陳珍金，張 璜，石 磊，葉 蕾，蔡凱賢，顏棟林，韋 濤，謝耐珍，陳小聰,*

（1.暨南大學(xué)食品安全與營養(yǎng)研究院，廣東 廣州 510632；2.廣州雙螺旋基因技術(shù)有限公司，廣東 廣州 510000；3.廣西東盟食品藥品檢驗檢測中心，廣西 南寧 530000）

肉類摻假的歷史非常悠久，自古代起就有“掛羊頭賣狗肉”的說法[1]。時至今日，從歐洲馬肉事件到近期報道的鼠肉冒充羊肉串等羊肉制品以及假冒偽劣的牛肉等事件，“肉類摻假”不停地沖擊著食品安全體系，給社會帶來了巨大的負(fù)面影響[2-3]。其中最值得關(guān)注的是羊肉制品的鼠肉摻假事件，雖然我國的食品監(jiān)察管理部門針對鼠肉摻假等一系列問題進(jìn)行嚴(yán)格的篩查，但是我國在鑒別肉類摻假方面尚未有完善的檢測標(biāo)準(zhǔn)和監(jiān)察體系[1,4-5]，尤其像鼠肉這種特殊的肉源性成分，且由于肉類產(chǎn)品具有產(chǎn)品流通量大和常溫下貯藏保質(zhì)期短等特點[6]，在實驗室條件下常用的定量和定性檢測方法很難滿足實時、快捷、大批量的產(chǎn)品檢測需求，因此亟需開發(fā)出快速、簡易、準(zhǔn)確、便捷的肉源性成分快速檢測技術(shù)及產(chǎn)品。

目前，對肉類制品中的種屬鑒定主要包括高效液相色譜、等電聚焦電泳和酶聯(lián)免疫測定等客觀儀器分析技術(shù)檢測方法[7-12]，但都因為其檢測方法靈敏度低、操作周期長、操作要求高等劣勢而未被基層廣泛推廣使用。以DNA為目標(biāo)的動物種屬鑒定是當(dāng)前普遍使用的肉類摻假分子生物學(xué)檢測方法，實時聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-time polymerase chain reaction，real-time PCR）和微滴式數(shù)字PCR等PCR檢測方法憑借其特異性強(qiáng)、靈敏度高等特點，且由于其具有高時效性和高準(zhǔn)確性，已經(jīng)逐漸取代了常規(guī)PCR檢測技術(shù)，成為肉類種屬鑒定的主要檢測方法[13-17]。但是real-time PCR和微滴式數(shù)字PCR需使用昂貴的儀器設(shè)備作為實驗支撐，檢測成本相對較高，且反應(yīng)過程需要升降溫，導(dǎo)致該檢測技術(shù)不能很好應(yīng)用于廣大基層單位[18-19]。因此，亟待研究開發(fā)一種快速準(zhǔn)確、性價比高、恒溫且易于廣大基層單位操作的分子檢測方法，為廣大基層單位肉制品摻假診斷提供新的選擇。

環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）作為近幾年來的新型核酸擴(kuò)增技術(shù)，克服了傳統(tǒng)PCR、real-time PCR和微滴式數(shù)字PCR等PCR檢測方法反復(fù)升降溫且檢測周期相對較長的缺點，利用BstDNA聚合酶和根據(jù)特定靶序列設(shè)計的3 對特殊的內(nèi)、外、環(huán)引物，特異性識別靶序列上的6 個獨立區(qū)域，啟動循環(huán)鏈置換反應(yīng)，可實現(xiàn)恒溫條件下的連續(xù)快速擴(kuò)增。因其具有恒溫、特異性強(qiáng)、靈敏度高、性價比高和操作簡易等特點[20-22]，本研究將基于LAMP檢測技術(shù)首次開發(fā)出大鼠、小鼠鼠源性檢測試劑盒，實現(xiàn)快速準(zhǔn)確、易于操作的檢測目的，從而向廣大基層單位推廣使用，實現(xiàn)對摻假羊肉制品中大鼠、小鼠鼠源性成分的檢測，以期為肉制品質(zhì)量控制提供有效的技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羊、豬、黃牛、水牛、雞、水鴨、番鴨、鵝、家兔、田雞、狗、馬、驢的動物組織均購自本地農(nóng)貿(mào)市場或超市。大鼠、小鼠組織由暨南大學(xué)食品安全與營養(yǎng)研究院提供。將羊和2 種生鮮鼠肉分別按不同質(zhì)量比例進(jìn)行混合制備模擬樣品，用于確定混合肉制品當(dāng)中鼠源性成分的檢出限。

