好。牦牛WPC泡沫穩(wěn)定性隨著蛋白質(zhì)含量的升高，變化趨勢和牦牛WPC起泡能力一致，該現(xiàn)象與有學者研究的不同物質(zhì)對荷斯坦牛乳脫脂乳起泡性能改善的結(jié)果一致[28]，說明隨著牦牛WPC濃度的升高，泡沫穩(wěn)定性表現(xiàn)顯著增強的效果。

圖4 牦牛WPC的起泡能力和泡沫穩(wěn)定性Fig.4 Foam capacity and stability of yak WPCs

2.7 牦牛WPC乳化活性和乳化穩(wěn)定性分析

由圖5可知，牦牛NWPC1和牦牛SWPC1有顯著差異（P＜0.05），隨著處理膜截留分子質(zhì)量的增大，牦牛WPC的EAI呈現(xiàn)顯著增強的趨勢（P＜0.05），牦牛WPC的EAI增加趨勢和蛋白含量增加趨勢一致。牦牛SWPC的ESI顯著高于NWPC，差異主要來源于牦牛SWPC經(jīng)過熱處理，Dybowska[29]對荷斯坦牛乳WPC研究結(jié)果表明，WPC經(jīng)過不同條件下的熱處理，會發(fā)生不同程度的聚集行為，可能會產(chǎn)生穩(wěn)定的納米顆粒和聚集體，聚集蛋白可能已經(jīng)形成了較厚的蛋白質(zhì)膜，因此這些小聚集體都可以穩(wěn)定乳液；當?shù)鞍滓簼舛仍龈邥r，分散相黏度較高，使脂肪流動最小化，從而延遲了乳化過程。當?shù)鞍诐舛仍礁邥r，不但增加了乳液的黏度，而且為脂滴涂布提供了更多的蛋白質(zhì)，因此其ESI增高[30]。這和牦牛WPC的ESI變化趨勢一致，可以作為牦牛WPC的ESI變化的理論解釋。

圖5 牦牛WPC的EAI和ESIFig.5 EAI and ESI of yak WPCs

2.8 牦牛WPC熱穩(wěn)定性分析

由圖6可知，牦牛WPC在60 ℃時均有沉淀產(chǎn)生，說明在60 ℃熱處理30 min牦牛WPC開始變性。牦牛NWPC2、NWPC3、SWPC2和SWPC3在70 ℃以上，沉淀率顯著增大（P＜0.05），85 ℃沉淀率最大，NWPC3、SWPC3沉淀率分別為0.424%、0.409%，85～95 ℃，沉淀率變化緩慢；牦牛NWPC1和SWPC1沉淀率變化緩慢，在85 ℃達到最大沉淀率，當熱處理溫度高于85 ℃沉淀率變化緩慢（P＞0.05）。Dickow等[31]對荷斯坦牛乳WPC的研究發(fā)現(xiàn)，荷斯坦牛乳WPC在60 ℃開始變性，β-Lg開始聚集；當熱處理溫度增加至70 ℃時，β-Lg肽鏈展開，在80 ℃熱處理時，β-Lg結(jié)構(gòu)改變，開始變性，處理溫度到90 ℃以后，β-Lg全部變性。Brodkorb等[32]研究發(fā)現(xiàn)，荷斯坦牛乳乳清蛋白在80 ℃時最不穩(wěn)定，當熱處理溫度達90 ℃時，熱穩(wěn)定性趨于穩(wěn)定，原因是α-La分子展開，疏水基團巰基大量暴露在分子表面，和變性β-Lg以二硫鍵交聯(lián)形成膠束，而形成的膠束物質(zhì)具有較好的熱穩(wěn)定性，熱穩(wěn)定性趨于穩(wěn)定。這與本實驗牦牛WPC熱穩(wěn)定性的變化趨勢一致，但是實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)牦牛WPC的最不穩(wěn)定溫度為85 ℃，高于荷斯坦牛乳WPC的80 ℃。牦牛SWPC1、SWPC2和SWPC3熱穩(wěn)定性顯著高于牦牛NWPC1、NWPC2和NWPC3，說明加工干酪階段的熱處理會適當改善牦牛WPC的熱穩(wěn)定性。

圖6 牦牛WPC的熱穩(wěn)定性Fig.6 Thermal stability of yak WPCs

3 結(jié) 論

不同截留分子質(zhì)量膜生產(chǎn)得到不同蛋白含量的牦牛WPC主要成分和功能特性差異顯著，10 000 Da透析膜得到的牦牛NWPC和SWPC總蛋白質(zhì)含量均達到80%以上，且無乳糖殘留，同時，其功能特性（溶解性、持水性、持油性、起泡性和乳化性）均顯著高于其他膜分離得到的牦牛WPC，說明10 000 Da透析膜生產(chǎn)的牦牛WPC純度較高，其總蛋白含量高，功能特性突出，應(yīng)用前景較好。獲取不同蛋白含量的牦牛SWPC其起泡能力、泡沫穩(wěn)定性、乳化活性、乳化穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性均顯著高于NWPC，說明熱處理會適當改善牦牛WPC的起泡性能、乳化性能和熱穩(wěn)定性，從而拓寬牦牛WPC的應(yīng)用范圍；通過膜處理獲取蛋白含量較高的牦牛WPC，功能特性較好，應(yīng)用領(lǐng)域廣泛，這對解決牦牛乳清資源的利用問題、保護環(huán)境、提高企業(yè)的經(jīng)濟效益起到關(guān)鍵性作用。