BstDNA聚合酶 美國NEB公司；Tris、NaCl、Na2EDTA、甜菜堿 美國Sigma公司；TaqDNA聚合酶、dNTPs 大連寶生物工程有限公司；動物組織基因組DNA提取試劑盒 廣州雙螺旋基因技術(shù)有限公司；引物均由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 儀器與設(shè)備

Dhelix-1610恒溫?zé)晒鈾z測儀 廣州雙螺旋基因技術(shù)有限公司；Synergy UV超純水系統(tǒng) 美國Millipore公司；－80 ℃超低溫冰箱 美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1 LAMP引物設(shè)計與合成

選用大鼠和小鼠的線粒體基因作為特異性基因，針對GenBank數(shù)據(jù)庫中已發(fā)表的大鼠和小鼠的線粒體基因序列，采用BLAST對相應(yīng)序列進(jìn)行同源性分析，確定大鼠環(huán)氧化酶（cyclooxygenase，COX）基因（KP244683.1）和小鼠的16S rRNA基因序列（KY018919.1）為保守序列，使用軟件Primer Explorer Version 4設(shè)計了LAMP引物。LAMP引物包括2 條外引物F3、B3，2 條內(nèi)引物FIB（F1c+F2）、BIP（B1c+B2）和2 條環(huán)引物FLP、BLP，分別如圖1所示，引物序列詳見表1。引物由上海生工生物工程有限公司合成，引物純化方式為高效液相色譜。

表1 用于檢測鼠源性成分的LAMP引物Table 1LAMP primers used for detecting murine-derived ingredients

圖1 小鼠源性成分（A）和大鼠源性成分（B）LAMP引物設(shè)計Fig.1 Primer design for LAMP of mouse-derived (A) and rat-derived (B) ingredients

1.3.2 DNA提取

樣品DNA的提取參考廣州雙螺旋基因技術(shù)有限公司動物組織基因組DNA提取試劑盒說明書進(jìn)行操作，取適量組織樣本剪碎后置于含蛋白酶K的細(xì)胞裂解液中進(jìn)行消化，后續(xù)通過對總DNA的吸附、洗滌和洗脫，最終得到純化的樣品基因組DNA。采用紫外分光光度計測定DNA濃度和純度，經(jīng)測定DNA的質(zhì)量濃度分布在200～300 ng/μL，采用TE溶液將DNA模板稀釋到100 ng/μL，于－80 ℃保存。

1.3.3 LAMP反應(yīng)體系的建立和優(yōu)化

根據(jù)文獻(xiàn)報道初步確定25 μL LAMP預(yù)反應(yīng)體系，其組成包括：1 mol/L甜菜堿、6 mmol/L MgSO4、1.6 μmol/L FIP、1.6 μmol/L BIP、0.2 μmol/L F3、0.2 μmol/L B3、0.8 μmol/L FLP、0.8 μmol/L BLP、1.6 mmol/L dNTPs、2.5 μL 10×Thermo pol Buffer、0.4 μmol/L SYTO-9、8UBstDNA聚合酶及2 μL模板。以雙蒸水為陰性對照，分別以大鼠、小鼠DNA模板為陽性對照進(jìn)行引物篩選。使用DHelix-1610恒溫?zé)晒鈾z測儀進(jìn)行，程序設(shè)置為63 ℃、45 min。對MgSO4濃度、甜菜堿濃度、dNTPs濃度、BstDNA聚合酶用量進(jìn)行反應(yīng)體系優(yōu)化，確定最佳反應(yīng)體系。

1.3.4 鼠源性LAMP特異性實驗

按照1.3.3節(jié)建立的最佳LAMP反應(yīng)體系進(jìn)行特異性實驗，以大鼠和小鼠的DNA為陽性對照，以超純水作為陰性對照，以豬、黃牛、水牛、雞、水鴨、番鴨、鵝、家兔、田雞、狗、馬、驢的DNA為特異性實驗?zāi)０澹源_定該恒溫檢測方法的特異性。

1.3.5 鼠源性LAMP靈敏度實驗

以羊肉為基底肉，分別制備大鼠、小鼠不同質(zhì)量比例制備的混合模擬樣品（50%、10%、5%、1%、0.5%、0.1%），提取各濃度模擬樣品的DNA，按照1.3.3節(jié)所述反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增，以確定該恒溫檢測方法對大鼠、小鼠的檢測靈敏度。

1.3.6 鼠源性LAMP穩(wěn)定性實驗

以大鼠、小鼠的檢出限濃度進(jìn)行10 個平行實驗，按照1.3.3節(jié)所述的反應(yīng)條件進(jìn)行LAMP檢測，以確定該恒溫檢測方法的穩(wěn)定性。

1.3.7 實際羊肉樣品鼠源性檢測

利用本研究建立的LAMP方法與real-time PCR檢測方法針對市售的羊肉制品進(jìn)行鼠源性成分檢測，對比分析檢測結(jié)果，評價并比較其實際應(yīng)用性。

2 結(jié)果與分析

2.1 LAMP反應(yīng)體系的建立和優(yōu)化

本研究主要對MgSO4濃度、甜菜堿濃度、dNTPs濃度、BstDNA聚合酶含量等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果如表2所示。根據(jù)實驗結(jié)果，最終確定25 μL LAMP體系成分如下：8 mmol/L MgSO4，0.8 mol/L甜菜堿，內(nèi)引物FIP和BIP各1.6 μmol/L，外引物F3和B3各0.2 μmol/L，環(huán)引物FLP和BLP各0.8 μmol/L，2.5 μL 10×Thermo pol Buffer，1.4 mmol/L dNTPs，10 UBstDNA聚合酶，最佳的LAMP體系反應(yīng)結(jié)果如圖2所示。

表2 LAMP體系優(yōu)化篩選Table 2Optimized LAMP system

圖2 鼠源性體系優(yōu)化擴(kuò)增曲線Fig.2 Amplification curves for murine-derived ingredients under optimized conditions

2.2 鼠源性LAMP特異性實驗結(jié)果

按照優(yōu)化的反應(yīng)體系進(jìn)行大鼠和小鼠的特異性實驗，檢測結(jié)果見圖3。結(jié)果顯示陰性對照和豬、黃牛、水牛、雞、水鴨、番鴨、鵝、家兔、田雞、狗、馬、驢等樣品DNA均未發(fā)生擴(kuò)增，僅對大鼠、小鼠樣品DNA出現(xiàn)了S型擴(kuò)增曲線，表明該恒溫檢測方法的特異性良好。

圖3 鼠源性特異性檢測結(jié)果Fig.3 Specificity analysis of LAMP for murine-derived ingredients

2.3 鼠源性LAMP靈敏度實驗結(jié)果

為確定本方法的靈敏度，以羊肉為基底肉制備大鼠、小鼠質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為50%、10%、5%、1%、0.5%、0.1%的混合肉樣品，進(jìn)行DNA提取后進(jìn)行LAMP檢測。結(jié)果表明，大鼠源性成分的檢測靈敏度為0.1%；小鼠源性成分的檢測靈敏度為0.5%，結(jié)果如圖4所示。

圖4 大鼠（A）和小鼠（B）源性成分的檢測靈敏度Fig.4 Sensitivity analysis of LAMP for rat-derived (A) and mousederived (B) ingredients

2.4 鼠源性LAMP穩(wěn)定性實驗結(jié)果

為確定該方法的檢測穩(wěn)定性，對大鼠的檢出限0.1%，小鼠的檢出限0.5%各設(shè)置10 個平行，進(jìn)行LAMP檢測，實驗結(jié)果如圖5所示。結(jié)果表明，該檢測方法具有良好的穩(wěn)定性。

圖5 鼠源性檢測方法0.1%大鼠（A）和0.5%小鼠（B）重復(fù)性Fig.5 Repeatability analysis of LAMP for rat-derived (A) and mousederived (B) ingredients

2.5 實際樣本檢測結(jié)果

用建立的LAMP檢測方法和real-time PCR檢測方法對49 份市售羊肉制品進(jìn)行檢測，如表3所示。本研究的LAMP檢測方法與real-time PCR方法特異性為100.00%，靈敏度為100.00%，總符合率為100.00%。由于目前檢測陽性樣本數(shù)較少，需后續(xù)增加樣本數(shù)判斷2 種方法的一致性。

表3 鼠源性成分的LAMP和real-time PCR法檢測結(jié)果Table 3Results of LAMP and real-time PCR for murine-derived ingredients adulterated in real samples

3 討 論

在利益的驅(qū)動下，市面上肉制品摻假行為時有發(fā)生，自從“歐洲馬肉”事件曝光以來，肉制品摻假逐漸成為社會關(guān)注的熱點問題[23-25]。隨著時間的推移和科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，肉制品鑒偽領(lǐng)域的檢驗技術(shù)日益完善。分子生物學(xué)檢測技術(shù)逐漸成為食品檢驗領(lǐng)域監(jiān)管的有效手段，基于PCR和real-time PCR的羊、牛、豬、鴨等動物源性快速檢測技術(shù)已日趨成熟，并逐步進(jìn)入國內(nèi)外檢測技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)[26-27]。然而，使用鼠肉假冒羊肉違法行為被揭露的時間較短，而且，如今LAMP技術(shù)在肉制品摻假領(lǐng)域還沒有成熟的標(biāo)準(zhǔn)可供應(yīng)用。因此，國內(nèi)外使用LAMP技術(shù)進(jìn)行鼠源性成分定性和定量檢測鮮有報道。目前，李欣南[1]使用PCR、電泳檢測、LAMP等方法對小白鼠鼠源性成分進(jìn)行檢測；Suryawan等[28]基于PCR對牛肉丸子的大鼠肉摻假進(jìn)行檢測。而基于快速、靈敏、準(zhǔn)確的LAMP技術(shù)建立的食品中大鼠和小鼠源性成分定性、定量檢測方法鮮見有報道。

本研究設(shè)計了用于肉制品中大鼠和小鼠源性成分鑒定的LAMP引物，擬建立鼠源性成分的定性檢測方法，基于鼠線粒體基因組序列設(shè)計特異性引物，與核DNA相比，線粒體DNA因為其獨特的遺傳方式和多拷貝而具有靈敏度高的特點，因此，線粒體DNA被廣泛用于國內(nèi)外飼料、生鮮及肉制品的來源追蹤和食品中動物源性成分的鑒別以及摻假肉類的定性、定量檢測[29-34]。本研究以大鼠COX基因（KP244683.1）和小鼠的16S rRNA基因（KY018919.1）作為目的基因設(shè)計LAMP引物，開發(fā)出鼠源性成分LAMP檢測體系。結(jié)果表明，本研究建立的LAMP方法具有較好的特異性，大鼠和小鼠源性成分的檢出限分別為0.1%和0.5%，對市售羊肉制品的恒溫檢測和real-time PCR方法檢測結(jié)果具有高度一致性，總符合率為100.00%。

與李欣南[1]使用PCR、電泳檢測和LAMP等對鼠源性成分進(jìn)行檢測方法相比，本研究建立的LAMP方法分別對大鼠和小鼠2 種鼠源性成分進(jìn)行研究，而李欣南[1]僅針對小白鼠展開鼠源性檢測，在實驗對象方面本實驗建立的鼠源性檢測方法覆蓋面更廣。與其實驗結(jié)果相比，本實驗在確保檢測方法特異性的前提下，將鼠源性檢測的靈敏度提高了1 個數(shù)量級；同時，通過10 個平行實驗的驗證，本研究建立的鼠源性成分檢測方法具有更高的穩(wěn)定性。因此，本研究建立的鼠源性LAMP檢測方法具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性良好、操作簡單、性價比高等優(yōu)點。補(bǔ)充和完善了鼠源性檢測的分子生物學(xué)檢測方法，適用于基層檢測單位或現(xiàn)場快速檢測，實用性強(qiáng)，具有良好的研究、推廣價值和應(yīng)用前景。